一种视神经炎的含间充质干细胞组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种视神经炎的含间充质干细胞组合物及其制备方法。

背景技术：

2.视神经炎(optic neuritis，on)泛指所有视神经的炎症性病变，是指视神经受到原发性或继发性炎症的侵袭，导致视神经产生炎症，出现诸如视力急剧下降等临床症状的一类眼部疾病的总称。视神经炎是中青年最易罹患的致盲性视神经疾病，可孤立发病，也常表现为视神经脊髓炎(neuromyelitis optica, nmo)和多发性硬化(multiple sclerosis，ms)的首发症状。
3.视神经脊髓炎（nmo）是一种累及视神经和脊髓的脱髓鞘疾病。该疾病最早的报道见于1872年，最初被认为是一种单病程发病的中枢神经系统病变。在亚洲国家，关于nmo的报道较多，仅在我国，目前就有超过30万的nmo患者。在神经眼科门诊，经典nmo相关的视神经炎(c-nmo-on)主要表现为双眼同时或相继发病，视力下降迅速，可伴有或不伴有眼痛；视功能恢复较差，通常会遗留双眼或至少一眼的严重视力障碍。
4.复发性nmo相关的视神经炎(r-nmo-on)多为单眼发病，易复发，视功能损害可部分恢复但随着发病次数增加恢复逐渐减弱。相当一部分nmo的脊髓损害发生在视力下降之后，可间隔数天、数周、数月甚至数年，最终导致截瘫、感觉及括约肌功能障碍，重者可致呼吸肌麻痹。由于复发性nmo在初期临床表现上与复发性视神经炎有许多共同特点，因此极易被误诊为后者，这一方面延误了时机，另一方面视神经炎的手段会加重nmo的病情，造成更严重的后果。
5.在很长一段时间，对nmo是独立的疾病还是多发硬化症的亚型一直存在着争议，无论是ms还是nmo，都是一种自体免疫型视神经脱髓鞘疾病。近些年的研究发现血清中水通道蛋白4(aquaporin 4 ,aqp4)自身抗体(aqp4-ab)是nmo诊断中非常特异的一项指标，在nmo诊断中有较高的敏感性(68-91％)和特异性(85-99％)。
6.目前nmo的主要包括急性期的和缓解期的。急性期的目的在于尽量减少神经系统功能障碍并促进疾病的恢复，目前主要包括大剂量甲泼尼龙冲击、血浆置换、静脉注射免疫球蛋白及环磷酰胺等；缓解期的目的主要在于减少疾病复发的次数及减轻复发的严重性，主要为免疫抑制剂的应用，包括硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯、米托蒽醌、甲氨蝶呤、利妥昔单抗等等。但是，目前现有的手段均是广泛的抑制全身的免疫系统，减轻全身自身免疫反应，患者的全身副作用较大，有引发严重感染的风险，且方法容易引发激素耐受从而导致失效。nmo患者诊断难，发病重，恢复差，致盲率高，患病后严重影响患者生活质量、给家庭及社会都带来极大的负担。据统计，我国有近800万名on患者，由于其严重缺乏安全有效的手段，临床需求未能满足，研发该疾病的新方案的需求亟待解决。
7.间充质干细胞(mscs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚
层，属于多能干细胞，mscs最初在骨髓中发现，是多能干细胞，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。另外，ifnb1是一种多向性细胞因子，具有抗病毒、免疫调节、抗肿瘤特性。能抑制t细胞繁殖和促炎性细胞因子的释放，而促进白细胞介素-10（il-10）生成，增强中枢神经系统血-脑脊液屏障的完整性，阻止自身免疫细胞进入中枢神经系统引起病理反应，从而达到目的。
8.多项研究证据证实，ifnb1可降低ms的年复发率、减少mri新发活动病灶、缓解疾病进展，且差异具有统计学意义。间充质干细胞(msc)通过表达ifnb1在视神经炎上具有非常高的应用前景。但目前尚未有将间充质干细胞应用于视神经炎的。因此，如何提供一种ifnb1-msc视神经损伤，并且对机体副作用低，见效快的含间充质干细胞组合物及其制备方法成为业界亟需解决的问题。

技术实现要素：

9.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种视神经炎的含间充质干细胞组合物及其制备方法，通过该制备方法制备得到的视神经炎的含间充质干细胞组合物，效果好，对机体副作用低，具有非常高的推广价值。
10.本发明可以通过以下技术方案来实现：根据本发明所述的一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，包括如下步骤：首先构建过表达人ifnb1基因的慢病毒载体，再通过慢病毒载体，在间充质干细胞中，过表达ifnb1，形成“ifnb1过表达的间充质干细胞”，将ifnb1修饰的间充质干细胞用于临床视神经炎的。
