scFv-Fc 抗体的制备及其酶联免疫吸附检测方法的建立 徐泽华，孙铁强，韩振宇，刘肖，张樱樱①，范龙兴②，白家磊，宁保安*
(军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，天津300050)
摘要：目的制备㊁鉴定高灵敏度㊁可溶性的(Diazepam ,DZP )scFv-Fc 抗体㊂方法通过传统的基因工程技术
构建scFv-Fc 重组质粒并转染FreeStyleTM 293F 细胞进行表达和纯化；采用间接竞争ELISA 的方法对抗体性质进行评价㊂结果制备了抗scFv-Fc 抗体；与亲代单克隆抗体相比，其灵敏度提高了约2倍；与6种结构类似物基本上没有明显的交叉反应，表明该抗体具有良好的特异性；与经典的高效液相谱法相比，与其测定的加标回收率和相对标准偏差具有良好的一致性㊂结论本研究中成功获得了高灵敏度和可溶性scFv-Fc 抗体，为后续建立基于基因工程抗体的DZP 快速免疫检测法提供了参考㊂ 关键词: ; 纳米抗体; ELISA ; 融和表达 中图分类号:R971 文献标志码:A 文章编号:1001-5248(2020)10-0073-06
基金项目：国家自然科学基金项目(No.2197060405)
作者简介：徐泽华(1990-)，男，硕士研究生㊂从事基于酵母展示环境危害物抗体制备及检测研究工作㊂
①内蒙古医科大学公共卫生学院;②福州大学化学学院*通信作者
(Diazepam,DZP)又名，属苯二氮卓类药物，临床上常用于失眠㊁惊厥㊁焦虑等精神疾病；小剂量短期服用通常是安全有效的，但大剂量服用可抑制中枢神经㊁抑制呼吸㊁引起中毒，长期摄入也会形成依赖性或成瘾性〔1〕㊂虽然，我国已明令禁止在饲料和动物饮用水中使用DZP 等苯二氮卓类药物，但是，由于经济利益㊁其高效的药物作用等原因,DZP 的滥用现象依然严重㊂某些企业为追求高额利润，在动物饮用水㊁饲料中非法添加DZP，致使动物性食品中存在DZP 残留;DZP 与酒精等抑制类物质共同食用会提高DZP 的镇静作用，提高药物吸收率〔2〕；一些不法分子向酒水中添加大剂量的DZP 等药物，进行性暴力〔3〕㊁抢劫〔4〕等犯罪活动，给社会的健康发展造成了极为不利的影响㊂因此，针对DZP 残留的快速㊁灵敏的检测是有十分必要的，对有效监控DZP 残留和维护社会治安具有积极的意义〔5-6〕㊂目前DZP 的检测方法主要为谱技术,
如高效液相谱法〔7〕
㊁气相谱法
〔8〕
㊁谱-质谱联
用法
〔9,10〕
等㊂其所需仪器昂贵，需配有专业操作人
员，样品前处理繁琐，难以得到普及，不适用于基层和现场的检测㊂而免疫技术因其灵敏性好㊁特异性高㊁成本低㊁检测快速等优势一直备受亲睐，其中酶联免疫吸附试验(enzyme -linked immunosorbent as⁃say,ELISA)是最为常用的检测方法㊂由于某些精神
类药物的抗体很难制备，目前针对DZP 的单克隆抗体和多克隆抗体的研究并不多见，在一定程度上限制了ELISA 技术的广泛应用㊂而利用基因工程技术制备的重组抗体，既保留了天然抗体的生物学活性和特异性，又具有经济性好的优势，成为研究者的关注热点㊂1988年由Bird 和Huston 最先成功获得的单链抗体(single chain fragment viarable,scFv)，是一种利用基因工程技术将传统抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段约5~25个氨基酸连接肽首尾拼接而成的重组抗体〔11〕㊂因其具有分子量小㊁特异性高㊁易改造等优势，被广泛应用于生物技术和临床医药等领域〔11〕㊂将scFv 基因与人IgG1Fc 融合，在体外能组装形成scFv-Fc 二聚体,
