林娜;柳洋;祁晖;周凤玲;朱凡河
【摘 要】AIM:To investigate the antidepressant effect of dextromethorphan(DXM)and its mechanism. METHODS:The antidepressant effect of DXM was observed by the methods of forced swimming test,tail suspension test and open field test.The N-methyl-D-aspartate(NMDA)receptor activity in brain,and the effects of total nitric oxide syn-thases(NOS)and various types of NOS were examined by molecular biology methods.The mice pretreated with NMDA re-ceptor antagonist MK-801(MK),NMDA,NO precursor L-arginine(L-ARG),endothelial NOS(eNOS)inhibitor Nω-ni-tro-L-arginine methyl ester(L-NAME),inducible NOS(iNOS)inhibitor aminoguanidine(AG),neuronal NOS(nNOS) inhibitor 7-nitroindole(7-NI)or phosphodiesterase 5 inhibitor sildenafil were given DXM to explore the mechanism of DXM as an antidepressant.RESULTS: DXM had a dose-dependent antidepressant effect.DXM inhibited the activity of brain NMDA receptor in a dose-dependent manner, and inhibited the expression of eNOS and nNOS.MK, L-NAME and 7-Nv
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I were able to promote the antidepressant effect of DXM.NMDA,L-ARG and sildenafil were able to inhibit the antidepres-sant effect of DXM.AG did not influence the antidepressant effect of DXM.CONCLUSION:DXM has an antidepressant effect,and NMDA receptor and L-ARG-NO-cGMP signaling pathways are involved in this process.%目的:探讨右美沙芬(DXM)的抗抑郁作用及其机制.方法:利用束缚加噪声刺激法构建抑郁症小鼠模型,并采用强迫游泳实验、悬尾实验及旷场实验探索DXM的抗抑郁作用,采用分子生物学方法检测DXM对小鼠脑内N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体活性以及总一氧化氮合酶(NOS)和各类型NOS含量的影响,并研究其作用机制.另外,预先向小鼠腹腔注射NMDA受体拮抗剂MK-801(MK)、NMDA、NO前体L-精氨酸(L-ARG)、内皮型NOS(eNOS)抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、诱导型NOS(iNOS)抑制剂氨基胍(AG)、神经元型NOS (nNOS)抑制剂7-硝基吲唑(7-NI)或磷酸二酯酶5抑制剂西地那非,再给予DXM,验证DXM抗抑郁作用的机制.结果:DXM具有抗抑郁作用,且呈剂量依赖性;DXM能够抑制大脑NMDA受体活性,且呈剂量依赖性,DXM能够抑制eNOS及nNOS的表达;MK、L-NAME以及7-NI能够促进DXM的抗抑郁作用,NMDA、L-ARG以及西地那非能够抑制DXM的抗抑郁作用,AG不影响DXM的抗抑郁作用.结论:DXM具有抗抑郁作用.NMDA受体及L-ARG-NO-cGMP信号通路可能参与这一过程.【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2018(034)005
【总页数】8页(P870-877)
电解提银【关键词】抑郁症;右美沙芬;N-甲基-D-天冬氨酸;L-ARG-NO-cGMP信号通路
【作 者】林娜;柳洋;祁晖;周凤玲;朱凡河
【作者单位】济宁医学院基础医学院,山东济宁272067;青岛市第九人民医院,山东青岛266000;济宁市第一人民医院心电图室,山东济宁272002;济宁医学院基础医学院,山东济宁272067;济宁医学院基础医学院,山东济宁272067
【正文语种】中 文
【中图分类】R749.4+1;R363
抑郁症是一种非常严重的精神疾病，其高发性已经使其成为危害公共健康的主要精神疾病[
1]。目前常用的抗抑郁药由于神经适应并未达到预期效果，如三环类抗抑郁药只能对60%～70%的抑郁症患者产生疗效，因此研发有效抗抑郁症药物及探究其机制已经成为目前精神疾病研究的重点[2]。
大量研究表明谷氨酸参与抑郁症的病理生理过程[3]。对自杀的抑郁症患者解剖发现，死者额叶皮层谷氨酸水平较高[4]，并且海马内N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体亚型1活性改变[5]。有研究表明，NMDA受体拮抗剂具有抑郁症的潜在作用[6]。临床研究发现，抑制NMDA受体活性的药物能够抗抑郁[7]，长期应用药物抑郁症能够引起NMDA受体活性改变[6]。
与相类似的是镇咳剂右美沙芬(dextromethorphan，DXM)，也能够抑制NMDA受体活性[8]。目前抗抑郁效果最好的药物是，但是由于有致幻性等严重副作用，并且极易分解，只能静脉输注，所以使用较为受限[6]。由于DXM能够与NMDA受体信号相互作用[9]，并且通过5-羟胺转运体和sigma-1受体等产生作用[8]，所以DXM具有比更强的抗抑郁作用[9]。且与相比，已经上市几十年的止咳药DXM更为安全且方便。有研究表明，DXM具有抗抑郁作用，能够促进强迫游泳实验(forced swimming test，FST)中小鼠的活动[10]，而FST是评价抗抑郁药物的经典方法[11]。