11.其中过表达人ifnb1基因的慢病毒载体构建如下：将人ifnb1基因( nm_002176)克隆到慢病毒载体gv416上，形成如下结构： ef1a-ifnb1-3flag-cmv-egfp-t2a-puromycin间充质干细胞的修饰如下：于10cm2培养皿中培养msc，培养基为α-mem+10%血清；生长至90%汇合度，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，重悬，计数，取1*106细胞，按moi 5:1加入慢病毒，加入10ug/ml polybrene，混匀，37度培养箱过夜；24小时后弃上清，换液，感染72小时后，或等细胞生长至90%汇合度时，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，1.5ml pbs重悬细胞，取100ul用流式细胞仪对egfp+细胞占比进行检测。其余细胞以1：3传代，并在培养基中加入2ug/ml 嘌呤霉素，在汇合度达90%左右时按需传代或冻存，在细胞收获前的常规培养中，均需加入嘌呤霉素；puromycin加药传代2次后，可再用流式检测阳性率，一般可达到90%以上阳性细胞再以嘌呤霉素(2ug/ml)进行抗性筛选5天，得到ifnb1过表达的间充质干细胞（ifnb1-msc）。ifnb1-msc 以1：3传代至t25培养瓶中，加培养基5ml进行培养，汇合度至90%时，按前文消化，以pbs 1ml重悬为细胞悬液，并计数，取2ul（含1
×
10
6 msc）用于视网膜下注射。
12.所述间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：步骤1 准备培养基：按照如下配方配置培养基，基础培养基50-70ml、植物多糖0.5-0.8mg、食品级β-环状糊精0.03-0.06份、复合氨基酸0.3-0.6mg、复合维生素0.01-0.03mg、亚硒酸钠0.0003-0.0008mg、1-4ng/ml脱细胞组织5-10μl、5-10ng/ml生长因子8-12
μl；步骤2 分离干细胞：获取人体组织，将所述人体组织经过机械剪切、胶原酶消化，0.45μm滤器过滤，分离成单细胞悬液，使用上述培养基进行培养；步骤3干细胞传代培养：将分离得到的间充质干细胞，进行传代培养，培养3-5代；优选的，步骤1中所述基础培养基为α-mem培养液。
13.优选的，步骤1中所述复合氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸按质量比1:2:1:(0.8-1.2):(0.3-0.6)混合而成。
14.优选的，步骤1中所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:(1-2):2:(0.8-1.2):(0.8-1.2)混合而成。
15.优选的，所述脱细胞组织的制备方法参见申请号为201910516288.0的中国发明专利实施例1的方法制成的脱细胞组织。
16.优选的，所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:(1-3):1混合而成。
17.优选的，步骤1中所述培养基还包括：壳聚糖季铵盐改性依那普利0.001-0.003mg。
18.优选的，所述壳聚糖季铵盐改性依那普利的制备方法，包括如下步骤：将壳聚糖季铵盐、依那普利加入到水中，在60-80℃下搅拌反应4-6小时，后旋蒸除去溶剂，得到壳聚糖季铵盐改性依那普利。
19.优选的，所述壳聚糖季铵盐、依那普利、水的质量比(3-5):0.8:(15-25)。
20.优选的，所述壳聚糖季铵盐的质均分子量为10-20万，取代度为90%。
21.优选的，步骤2中所述分离成细胞的方法为酶消化方法和机械方法相结合的方法。
22.相比于现有技术，本发明的有益效果为：本发明公开的一种视神经炎的含间充质干细胞组合物，组分中没有对人体有毒有害的成分，毒副作用小，通过间充质干细胞ifnb1表达，本发明的经修饰的间充质干细胞具有显著的有利方面。特别地，本发明的经修饰的间充质干细胞展现出显著改善视觉指标的效应，且可安全地施用给动物，而不引发免疫原性反应。因此，本发明的经修饰的间充质干细胞能够用于视神经炎，具有重大的临床价值。
附图说明
图1是采用本发明方法实验数据示意图。
具体实施方式