可有效改善单链抗体的倾向聚集性，提高其稳定性和亲和性，具有更明显的优势〔12〕㊂近年来已有
许多研究构建了不同目标物的scFv-Fc 抗体〔13-14〕，提供了一种简便㊁快速㊁灵敏的技术途径㊂本研究中，我们从分泌特异性DZP 抗体的鼠杂交瘤细胞系中获得了抗DZP scFv 基因，将其与人IgG1Fc 结构域融合表达于HEK293F 细胞，利用SDS -PAGE 蛋白电泳表征纯化后的可溶性scFv-Fc 抗体，采用间接竞争ELISA 法验证其活性，为后续建立基于基因工程抗体的DZP 快速免疫检测法提供了参考㊂
1 材料
1.1 主要试剂
Supercoiled DNA Ladder Marker㊁限
制性内切酶EcoR I㊁Ncol I 购于大连Takara 公司;QuantScript RT Kit(KR103)购于北京天根生物技术公司;FreeStyleTM 293Expression Medium 购于美国
Invitrogen公司㊂所用试剂均为分析纯㊂本研究中所有引物(见表)及测序均由华大基因完成㊂农夫山泉矿泉水㊁青岛啤酒(罐装)实际样品购于当地超市㊂1.2 主要仪器 ClassⅡBSC超净台，新加坡ESCO 公司;PCR仪，德国Eppendorf公司；凝胶成像系统，北京六一仪器厂;WondaSep MCX固相萃取柱(6ml) ，日本GL TM Sciences公司;HiTrap rProtein A FF谱柱(5ml)，美国GE Healthcare公司㊂
1.3 质粒与菌株 分泌特异性DZP抗体的鼠杂交瘤细胞由本实验室前期筛选获得；大肠杆菌DH5α感
受态细胞购于北京天根生物技术公司;Free⁃StyleTM293F细胞购于美国Invitrogen公司㊂pMD TM 18-T质粒购于大连Takara公司；含有人IgG1Fc的pFUSE_hIgG1e5_Fc2质粒购于美国Invitrogen公司㊂2 方法
2.1 scFv的构建
2.1.1 鼠杂交瘤细胞中总mRNA的提取及cDNA 的合成 采用TRIZOL法提取杂交瘤细胞中的总mRNA，将保存于-80℃冰箱中的鼠杂交瘤细胞取出，待样品溶解后，加入1mL的Trizol试剂，室温静置5min,；加入200μL的氯仿，振荡15s，室温静置2min;4℃以12000g离心15min，取上清至另一新的1.5mL离心管中；加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min;4℃以12000g离心10min，弃上清；加入1mL75%乙醇洗涤沉淀;4℃以7500g 离心，弃上清，使离心后的白沉淀晾干1-2min，加入20μL DEPC处理水，缓慢溶解白沉淀，获得总mRNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测㊂以提取的总mRNA为反转录模板，按照天根QuantScript RT Kit cDNA试剂盒说明书合成cDNA㊂
2.1.2 minscFv抗体引物的设计及VH与VL基因片段的扩增设计的轻链和重链的上下游引物见表1㊂引物由华大基因合成㊂以cDNA为模板，按照表1中的上下游引物，扩增VH和VL基因片段,PCR 反应体系见表2:PCR反应条件:95℃预变性3min；进行30个循环:95℃变性10s,55℃退火30s,72℃延伸30s；最后72℃彻底延伸10min,4℃保存㊂PCR产物经凝胶电泳后按照Omega凝胶回收试剂盒说明书进行回收
