•158•中国老年学杂志2019年1月第39卷
progression of coronary calcification in hypertensive patients compared with diuretics(J].Hypertension,2001；37(6):1410-3.
5李同妙，徐金升，冯雨，等.维拉帕米通过阻断钙离子内流抑制血管平滑肌细胞钙化研究〔J〕.中国全科医学,2015；18(27)：3294-9. 6Kanbay M, Goldsmith D,Uyar ME,ef al.Magnesium in chronic kidney disease:challenges and op p ortunities[J].Blood Purif,2010；29(3): 280-92.
7齐永芬•血管钙化发病机制研究新进展〔J〕.中国动脉硬化杂志,2011；19(3)：280-1.
8Shanahan CM,Crouthamel MH,Kapustin A,el al.Arterial calcification in chronic kidney disease:key roles for calcium and phosphate [J].Circ Res,2011；109(6)：697-711.
9Chen NX,Kircelli F,O'Neill KD,et al.Verapamil inhibits calcifica
tion and matrix vesicle activity of bovine vascular smooth muscle cells [J).Kidney Int,2010；77(5)：43642.
10Sievers P,Uhlmann L,Korkmaz-Icoz S,et al.Combined treatment with olmesartan medoxomil and amlodipine besylate attenuates atherosclerotic lesion progression in a model of advanced atherosclerosis (JL Drug Des Devel Ther,2015；(9)：393542.
11彭依，黄娟，黄汉，等.结缔组织生长因子对体外培养的小鼠血管平滑肌细胞钙化的作用〔J〕.中华内分泌代谢杂志,2013；29
(1):64-8.
12Paloian NJ,Leaf EM,Giachelli CM.Osteopontin protects against high phosphate-induced nephrocalcinosis and vascular calcification〔J〕.
Kidney Int,2016；89(5)：1027-36.
[2018-06-01修回〕
(编辑曹梦园)
陈英洪道先宋俊杰范军朝庞红莉郑孝振
（河南大学第一附属医院麻醉科，河南开封475000）
〔摘要〕目的探究脊髓背角N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体NR2B亚基对耐受形成的作用。方法
将大鼠随机分为组和空白对照组，皮下注射复制耐受大鼠模型，检测两组于皮下注射前和注射第3、9天机械性刺激痛阈和热缩足潜伏期，检测注射第3、9天脊髓背角NR2B蛋白及mRNA表达。结果组注射后第3、9天机械性刺激痛阈值和热缩足潜伏期均显著大于注射前，且注射后第3天显著大于注射后第9天（P<0.05）；组注射后第3、9天NR2B亚基蛋白及mRNA表达水平均显著大于空白对照组，且注射后第3天均显著小于注射后第9天（P< 0.05）o结论诱导大鼠耐受性形成的机制可能是通过促进脊髓背角NMDA受体NR2B亚基的表达量增加。 〔关键词〕；耐受;N-甲基-D-天门冬氨酸:NR2B虚拟墓地
〔中图分类号〕R614〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005・9202（2019）014）1584）3；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2019.01.055
是新型的阿片类镇痛药，广泛应用于外科手术镇痛、肿瘤止痛等⑴。但在临床应用中会出现耐受性，严重影响其镇痛作用⑵。有研究表明,N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂可增强阿
片类药物的镇痛作用，并预防阿片耐受的产生⑶。NR2B是NMDA受体的一个亚基，研究表明NR2B亚基对NMDA受体通道的许多生物物理和药理学特性起决定作用，广泛参与学习记忆、痛觉感知和中枢敏化的形成⑷。据此推测NR2B亚基可能参与耐受的形成。本研究通过复制耐受动物模型，分析大鼠模型脊髓背角中NR2B亚基的表达情况，从分子生物学角度研究脊髓背角NMDA受体NR2B亚基对耐受形
基金项目:2015年河南省高等学校重点科研项目（No.15A320054）
通信作者：郑孝振（1976-），男，硕士，副主任医师，硕士生导师，主要从事圉术期器官保护研究。
第一作者：陈英（1981-），女，硕士，副主任医师，主要从事麻醉与疼痛研究。成的作用。
1材料与方法
1.1实验动物选择健康雄性SD大鼠40只，体重220-250g，动物购自河南大学医学实验动物中心，合格证编号为SCXK（豫）：2015401，动物购买后先适应性喂养1w。