23.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明产品作进一步详细的说明。
24.本发明实施例中涉及到的药品及仪器均为市售；所述脱细胞组织的制备方法参见申请号为201910516288.0的中国发明专利实施例1的方法制成的脱细胞组织。
25.实施例1一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，包括如下步骤：首先构建过表达人ifnb1基因的慢病毒载体，再通过慢病毒载体，在间充质干细胞中，过表达ifnb1，形成“ifnb1过表达的间充质干细胞”，将ifnb1修饰的间充质干细胞用于临床视神经
炎的注射。
26.其中过表达人ifnb1基因的慢病毒载体构建如下：将人ifnb1基因( nm_002176)克隆到慢病毒载体gv416上，形成如下结构： ef1a-ifnb1-3flag-cmv-egfp-t2a-puromycin间充质干细胞的修饰如下：于10cm2培养皿中培养msc，培养基为α-mem+10%血清；生长至90%汇合度，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，重悬，计数，取1*106细胞，按moi 5:1加入慢病毒，加入10ug/ml polybrene，混匀，37度培养箱过夜；24小时后弃上清，换液，感染72小时后，或等细胞生长至90%汇合度时，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，1.5ml pbs重悬细胞，取100ul用流式细胞仪对egfp+细胞占比进行检测。其余细胞以1：3传代，并在培养基中加入2ug/ml 嘌呤霉素，在汇合度达90%左右时按需传代或冻存，在细胞收获前的常规培养中，均需加入嘌呤霉素；puromycin加药传代2次后，可再用流式检测阳性率，一般可达到90%以上阳性细胞再以嘌呤霉素(2ug/ml)进行抗性筛选5天，得到ifnb1过表达的间充质干细胞（ifnb1-msc）。ifnb1-msc 以1：3传代至t25培养瓶中，加培养基5ml进行培养，汇合度至90%时，按前文消化，以pbs 1ml重悬为细胞悬液，并计数，取2ul（含1
×
10
6 msc）用于视网膜下注射。
27.进一步地，所述间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：步骤1 准备培养基：按照如下配方配置培养基，基础培养基50ml、植物多糖0.5mg、食品级β-环状糊精0.03份、复合氨基酸0.3mg、复合维生素0.01mg、亚硒酸钠0.0003mg、1ng/ml脱细胞组织5μl、5ng/ml生长因子8μl；步骤2 分离干细胞：获取人体组织，将所述人体组织经过机械剪切、胶原酶消化，0.45μm滤器过滤，分离成单细胞悬液，使用上述培养基进行培养；步骤3干细胞传代培养：将分离得到的间充质干细胞，进行传代培养，培养3代；步骤1中所述基础培养基为α-mem培养液；所述植物多糖为螺旋藻多糖；所述复合氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸按质量比1:2:1:0.8:0.3混合而成；所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:1:2:0.8:0.8混合而成。
28.所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:1:1混合而成。
29.步骤1中所述培养基还包括：壳聚糖季铵盐改性依那普利0.001mg。
30.所述壳聚糖季铵盐改性依那普利的制备方法，包括如下步骤：将壳聚糖季铵盐、依那普利加入到水中，在60℃下搅拌反应4小时，后旋蒸除去溶剂，得到壳聚糖季铵盐改性依那普利；所述壳聚糖季铵盐、依那普利、水的质量比3:0.8:15；所述壳聚糖季铵盐的质均分子量为10万，取代度为90%。
31.步骤2中所述分离成细胞的方法为酶消化方法和机械方法相结合的方法。
32.实施例2一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，包括如下步骤：通过慢病毒载体，在间充质干细胞中，转入gv416空载病毒，形成“对照间充质干细胞”（ctrl-msc），将对照间充质干细胞用于临床视神经炎的注射。