㊂将回收的VH和VL基因片段分别连接到pMD TM18-T质粒中并外送测序，将测序结果上传至IMGT网站进行分析㊂
2.1.3 scFv基因片段的构建及pMD TM18-T-scFv 重组质粒的构建 将回收的VH和VL基因利用连接肽(Gly4Ser)3，通过SOE-PCR获得scFv基因片
段,SOE-PCR引物设计见表3㊂经凝胶电泳后将目
的基因片段回收㊂用EcoR I和Ncol I限制性内切
酶对回收的scFv基因片段和pMD TM18-T质粒分别进行双酶切，通过pMDTM18-T Vector Cloning Kit试
剂盒将pMD TM18-T质粒与scFv基因片段连接㊂重组质粒转化DH5α感受态细胞，将其均匀涂布于含Amp的LB固体培养基上,37℃恒温培养箱中过夜培养，次日挑取单菌落外送测序鉴定㊂
2.2 scFv-Fc抗体的表达和纯化
2.2.1 pFUSE_hIgG1e5_Fc2-scFv重组质粒的构建
及转化DH5α感受态细胞 将scFv基因片段连入
含有人IgG1Fc的pFUSE_hIgG1e5_Fc2质粒中，构
建pFUSE_hIgG1e5_Fc2-scFv重组质粒，将其转化
大肠杆菌DH5α感受态细胞㊂具体操作同2.1.3㊂2.2.2 FreeStyleTM293F细胞培养及重组质粒转染细胞培养：将FreeStyleTM293F细胞用新鲜的Free⁃StyleTM293Expression Medium表达培养基于37℃㊁8%CO2细胞培养箱中悬浮培养，至细胞汇合度约为90%即可转染；重组质粒转染：将30μg上述pFUSE_hIgG1e5_Fc2-scFv重组质粒转染培养好的FreeStyleTM293F细胞㊂将转瓶中的转染细胞在37℃㊁8%CO2培养箱中以125rpm/min的转速振荡培养72h㊂收集上清液，并将沉淀细胞按照上述相同步骤再次培养72h，收集并合并FreeStyle293F 细胞上清液㊂
表1 扩增轻链和重链上下游引物Primers Sequences
DH-F GTGCAGCTTCAGGAGTC
DH-R TGAGGAGACTGTGAGAG
DL-F GATGTTTTGATGACCCAACT
DL-R AGATTCATGTCTAGAACACT
表2 扩增VH和VL基因片段PCR反应成分体积(μL) 2×PhantaTM Master Mix25
上游引物1
下游引物1 cDNA模板5 ddH2O18
总体积50
表3 SOE-PCR上下游引物Primers Sequences
DSc-F CCGGAATTCCGGGTGCAGCTTCAGGAGTC DSc-R GCCATGGGAGATTCATGTCTAGAACACT
2.2.3 表达抗体的纯化和SDS-PAGE蛋白电泳检测 将细胞上清液于4℃3000g离心20min，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤㊂采用Protein A亲和谱纯化表达的抗DZP scFv抗体㊂纯化后的抗体通过SDS-PAGE电泳在非还原状态(不含强还原剂
β-二巯基乙醇)和还原状态(含β-二巯基乙醇)下分析检测㊂凝胶经考马斯亮蓝染液振荡染1h 后，更换脱液，脱3h左右，直至背景颜为无，最后拍照分析㊂
2.3 抗scFv-Fc抗体竞争活性的鉴定