1.2主要试剂及仪器（德国Impfstoff-werk Dessau-Tomau GmbH公司，批号160325）, NR2B兔抗鼠多克隆抗体（美国Chemicon公司批号0160221）,p-actin兔抗鼠多克隆抗体（美国Chemicon公
司01603219）,TRIzol（美国Invitrogen公司，批号015234）,RT-PCR试剂盒（美国MBI公司，批号015725），蛋白提取试剂盒（上海贝博生物科技有限公司，批号20151203）o
电子机械性痛敏仪（美国IITC公司），热痛测试仪（成都泰盟生物科技有限公司），倒置显微镜（日本奥林巴斯，型号CX23），电泳仪（北京六一仪
陈英等脊髓背角NMDA受体NR2B亚基对耐受形成的作用第1期•159•
器厂，型号DYCZ30D)，凝胶成像系统(上海培清科技有限公司，型号JS-786),Image-pro-plus6.0图像分析软件。
13模型复制及分组随机选取20只大鼠为组每天于8：00和20：00皮下注射，剂量80Rg/kg，连续注射9d。其余20只为空白对照组，每天于8：00和20：00皮下注射生理盐水。
1.4机械性刺激痛阈测定取空白对照组和组分别于皮下注射前和注射第3、9天测量每只大鼠左后掌面的机械性刺激痛阈。将待测大鼠固定于电子机械性痛敏仪透明玻璃盒罩的金属框架上，适应环境15min，使用Von Frey纤维向上刺激大鼠后爪的跖表面(内侧面和外侧面)，由轻至重增强上行力量直致大鼠后爪出现敏锐的回缩，记录电子显示屏上的机械性刺激痛阈，每只连续测量3次，测量间隔时间10min，取其3次平均值作为每只机械性刺激痛阈值⑴。
1.5热缩足潜伏期测定组和空白对照组分别于皮下注射前和注射第3、9天测量每只热缩足反射潜伏期。测量时将热痛测试仪的刺激强度设置为100档，刺激的最长时间设置为20s，每只连续测量3次，测量间隔时间5min，取其3次平均值作为每只热缩足潜伏期值⑹。
1.6脊髓背角NR2B亚基蛋白表达水平空白对照组和组分别于皮下注射第3、9天，机械性刺激痛阈和热缩足潜伏期测定之后各取10只大鼠，断头处死，取左侧的U-L5脊髓背角组织，匀浆，提取脊髓背角组织总蛋白，取40)ig的蛋白加入到上样缓冲液中水煮变性，将变性后的蛋白样品加入到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中电泳(浓缩胶100V、分离胶120V)，转膜(200mA,80min)至醋酸纤维素膜上，封闭2h, NR2B兔抗鼠多克隆抗体和p-actin兔抗鼠多克隆抗体,4七孵育过夜，二抗常温孵育60min，涂电化学发光(ECL)试剂，暗室中曝光胶片，暗室中胶片浸泡于显影液和定影液。对条带的吸光度进行扫描，通过吸光度值对比各目的蛋白的相对含量。
1.7脊髓背角NR2B mRNA表达水平空白对照组和组分别于皮下注射第3、9天，机械性刺激痛阈和热缩足潜伏期测定之后各取10只大鼠，断头处死，取左侧的U-L5脊髓背角组织，提取脊髓背角组织中的总RNA，将提取的总RNA逆转录成互补的cDNA，以cDNA为模板进行扩增。95弋变性5min,94T：变性30s,56~60t梯度退火30s, 72七延伸40s，连续反应35个循环。将反应所得的产物在琼脂糖凝胶中电泳分离，扫描分离凝胶条带的吸光度，通过对比吸光度值对比各目的mRNA的相对含量。在扩增过程中NR2B mRNA上游引物：5，-TGCACAATTACTCCTCGACG3，下游弓|物：5，-TC
CGATTCTTCTTCTGAGCC-3'，片段长度222bp；P-actin上游引物：5'-ACTGCCGCATCCTCTTCCTC-3'，下游引物：5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3'，片段长度480bp。
1.8统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行方差分析。
2结果
2.1两组耐受过程中机械性刺激痛阈、热缩足潜伏期比较两组注射前机械性刺激痛阈值、热缩足潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)；组注射后第3、9天均显著大于注射前，且注射后第3天显著大于注射后第9天，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表1。组培容器
表1两组机械性刺激痛阈、热缩足潜伏期比较(x±s,n=20)
组别-
机械性刺激痛阈(g)热缩足潜伏期(s)
注射前注射后第3天注射后第9天注射前注射后第3天注射后第9天
空白对照组42.18±4.2042.33±4.9943.01±4.12 5.99±0.72 5.78±0.67 5.74±0.69
组42.30±4.1984.19±10.23°65.42±7.101)2) 5.71±0.6811.31±0.93°9.32±1.01,)2)与注射前比较：1)P<0.05；注射后第3天比较：2)P<0.05；下表同
2.2耐受过程中脊髓背角NR2B亚基蛋且注射后第3天均显著小于注射后第9天(P<；白及mRNA表达组注射后第3、9天0.05)，见表2、图1。
NR2B亚基蛋白、mRNA表达显著大于空白对照组，
-160•中国老年学杂志2019年1月第39卷
表2耐受过程中脊髓背角NR2B亚基蛋白及