33.间充质干细胞的修饰如下：于10cm2培养皿中培养msc，培养基为α-mem+10%血清；生长至90%汇合度，加入3mltryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，重悬，计数，取1*106细胞，按moi5:1加入慢病毒，加入10ug/mlpolybrene，混匀，37度培养箱过夜；24小时后弃上清，换液，感染72小时后，或等细胞生长至90%汇合度时，加入3mltryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，1.5mlpbs重悬细胞，取100ul用流式细胞仪对egfp+细胞占比进行检测。其余细胞以1：3传代，并在培养基中加入2ug/ml嘌呤霉素，在汇合度达90%左右时按需传代或冻存，在细胞收获前的常规培养中，均需加入嘌呤霉素；puromycin加药传代2次后，可再用流式检测阳性率，一般可达到90%以上阳性细胞再以嘌呤霉素(2ug/ml)进行抗性筛选5天，得到对照组间充质干细胞（ctrl-msc）。ctrl-msc以1：3传代至t25培养瓶中，加培养基5ml进行培养，汇合度至90%时，按前文消化，以pbs1ml重悬为细胞悬液，并计数，取2ul（含1
×
106msc）用于视网膜下注射。
34.进一步地，所述间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：步骤1准备培养基：按照如下配方配置培养基，基础培养基50ml、植物多糖0.5mg、食品级β-环状糊精0.03份、复合氨基酸0.3mg、复合维生素0.01mg、亚硒酸钠0.0003mg、1ng/ml脱细胞组织5μl、5ng/ml生长因子8μl；步骤2分离干细胞：获取人体组织，将所述人体组织经过机械剪切、胶原酶消化，0.45μm滤器过滤，分离成单细胞悬液，使用上述培养基进行培养；步骤3干细胞传代培养：将分离得到的间充质干细胞，进行传代培养，培养3代；步骤1中所述基础培养基为α-mem培养液；所述植物多糖为螺旋藻多糖；所述复合氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸按质量比1:2:1:0.8:0.3混合而成；所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:1:2:0.8:0.8混合而成。
35.所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:1:1混合而成。
36.步骤1中所述培养基还包括：壳聚糖季铵盐改性依那普利0.001mg。
37.所述壳聚糖季铵盐改性依那普利的制备方法，包括如下步骤：将壳聚糖季铵盐、依那普利加入到水中，在60℃下搅拌反应4小时，后旋蒸除去溶剂，得到壳聚糖季铵盐改性依那普利；所述壳聚糖季铵盐、依那普利、水的质量比3:0.8:15；所述壳聚糖季铵盐的质均分子量为10万，取代度为90%。
38.步骤2中所述分离成细胞的方法为酶消化方法和机械方法相结合的方法。
39.实施例3一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，包括如下步骤：首先构建过表达人ifnb1基因的慢病毒载体，再通过慢病毒载体，在间充质干细胞中，过表达ifnb1，形成“ifnb1过表达的间充质干细胞”，将ifnb1修饰的间充质干细胞用于临床视神经炎的注射。
40.其中过表达人ifnb1基因的慢病毒载体构建如下：将人ifnb1基因(nm_002176)克隆到慢病毒载体gv416上，形成如下结构：ef1a-ifnb1-3flag-cmv-egfp-t2a-puromycin
间充质干细胞的修饰如下：于10cm2培养皿中培养msc，培养基为α-mem+10%血清；生长至90%汇合度，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，重悬，计数，取1*106细胞，按moi 5:1加入慢病毒，加入10ug/ml polybrene，混匀，37度培养箱过夜；24小时后弃上清，换液，感染72小时后，或等细胞生长至90%汇合度时，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，1.5ml pbs重悬细胞，取100ul用流式细胞仪对egfp+细胞占比进行检测。其余细胞以1：3传代，并在培养基中加入2ug/ml 嘌呤霉素，在汇合度达90%左右时按需传代或冻存，在细胞收获前的常规培养中，均需加入嘌呤霉素；puromycin加药传代2次后，可再用流式检测阳性率，一般可达到90%以上阳性细胞再以嘌呤霉素(2ug/ml)进行抗性筛选5天，得到ifnb1过表达的间充质干细胞（ifnb1-msc）。ifnb1-msc 以1：3传代至t25培养瓶中，加培养基5ml进行培养，汇合度至90%时，按前文消化，以pbs 1ml重悬为细胞悬液，并计数，取2ul（含1