2.3.1 间接竞争酶联免疫吸附试验(ELISA) 采用间接竞争ELISA对纯化后的scFv-Fc抗体进行竞争活性的鉴定㊂预先通过棋盘滴定的方法确定包被原和纯化后抗体的最佳浓度㊂绘制抗DZP scFv-Fv抗体的间接竞争ELISA标准曲线㊂同时用上述同样的方法绘制DZP单克隆抗体的标准曲线作为对比㊂2.3.2 优化甲醇浓度 为进一步优化实验方法，采用单一变量法，用不同浓度(5%,10%,20%, 50%)甲醇的PBS缓冲液将DZP标准品稀释成100㊁50㊁12.500㊁6.250㊁3.125㊁1.563㊁0.391㊁0.098㊁0.024μg/L，其余步骤与5.3.1中间接竞争ELISA 法相同，测定不同浓度甲醇的PBS缓冲液对间接竞争ELISA反应的影响㊂
2.4 抗scFv-Fc抗体特异性的鉴定 本实验选取6种的结构类似物进行交叉反应率的测定㊂具体实验步骤同上述间接竞争ELISA测定步骤，绘制相应标准曲线，按照下式计算CR值，其不同在于将换为相应结构类似物㊂交叉反应率的计算公式为:CR(%)=〔IC50(DZP)/IC50 (DZP的结构类似物)〕×100㊂
2.5 加标回收实验
2.5.1 加标方法 将200μL不同浓度(1000,500, 100ng/mL)的DZP标准品分别添加到1.8mL的农夫山泉矿泉水和青岛啤酒(罐装)样品中，使每种样品的DZP终浓度分别为100,50,10ng/mL；加入6mL提取液(正己烷∶二氯甲烷=7∶3)，轻摇数秒，加盖密封，置于垂直混旋仪上萃取1h，重复上述操作一次㊂
合并两次上层提取液后,3000×g离心5min㊂2.5.2 MCX SPE萃取柱萃取 先用3mL甲醇,3mL 水活化萃取柱，随后取8mL上述离心上清液加入萃取柱，用3mL水㊁3mL10%甲醇水溶液淋洗萃取柱，真空抽干，用5mL5%氨水甲醇溶液洗脱目标物㊂收集洗脱液，于50℃下氮气吹干，残留物用2mL无水甲醇溶解，用于上述间接竞争ELISA方法检测㊂每种样品共测定3个浓度，每个浓度同日内平行测定3次㊂同时用高效液相谱法〔15〕进行比对㊂参数设定：谱柱:
C18柱(250mm×4.0mm,5μm)；柱温：室温；流动相：乙腈+乙酸铵溶液=45+55；流速:1.00mL/min；检测器：紫外检测器；检测波长:254nm；进样量:20μL㊂
3 结果
3.1 scFv基因的构建
3.1.1 鼠杂交瘤细胞中总mRNA的提取及cDNA 第一条链的合成 分泌特异性DZP抗体的鼠杂交瘤细胞由本实验室前期筛选获得〔16〕，采用TRIZOL 法提取鼠杂交瘤细胞中总mRNA，试验过程中所用的水均为DEPC处理过的无菌水㊂最后离心后可在离心管底部看见少量白沉淀，即为提取的总mR⁃NA㊂按照天根Quant Script RT Kit cDNA第一条链合成试剂盒合成cDNA第一条链，合成后的cDNA 于-80℃冰箱中短暂储存㊂
3.1.2 VH和VL基因片段的扩增 从分泌抗DZP 单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞中获取的VH和VL基因，按照设计的引物分别进行PCR扩增，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果(图1)，其结果显示扩增的VH和VL基因长度分别为350bp和330bp，与预期值相符㊂将PCR产物在凝胶上出现的相应条带切胶并回收，分别连接到pMD TM18-T质粒中外送测序，将测序结果上传至IMGT网站(bi. v/i)进行分析比对㊂
图1 VH和VL基因片段的琼脂糖凝胶电泳结果 M:Supercoiled DNA Ladder DNA Marker;1㊁2:VH基因片段;3㊁4:VL基因片段
3.1.3 scFv基因片段的构建 获得的VH和VL 基因通过一段人工合成的寡核苷酸连接肽(Linker)将其拼接在一起，获得scFv基因㊂目前最常用的