mRNA表达比较(x±5,/i=20)
组别
NR2B NR2B mRNA
注射后
第3天
注射后
第9天
注射后
第3天
注射后
第9天
阿伐那非的作用与功效空白对照组0.51±0.040.50±0.050.44±0.030.43±0.04组0.64±0.08'>0.88±0.131)2)0.66±0.05°0.79±0.06,)2)
NR2B
NR2B
NR2B mRNA
NR2B mRNA
图1耐受过程中脊髓背角NR2B
亚基蛋白及mRNA表达
3讨论
是一种新型的阿片类镇痛药，是目前临床中多种急慢性疼痛的常用药，但长时间使用后会和其他阿片类药物相似产生耐受性，将严重降低其镇痛作用[7'8\虽然近年来对阿片类药物耐受性形成的机制、防治等做了很多研究工作⑼")，但关于耐受形成的报道较少。NADM受体是一种配体门控离子型谷氨酸受体，由多个亚单位组成，其中NR2B亚基是NADM受体十分重要的一个调节亚单位。研究表明，NR2B亚基参与脊髓神经元的兴奋性突触传递及中枢敏化等过程⑴M o Tan 等⑴)应用鞘内注射NR2B-iRNA抑制脊髓背角NR2B的mRNA表达，结果减轻了外周炎症引起的疼痛反应，表明NR2B在脊髓水平伤害性信息传递及痛觉过敏的产生和维持中发挥重要作用。Ko 等发现前脑扣带回皮质(ACC)NR2B亚基在阿片类药、耐受形成及其引起的突触可塑性改变中可能起重要作用。Liaw等研究发现突触后PSD-93蛋白缺乏可减轻阿片类药、耐受和精神依赖，且NR2B表达降低。可见中枢神经系统及脊髓水平NR2B亚基在痛觉感知、信号传递和阿片类药耐受过程中起重要作用。
本研究结果说明对大鼠产生了镇痛作用，且随着连续皮下注射次数的增加，大鼠对
产生了耐受。另外，本文结果说明诱导大鼠耐受性形成的机制可能是通过促进脊髓背角NMDA受体NR2B亚基的表达量增加，为临床和新型高选择性NR2B拮抗药物的开发提供思路。
4参考文献
1杨琦琳，柴静，王坚伟.靶控输注或瑞用于妇科腹腔镜手术麻醉的临床研究〔J〕•重庆医科大学学报,2012；37
(3)：267-9.
2杨玲，杨春艳，郑斐，等.酮咯酸氨丁三醇联合用于老年患者术后镇痛的临床观察〔J〕.中国药物与临床,2014；14(12)：16734
3傅璐，郭瑞鲜，莫利求，等.脊髓c・Jun在NMDA受体NR2B亚基介导的大鼠镇痛耐受中的作用〔J〕•中国药理学通报,2011；
27(2)：248-52.微型超级电容器
4杜金，黄宇光•急性阿片耐受大鼠脊髓NMDA受体NR2A及NR2B亚基表达的改变〔J〕.中国临床药理学与学,2010；15
(1):59-65.
5刘树珍，于剑锋.神经病理性疼痛引起成年大鼠空间记忆损害和内侧前额叶的NMDA受体NR2B亚基下调表达〔J〕•中国疼痛医学杂志,2015；21(1):21-7.
6王懿春，王明德，黎祖荣，等.胫骨骨癌痛模型大鼠鞘内注射后脊髓背角N-甲基天冬氨酸受体及降钙素基因相关肽的表达〔J〕.中国组织工程研究与临床康复,2011；11(50)：93736
7耿志宇，吴新民，贾乃光，等.硬膜外分娩镇痛的效应随机、多中心研究〔J〕.中华麻醉学杂志,2006；26(11):1028-31.
8唐轶洋，张兴安.术后镇痛应用进展〔J〕.中国药房，2012；(46)：4390-3.
9刘微，郭瑞鲜，崔宇，等.脊髓星型胶质细胞的JNK介导耐受〔J〕•中国药理学通报,2010；26(11)：1435-9.
10张秀宁，文迪，徐贯杰，等.小剂量对耐受细胞§阿片受体及NMDA受体2B亚型表达的影响〔J〕.中国药理学通报,2012；28(1):70-4.
11刘微，郭瑞鲜，崔宇，等.脊髓星型胶质细胞的JNK介导耐受〔J〕•中国药理学通报,2010；26(11):1435-9.
12李永乐，谢军明，舒银银，等.瑞舒伐他汀部分恢复耐受大鼠的镇痛效能〔J〕•中国药理学通报,2013；29(1):64-8.
13Tan PH, Yang LC,Shih HC,et al.Gene knockdown with intrathecal siRNA of NMDA receptor NR2B subunit in spinal cord of rats with neuropathy following chronic ethanol consumption〔J〕.Life Sci, 2008；23(80):852-9.
14Ko SW,Wu LJ,Shum F,et al.Cingulate NMDA NR2B receptors contribute to morphine induced analgesic tolerance〔J〕.Mol Brain, 2008；17(l)：2-10.
15Li a w WJ,Zhu XJ,Yaster M,et al.Distinct expression of synaptic NR2A and NR2B in the central nervous system and impaired morphine tolerance and physical dependence in mice deficient in posts-ynaptic density-93protein〔J〕.Mol Pain,2008；27(4)：45-51.
颗粒分装机>星型下料阀[2017-11-20修回〕
(编辑滕欣航)
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