×
10
6 msc）用于视网膜下注射。
41.进一步地，所述间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：步骤1 准备培养基：按照如下配方配置培养基，基础培养基60ml、植物多糖0.65mg、食品级β-环状糊精0.045份、复合氨基酸0.45mg、复合维生素0.02mg、亚硒酸钠0.0006mg、1-4ng/ml脱细胞组织8μl、7ng/ml生长因子10μl；步骤2 分离干细胞：获取人体组织，将所述人体组织经过机械剪切、胶原酶消化，0.45μm滤器过滤，分离成单细胞悬液，使用上述培养基进行培养；步骤3干细胞传代培养：将分离得到的间充质干细胞，进行传代培养，培养4代；步骤4收集上清液：将所述间充质干细胞接种于transwell培养小室中进行培养；共培养25h后，更换无血清培养基培养24h，收集上清液而得。
42.步骤1中所述基础培养基为α-mem培养液；所述植物多糖为山药多糖；所述复合氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸按质量比1:2:1:1:0.45混合而成；所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:1.5:2:1:1混合而成。
43.所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:2:1混合而成。
44.步骤1中所述培养基还包括：壳聚糖季铵盐改性依那普利0.002mg；所述壳聚糖季铵盐改性依那普利的制备方法，包括如下步骤：将壳聚糖季铵盐、依那普利加入到水中，在70℃下搅拌反应5小时，后旋蒸除去溶剂，得到壳聚糖季铵盐改性依那普利；所述壳聚糖季铵盐、依那普利、水的质量比4:0.8:20；所述壳聚糖季铵盐的质均分子量为15万，取代度为90%。
45.步骤2中所述分离成细胞的方法为酶消化方法和机械方法相结合的方法。
46.实施例4一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，包括如下步骤：首先构建过表达人ifnb1基因的慢病毒载体，再通过慢病毒载体，在间充质干细胞中，过表达ifnb1，形成“ifnb1过表达的间充质干细胞”，将ifnb1修饰的间充质干细胞用于临床视神经炎的注射。
47.其中过表达人ifnb1基因的慢病毒载体构建如下：
将人ifnb1基因( nm_002176)克隆到慢病毒载体gv416上，形成如下结构：ef1a-ifnb1-3flag-cmv-egfp-t2a-puromycin间充质干细胞的修饰如下：于10cm2培养皿中培养msc，培养基为α-mem+10%血清；生长至90%汇合度，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，重悬，计数，取1*106细胞，按moi 5:1加入慢病毒，加入10ug/ml polybrene，混匀，37度培养箱过夜；24小时后弃上清，换液，感染72小时后，或等细胞生长至90%汇合度时，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，1.5ml pbs重悬细胞，取100ul用流式细胞仪对egfp+细胞占比进行检测。其余细胞以1：3传代，并在培养基中加入2ug/ml 嘌呤霉素，在汇合度达90%左右时按需传代或冻存，在细胞收获前的常规培养中，均需加入嘌呤霉素；puromycin加药传代2次后，可再用流式检测阳性率，一般可达到90%以上阳性细胞再以嘌呤霉素(2ug/ml)进行抗性筛选5天，得到ifnb1过表达的间充质干细胞（ifnb1-msc）。ifnb1-msc 以1：3传代至t25培养瓶中，加培养基5ml进行培养，汇合度至90%时，按前文消化，以pbs 1ml重悬为细胞悬液，并计数，取2ul（含1
×
10
6 msc）用于视网膜下注射。
48.进一步地，所述间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：步骤1 准备培养基：按照如下配方配置培养基，基础培养基65ml、植物多糖0.75mg、食品级β-环状糊精0.055份、复合氨基酸0.55mg、复合维生素0.025mg、亚硒酸钠0.0007mg、1-4ng/ml脱细胞组织9μl、9ng/ml生长因子11μl；步骤2 分离干细胞：获取人体组织，将所述人体组织经过机械剪切、胶原酶消化，0.45μm滤器过滤，分离成单细胞悬液，使用上述培养基进行培养；步骤3干细胞传代培养：将分离得到的间充质干细胞，进行传代培养，培养5代；步骤4收集上清液：将所述间充质干细胞接种于transwell培养小室中进行培养；共培养28h后，更换无血清培养基培养24h，收集上清液而得。