Linker是由4个甘氨酸(Gly)和1个丝氨酸(Ser)重复3次排列组合形成的15肽序列〔17〕，即(Gly4Ser) 3㊂1.5%琼脂糖凝胶电泳结果(图2)显示scFv基因片段长度约为720bp，与预期值相符㊂将其连接到pMD TM18-T质粒外送测序并用于后续研究㊂3.2 scFv-Fc抗体的表达和纯化 本研究选用人胚肾细胞(HEK293F)作为scFv-Fc抗体表达细胞，该真核细胞凭借其在瞬时转化系统中易转染㊁高表达㊁允许蛋白质正确折叠和相关翻译后修饰等优势〔18〕被广泛使用㊂虽然单链抗体具有许多优势，但其也存在某些缺陷，如scFv为单价抗体，降低了抗原亲和性和稳定性；此外,scFv片段常需要某种形式的 标
签”用于纯化和检测〔19〕㊂而scFv片段与人IgG Fc片段的CH2和CH3区段融合可有效解决这些问题〔19〕，为保证两者之间具有足够柔性和灵活性的空间构象，通过Fc段铰链区的二硫键形成scFv-Fc二聚体，可增强其稳定性和与特异性抗原的亲和力，并保持了Fc片段的功能㊂
本研究将获得的特异性抗DZP scFv基因与pFUSE_hIgG1e5_Fc2质粒中人IgG1Fc结构域融合，构建了pFUSE_hIgG1e5_Fc2-scFv载体，表达于HEK293F细胞株，形成scFv-Fc双价抗体㊂鉴于表达的scFv-Fc抗体中存在Fc结构域，采用Protein A亲和谱〔20〕纯化上清液中的抗体㊂纯化后的抗体通过SDS-PAGE电泳在非还原和还原状态下检测分析，如图3所示㊂非还原状态下的电泳显示~55kDa的条带，在非还原状态下显示scFv-Fc二聚体的分子量约为110kDa，表明Fc段铰链区的S-S键构建成功，表达形成了可溶性的抗DZP scFv-Fc双价抗体㊂
3.3 抗scFv-Fc抗体竞争活性的鉴定
3.3.1 甲醇浓度的优化 DZP具有强亲油性(正辛醇/水分配系数的对数值为2.82)，其水溶性较差(50mg/L)㊂因此，本实验所用缓冲液需要含有水溶性助溶剂㊂甲醇因其低毒㊁高效㊁经济等优势成为水溶性助溶剂的首选，优化甲醇的浓度以提高反应灵敏度㊂如图4可知，甲醇浓度在5%~20%时, IC50范围为1.80ng/mL~3.36ng/mL，当甲醇浓度为50%时，已严重影响了反应的灵敏度㊂5%甲醇测定的IC50值最小，但考虑到DZP的有效溶解情况，本研究选择了10%甲醇的PBS缓冲液作为间接竞争ELISA的最佳缓冲液，并用于后续检测
㊂
图2 scFv基因片段的琼脂糖凝胶电泳结果 M:LD2000bp DNA Marker;1㊁2:scFv 基因片段
图3 纯化产物的SDS-PAGE检测结果
1：非还原状态下的抗DZP scFv-Fc抗体;2：还原状态下的抗DZP scFv-Fc抗体;M：蛋白分子质量标准
Marker
图4 甲醇浓度对ELISA间接竞争反应的影响
3.3.2 抗DZP scFv-Fc 抗体和单克隆抗体的间接竞争ELISA 取包被原㊁scFv-Fc 抗体和单克隆抗体进行棋盘滴定，确定最佳的包被抗原DZP -OVA 浓度为2μg /mL(稀释400倍)，最佳抗体稀释倍数为3000倍㊂按照最佳的包被原浓度及抗体稀释倍数，绘制抗DZP scFv-Fc 抗体㊁DZP 单克隆抗体的标准曲线㊂由图5可知,scFv -Fc 抗体的检测线性范围为0.33±0.046~10.23±0.70ng /mL,IC50为2.24±0.14ng /mL，单克隆抗体的半抑制浓度(IC50)为
4.94±0.33ng /mL㊂通过基因工程技术从杂交瘤细胞中获取scFv 基因，制备成的scFv 抗体与亲代单克隆抗体具有相似的亲和力㊂因Fc 结构域的存在将scFv 抗体转变成scFv-Fc 二聚体，使其灵敏度提高了约2倍，其原因可能在于二聚体结构有助于增强抗体的亲和力和特异性㊂