NMDA受体能够激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)从而促进L-精氨酸(L-arginine, L-ARG)转化为一氧化氮(nitric oxide，NO)[12]。NO广泛参与如癫痫、神经可塑性、瘙痒、疼痛和抑郁等多种生理和病理过程[13]。研究表明NOS抑制剂能够抗抑郁[13]。NO能够调节可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)活性，鸟苷酸环化酶是一种能够催化三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)转化为环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)的酶。cGMP是中枢和外周循环中重要的第二信使，具有多种功能[14]。动物实验发现抑制NOS和sGC等蛋白的转化能够产生抗抑郁的作用[15]。尽管已经有研究表明DXM能够促进FST中小鼠的活动，但是尚不明确其作用机制[16]。
本研究拟采用不同行为实验探究DXM抗抑郁的机制，为抑郁症提供新的研究方向。煮面炉
材 料 和 方 法
1 实验动物与药物
成年雄性昆明小鼠,动物许可证编号为SCXK(鲁)2008-0002,饲养于室温(25±2) ℃，12 h循
环光照，自由饮食的环境。右美沙芬、抗抑郁药氟西汀(fluoxetine, FLU)、NMDA受体拮抗剂MK-801(MK)、NMDA受体激动剂NMDA、NO前体L-ARG、内皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)、诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)抑制剂氨基胍(aminoguanidine, AG)和磷酸二酯酶5(phosphodiesterase 5, PDE5)抑制剂西地那非(sildenafil)均溶于生理盐水(normal saline, NS)，神经元型NOS(neuronal NOS,nNOS)抑制剂7-硝基吲唑(7-nitroindole, 7-NI)溶于Tween-80。
2 实验分组及方法
2.1 抑郁小鼠模型构建 每天8:00～12:00和18:00～20:00对小鼠进行束缚加噪声刺激(25 Hz)，小鼠束缚装置为50 mL离心管，头尾分别留有直径约5 mm的圆孔，一端供小鼠呼吸，另一端便于小鼠尾巴活动，连续刺激5 d，构建抑郁小鼠模型[17]。
2.2 DXM对抑郁小鼠行为的影响 随机选取50只抑郁小鼠，分为5组,每组10只，在实验开始前分别向小鼠腹腔注射DXM (3、10和30 mg/kg)[10]、NS以及氟西汀(20 mg/kg)。给药30 min后进行动物强迫游泳实验[18]、悬尾实验(tail suspension test,TST)[16]、以及旷场实验
(open field test,OFT)[18]。实验结束后小鼠断头取脑，以ELISA法分别测定总NOS、iNOS、eNOS以及nNOS的含量。
2.3 DXM对抑郁小鼠脑NMDA受体活性的影响 随机选取40抑郁只小鼠，分为4组，每组10只，分别向小鼠腹腔注射DXM (3、10和30 mg/kg)[10]和NS，注射后30 min处死小鼠取脑，放射标记受体测定法测定NMDA受体活性，以[3H]标记的MK801为标记配体。小鼠取脑加入50 mmol/L的TAB后高速分散器离心3次，制成含NMDA受体的突触粗膜悬液，用缓冲液稀释后调整蛋白浓度为(1～2)×106 μg/L。取100 μL突触膜稀释液加入200 μL 50 mmol/L的TAB缓冲液。在非特异性结合管中加入100 μL 30 μmol/L的MK801和100 μL 50 mmol/L的TAB，每管加入10 μL [3H]-MK801。每个样品作平行双管。然后在30 ℃环境下孵育30 min。反应结束后，用4 ℃、50 mmol/L的TAB缓冲液5 mL，负压抽滤于纤维素滤膜，并用预冷的50 mmol/L的TAB缓冲液20 mL分3次洗涤。将滤膜转入计数杯，加入甲苯-Triton X-100闪烁液，于闪烁液计数仪上测定滤膜上的每分钟闪烁计数(min-1)。结合突触膜蛋白质浓度，计算[3H]-MK801的结合量(以每毫克蛋白质结合的[3H]-MK801的克分子数表示)。采用考马斯亮蓝法测定突触膜中的蛋白质浓度。计算公式为：特异性结合量[fmol/(mg protein)]=(样品总结合闪烁计数-非特异性结合闪烁计数)/总闪烁计数×每管配基的
fmol数/样品蛋白的mg数。
导电碳浆2.4 NMDA受体拮抗剂促进DXM抗抑郁效应 随机选取40只抑郁小鼠，分为4组，每组10只: (1)NS组：腹腔注射生理盐水15 min后再注射生理盐水；(2)DXM组：腹腔注射生理盐水15 min后再注射DXM (3 mg/kg)；(3)MK组：腹腔注射MK (0.05 mg/kg)[18]15 min后再注射生理盐水；(4)MK/DXM组：腹腔注射MK (0.05 mg/kg)[18]15 min后再注射DXM (3 mg/kg)。给药30 min后进行动物强迫游泳实验[18]、悬尾实验[16]及旷场实验[18]。
2.5 NMDA受体激动剂抑制DXM抗抑郁效应 随机选取40只小鼠，分为4组，每组10只：(1)NS组：腹腔注射生理盐水15 min后再注射生理盐水；(2)DXM组：腹腔注射生理盐水15 min后再注射DXM (30 mg/kg)；(3)NMDA组：腹腔注射NMDA (75 mg/kg)[16] 15 min后再注射生理盐水；(4)NMDA/DXM组：腹腔注射NMDA (75 mg/kg)[16] 15 min后再注射DXM (30 mg/kg)。给药30 min后进行动物强迫游泳实验[18]、悬尾实验[16]及旷场实验[18]。
2.6 NO前体L-精氨酸抑制DXM抗抑郁效应 随机选取40只抑郁小鼠，分为4组，每组10只：(1)NS组：腹腔注射生理盐水15 min后再注射生理盐水；(2)DXM组：腹腔注射生理盐水15 min后再注射DXM (30 mg/kg)；(3)L-ARG组：腹腔注射L-ARG (750 mg/kg)[19] 15 min后
再注射生理盐水；(4)L-ARG/DXM组：腹腔注射L-ARG (750 mg/kg)[19] 15 min后再注射DXM (30 mg/kg)。给药30 min后进行动物强迫游泳实验[18]、悬尾实验[16]及旷场实验[18]。
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