49.步骤1中所述基础培养基为α-mem培养液；所述植物多糖为螺旋藻多糖、银耳多糖、山药多糖、黄芪多糖、灵芝多糖按质量比1:1:3:2:2混合形成的混合物；所述复合氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸按质量比1:2:1:1.1:0.55混合而成；所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:1.8:2:1.1:1.2混合而成。
50.所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:2.5:1混合而成。
51.步骤1中所述培养基还包括：壳聚糖季铵盐改性依那普利0.0025mg；所述壳聚糖季铵盐改性依那普利的制备方法，包括如下步骤：将壳聚糖季铵盐、依那普利加入到水中，在75℃下搅拌反应5.5小时，后旋蒸除去溶剂，得到壳聚糖季铵盐改性依那普利；所述壳聚糖季铵盐、依那普利、水的质量比4.5:0.8:23；所述壳聚糖季铵盐的质均分子量为18万，取代度为90%。
52.步骤2中所述分离成细胞的方法为酶消化方法和机械方法相结合的方法。
53.实施例5一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，包括如下步骤：首先构建过表达人ifnb1基因的慢病毒载体，再通过慢病毒载体，在间充质干细胞中，过表达
ifnb1，形成“ifnb1过表达的间充质干细胞”，将ifnb1修饰的间充质干细胞用于临床视神经炎的注射。
54.其中过表达人ifnb1基因的慢病毒载体构建如下：将人ifnb1基因( nm_002176)克隆到慢病毒载体gv416上，形成如下结构： ef1a-ifnb1-3flag-cmv-egfp-t2a-puromycin间充质干细胞的修饰如下：于10cm2培养皿中培养msc，培养基为α-mem+10%血清；生长至90%汇合度，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，重悬，计数，取1*106细胞，按moi 5:1加入慢病毒，加入10ug/ml polybrene，混匀，37度培养箱过夜；24小时后弃上清，换液，感染72小时后，或等细胞生长至90%汇合度时，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，1.5ml pbs重悬细胞，取100ul用流式细胞仪对egfp+细胞占比进行检测。其余细胞以1：3传代，并在培养基中加入2ug/ml 嘌呤霉素，在汇合度达90%左右时按需传代或冻存，在细胞收获前的常规培养中，均需加入嘌呤霉素；puromycin加药传代2次后，可再用流式检测阳性率，一般可达到90%以上阳性细胞再以嘌呤霉素(2ug/ml)进行抗性筛选5天，得到ifnb1过表达的间充质干细胞（ifnb1-msc）。ifnb1-msc 以1：3传代至t25培养瓶中，加培养基5ml进行培养，汇合度至90%时，按前文消化，以pbs 1ml重悬为细胞悬液，并计数，取2ul（含1
×
10
6 msc）用于视网膜下注射。
55.进一步地，所述间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：步骤1 准备培养基：按照如下配方配置培养基，基础培养基70ml、植物多糖0.8mg、食品级β-环状糊精0.06份、复合氨基酸0.6mg、复合维生素0.03mg、亚硒酸钠0.0008mg、4ng/ml脱细胞组织10μl、10ng/ml生长因子12μl；步骤2 分离干细胞：获取人体组织，将所述人体组织经过机械剪切、胶原酶消化，0.45μm滤器过滤，分离成单细胞悬液，使用上述培养基进行培养；步骤3干细胞传代培养：将分离得到的间充质干细胞，进行传代培养，培养5代；步骤4收集上清液：将所述间充质干细胞接种于transwell培养小室中进行培养；共培养30h后，更换无血清培养基培养24h，收集上清液而得。
56.步骤1中所述基础培养基为α-mem培养液；所述植物多糖为灵芝多糖；所述复合氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸按质量比1:2:1:1.2:0.6混合而成；所述复合维生素为维生素a、维生素b2、维生素c、维生素d3、维生素e按质量比1:2:2:1.2:1.2混合而成；所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:3:1混合而成。