3.4 抗scFv -Fc 抗体特异性的鉴定 交叉反应率(cross-reactivity,CR)是表示测定方法中抗体特异性的重要指标，目标物结构类似物的CR 值越低，说明该抗体的特异性越强㊂6种的结构类似物(奥沙西泮㊁㊁硝西泮㊁㊁舒乐㊁己烯雌酚)与的交叉反应率如表4所示，本研究获得的抗DZP scFv-Fc 抗体与DZP 的交叉反应率为100%，而与其它结构类似物基本上没有明显的交叉反应，说明本抗体对有良好的特异性
㊂
图5 抗DZP scFv-Fc 抗体和亲代单克隆抗体的
间接竞争ELISA 标准曲线
表4 结构类似物的交叉反应率
DZP analogues
Cross-reactivity(%)
Diazepam 100Oxazepam 3.40Flunidazepam 2017Nitrazepam 0.23Lorazepam 0.04Eatazolam -Diethylstilbestrol -
3.5 加标回收实验 实际样品的基质通常会干扰免
疫测定，出现假阴性结果㊂为降低样品基质的影响，采用MCX SPE 的方法提取矿泉水和啤酒中的DZP㊂同时为进一步验证ELISA 法测定结果的可靠性，同时用HPLC 法测定不同浓度加标样品中的DZP㊂每种样品的加标终浓度分别为100,50,10ng /mL，每个浓度同日内平行测定3次㊂从表5可知,ELISA 法测定3个加标水平的平均回收率为80.1%~104.6%，相对标准偏差RSD 为1.3%~6.7%㊂HPLC 法测定的平均回收率为
84.3%~105.4,RSD 为3.1%~5.2%㊂表明这两种方法的测定结果具有较好的一致性，同时基于抗DZP scFv-Fc 抗体的ELISA 法检测DZP 具有良好的准确性
和精密度㊂
表5 实际样品的加标回收率(n =3)
Sample Spiked DZP (ng/mL)
Average recovery(%)±CV(%)(n =3)ELISA
HPLC
water 10083.8±3.389.2±4.65090.7±1.3103.6±3.110104.6±4.2105.4±4.7beer
100
80.1±3.484.3±4.35088.5±5.2104.2±3.6
1096.0±6.795.8±5.24 讨论
scFv-Fc 抗体结构简单且保留了原抗体的结合位点及抗原亲和活力，因其易于进行分子改造，可避免传统单克隆抗体和多克隆抗体繁琐的制备程序，并节约了经济成本㊂本研究通过传统的基因工程技术成功制备出了抗scFv-Fc 抗体㊂采用间接竞争ELISA 的方法对抗体性质进行了评价，与亲代单克隆抗体相比，其灵敏度提高了约2倍；与6种结构类似物基本上没有明显的交叉反应，表明该抗体具有良好的特异性；与经典的高效液相谱法相比，与其测定的加标回收率和相对标准偏差具有良好的一致性，表明基于抗DZP scFv -Fc 抗体的ELISA 法检测DZP 具有良好的准确性和精密
度㊂抗的特异性scFv-Fc 抗体的制备为研究食品中残留的ELISA 方法奠定了基础，具有一定的应用前景㊂
scFv 基因还可通过重组DNA 技术与不同基因片段融合，经表达后得到不同功能蛋白拼接在一起而形成的新型结构域蛋白，其具有双方蛋白的活性，用于灵敏㊁快速地分析检测目标抗原〔21〕㊂此外，随着基因工程技术的不断发展，纳米抗体以其更加独特的优势现已逐渐成为研究者的另一关注热㊂
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议