一、目的要求
1. 了解荧光光谱分析基本原理
中医管理系统
3. 了解日本岛津RF—5301型荧光分光光度计的构造及其使用方法。
二、基本原理
当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了具有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发态，分子在较高能级的激发态时，它可能处于激发态中各种振动状态的一种。然而由于分子通过与溶剂分子，同类分子或其他分子的碰撞，而失去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级，在此过程中并不发光。但当分子从激发态的最低振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级降落至基态的各个不同的振动能级时，则以光的形式辐射出能量，所辐射出的光即是荧光。 当固定激发光波长和强度不变，而记录荧光强度随波长变化的曲线，称为荧光光谱。若固定荧光最强处的荧光波长不变而改变激发光波长，记录荧光强度随激发光波长变化的曲线，称为激发光谱。
asmk当荧光物质分子受到光辐射后，不但产生荧光而且还将产生荧光分析中所不希望的瑞利散射光及其倍频光谱。对于液体样品不但会产生瑞利散射光及其倍频光谱，还同时会产生拉曼光谱，这些光谱构成了对荧光光谱的干扰，在荧光光谱的测定和荧光物质的定量分析中必须给以识别和消除。
维生素Ｂ２（核黄素）在一定波长的激发光照射下会发射出绿荧光，根据荧光强度在一定浓度范围内与荧光物质浓度成正比，用标准曲线法对样品进行定量分析，在线性良好的情况下，也可用浓度直接读出被测样品的浓度。一般而言，所选择的激发光要有利于排除瑞利光谱和拉曼光谱的干扰。在此基础上再选择激发灵敏度高的激发波长及合适的滤光片，对于维生素Ｂ２可选择270nm的激发光，使用UV-35滤光片。
三、仪器与试剂
１、仪器
日本岛津RF—5301荧光分光光度计，液体样品架，UV—35截止型滤光片
50ml容量瓶8个，100ml烧杯2个，洗瓶一个，玻璃棒二根，去离子水。
２、试剂
A．１％的醋酸溶液
B．维生素Ｂ２标准溶液：称出10.0mg维生素Ｂ２先溶于少量
的１％的醋酸溶液，然后转移到1000ml容量瓶中，用１％的醋酸
溶液定容至刻度，摇匀，至阴暗处保存。此液为10.0μg/ml．
四、实验步骤
1、日本岛津RF-5301型荧光分光光度计的使用方法见操作步骤。
2、配制系列标准溶液
取5个50ml容量瓶，分别加入1.00, 2.00, 3.00, 4.00 , 5.00ml 浓度为10.0μg/ml的标准溶液用水稀释至刻度，摇匀。
3.标准曲线的绘制
把各标准样品置于试样架内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，设置好仪器的工作条件，用去离子水做空白，分别扫
描空白和标样的荧光光谱，根据峰高和浓度绘制标准曲线。
4.未知试样的测定
准确称出一定量的未知试样于小烧杯中，用水溶解并定容至100ml容量瓶内，摇匀，用测定标准曲线相同的条件，测其
荧光强度。
五、数据处理
根据试液的荧光强度，从标准曲线上查出试液中维生素Ｂ２的浓度，按下列公式计算维生素Ｂ２的含量：
维生素Ｂ２的含量＝Ｃ╳１００／Ｇ（μｇ／ｇ）
C－试液中维生素Ｂ２的浓度（从标准曲线上查出，单位是μg/ml）。
发烟筒G－未知试样的重量，单位是克（ｇ）。
100－试样被稀释的体积。
六、问题与讨论管线电伴热
1. 为什么要使用滤光片？
2.在荧光测量时，为什么激发光的入射线与接受荧光的检测器不在一
直线上，而应成一定角度？
穿孔管
3.荧光相对强度与哪些因素有关？为什么？
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