57.步骤1中所述培养基还包括：壳聚糖季铵盐改性依那普利0.003mg；所述壳聚糖季铵盐改性依那普利的制备方法，包括如下步骤：将壳聚糖季铵盐、依那普利加入到水中，在80℃下搅拌反应6小时，后旋蒸除去溶剂，得到壳聚糖季铵盐改性依那普利；所述壳聚糖季铵盐、依那普利、水的质量比5:0.8:25；所述壳聚糖季铵盐的质均分子量为20万，取代度为90%。
58.步骤2中所述分离成细胞的方法为酶消化方法和机械方法相结合的方法。
59.对比例1本发明提供一种视神经炎的含间充质干细胞组合物，其与实施例1基本相同，
不同的是没有添加壳聚糖季铵盐改性依那普利和亚硒酸钠。
60.对实施例1-5的视神经炎的含间充质干细胞组合物效果，利用实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，eae）模型进行在体验证，验证方法如下：1．抗原乳剂的制备：冰浴条件下将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（mog35-55）溶于pbs溶液（5mg/ml）。
61.与含有结核杆菌素6mg/ml的完全弗氏佐剂（cfa）等量混合，使用注射器反复推拉成油包水的乳剂，即得抗原乳剂。
62.2．实验模型的建立：10周龄c57bl/6小鼠140只，雌雄各半，随机分为7组，每组20只。分别对应实施例1-5及对比例1-2，适应性饲养两天后，除空白组外，其余小鼠均于小鼠背部分四点皮下注射抗原乳剂共0.2ml进行免疫，免疫48小时后再腹腔注射浓度为6mg/ml的结核杆菌素0.2ml，空白组均皮下注射pbs溶液。
63.3.方法在免疫后第10天，将106个msc（2μl）进行视网膜下注射。
64.4. 疗效评定标准细胞移植后第5天，也就是免疫后第15天检测闪光视觉诱发电位（flash visual evoked potential，f-vep），记录p1和p2波的潜伏期和振幅：在小鼠免疫后0，1w，2w，3w，4w，5w，各组小鼠行f-vep检查，记录p2波的潜伏期与振幅。将小鼠置于无声暗室中20分钟，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定，记录电极置于小鼠枕骨粗隆处，电极与身体长轴平行。参考电极置于口腔黏膜处，接地电极置于尾部。检查一眼，另一只眼用不透明眼罩完全遮盖。刺激频率为1.4hz，刺激次数为64次。每只眼记录稳定波形3次。
65.结果显示，相比于空白组，模型组（eae）动物的p2潜伏期（p2 latency）增长（38.1
±
5.4ms vs 61.00
±
8.1ms，p=0.003），表明eae小鼠视神经受损，建模成功。
66.与eae组相比，移植对照组msc（ctrl-msc，实施例2）的动物，p1波潜伏期和振幅、p2波潜伏期和振幅，有所改善，但均无显著差异。表明ctrl-msc的效果有限。
67.与eae组相比，移植ifnb1-msc（实施例1、3、4、5）的动物，p1波潜伏期和p2波潜伏期明显缩短，表明移植ifnb1-msc改善了视神经损伤，减轻了视神经的炎症。其中实施例1效果最优。
68.该两项指标已接近于空白组相应结果，从而证明了ifnb1-msc具有优异的视神经炎效果，可应用于视神经炎的。
69.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：首先构建过表达人ifnb1基因的慢病毒载体，再通过慢病毒载体，在间充质干细胞中，过表达ifnb1，形成“ifnb1过表达的间充质干细胞”，将ifnb1过表达的间充质干细胞用于临床视神经炎的注射。2.根据权利要求1所述的一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，其特征在于，所述过表达人ifnb1基因的慢病毒载体构建如下：将人ifnb1基因( nm_002176)克隆到慢病毒载体gv416上，形成如下结构： ef1a-ifnb1-3flag-cmv-egfp-t2a-puromycin。3.根据权利要求1所述的一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，其特征在于，所述过表达的间充质干细胞的制备如下：于10cm2培养皿中培养msc，培养基为α-mem+10%血清；生长至90%汇合度，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，重悬，计数，取1*106细胞，按moi 5:1加入慢病毒，加入10ug/ml polybrene，混匀，37度培养箱过夜；24小时后弃上清，换液，感染72小时后，或等细胞生长至90%汇合度时，加入3ml tryple消化5min，加入3ml完全培养基吹打瓶底，转移至15ml离心管，300g离心5min，1.5ml pbs重悬细胞，取100ul用流式细胞仪对egfp+细胞占比进行检测，其余细胞以1：3传代，并在培养基中加入2ug/ml 嘌呤霉素，在汇合度达90%左右时按需传代或冻存，在细胞收获前的常规培养中，均需加入嘌呤霉素；puromycin加药传代2次后，可再用流式检测阳性率，一般可达到90%以上阳性细胞再以嘌呤霉素(2ug/ml)进行抗性筛选5天，得到ifnb1过表达的间充质干细胞（ifnb1-msc），ifnb1-msc 以1：3传代至t25培养瓶中，加培养基5ml进行培养，汇合度至90%时，按前文消化，以pbs 1ml重悬为细胞悬液，并计数，取2ul（含1
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6 msc）用于视网膜下注射。4.根据权利要求1所述的人ifnb1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法，其特征在于，间充质干细胞为羊膜、牙髓、骨髓、脂肪等组织来源的间充质干细胞。5.根据权利要求1所述的人ifnb1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法，其特征在于，所述ifnb1过表达的间充质干细胞（ifnb1-msc）通过过表达人ifnb1基因的慢病毒与间充质干细胞在细胞培养条件下充分感染得到。6.根据权利要求1所述的一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：步骤1 准备培养基：按照如下配方配置培养基，基础培养基50-70ml、植物多糖0.5-0.8mg、食品级β-环状糊精0.03-0.06份、复合氨基酸0.3-0.6mg、复合维生素0.01-0.03mg、亚硒酸钠0.0003-0.0008mg、1-4ng/ml脱细胞组织5-10μl、5-10ng/ml生长因子8-12μl；步骤2 分离干细胞：获取人体组织，将所述人体组织经过机械剪切、胶原酶消化，0.45μm滤器过滤，分离成单细胞悬液，使用上述培养基进行培养；步骤3干细胞传代培养：将分离得到的间充质干细胞，进行传代培养，培养3-5代。7.根据权利要求6所述的一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，其特征在于，步骤1中所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、和胰岛素生长因子-1（igf-1）按质量比1:1:1混合而成。8.根据权利要求6所述的一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，其特征在于，所述生长因子为血小板衍生生长因子-bb、血小板衍生生长因子ab、和胰岛素生
长因子-1（igf-1）按质量比1:(1-3):1混合而成。9.根据权利要求6所述的一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1中准备培养基，还包括壳聚糖季铵盐改性依那普利的制备方法，包括如下步骤：将壳聚糖季铵盐、依那普利加入到水中，在60-80℃下搅拌反应4-6小时，后旋蒸除去溶剂，得到壳聚糖季铵盐改性依那普利。10.一种采用权利要求1-9任一项所述的一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法制成的视神经炎的含间充质干细胞组合物。

技术总结

本发明提供一种视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：首先构建过表达人IFNB1基因的慢病毒载体，再通过慢病毒载体，在间充质干细胞中，过表达IFNB1，形成“IFNB1过表达的间充质干细胞”，将IFNB1过表达的间充质干细胞用于临床视神经炎的注射。本发明还公开了一种采用所述视神经炎的含间充质干细胞组合物的制备方法制成的视神经炎的含间充质干细胞组合物。本发明公开的视神经炎的含间充质干细胞组合物效果好，对机体副作用低，具有良好的效果。有良好的效果。