ISSN 1002-4956 CN11-2034/T
实验技术与管理
Experimental Technology and Management
第38卷第3期202丨年3月
Vol.38 No.3 Mar. 2021
DOI: 10.ki.sjg.2021.03.010一种由piggyBac转座子介导高效构建 盛哲津、王亮2，周斌\李利妹4
(1.同济大学生命科学与技术学院，上海200092; 2.上海市浦东新区中医医院，上海200120; 3.同济大学附属东方医院血管外科，上海200120; 4.同济大学附属东方医院医学转化平台，上海200120)
摘要：构建稳定细胞株的关键是如何提高外源目的基因插人基因组的效率。piggyBac转座子（简称PB )通过“切离-粘贴”的机制实现在基因组上的转座，其本质是在基因组的不同位点间进行插入。利用P B转座 子高效插人基因组的特性，并通过改造该转座系统，即分别在P B转座酶的3'端和5'端加入核定位信号肽，然后在人源胚胎肾293细胞系中评价改造后的P B转座子介导获得稳定细胞株的能力。结果表明，野生型PBase组的克隆形成率是对照组的6.7倍,3'NLSPBase组比野生型PBase组再提高1.3倍。利用人宫颈癌HeLa 细胞进一步验证上述结果。可见，经改造后的P B转座子能够提高外源目的基因插入基因组的效率，实现高效构建稳定细胞株。
关键词：piggyBac转座子；稳定细胞株；基因组整合 中图分类号：Q2 文献标识码：A 文章编号：1002-4956(2021)03-0045-06
Strategy of efficient construction of stable cell lines
mediated by piggyBac transposon
SHENG Zhejin',WANG Liang2,ZHOU Bin3,LI Limei4
(1. School of Life Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, China; 2. Shanghai Pudong New Area Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200120, China; 3. Department of Vascular Surgery, East Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200120, China; 4. Research Center for Translational Medicine, East Hospital, Tongji University Scho
ol of Medicine, Shanghai 200120, China)
Abstract: Insertion of foreign target genes into the genome is crucial to the construction of stable cell lines. piggyBac transposon (PB) can translocate between different loci in the genome via the “Cut-and-paste” mechanism. The nature of this process is the insertion of foreign target genes into different sites in the genome. A nuclear localization signal peptide is added to the 3' or 5' ends of PB transposase respectively to modify the PB transposon system. The efficiency of the construction of stable cell lines mediated by PB transposon is evaluated in the human embryonic kidney 293 cell line. The results demonstrate that the clone formation rate of wild-type PBase group is 6.7 times that of the control group, and that of B'NLSPBase group is 1.3 times higher than that of wild-type PBase group. The above results are verified in HeLa cells. The modified PB transposon can improve the efficiency of exogenous target gene insertion into the genome, which will help to achieve high efficient construction of stable cell lines.
Key words: piggyBac transposon; stable cell lines; genome integration
细胞转染技术是现代生命科学领域的一项基本技 术，广泛应用于生命科学的基础研究，推动了诊断、方面的发展1M]。根据外源目的D N A在细胞内表 达的时间长短，转染技术可以分为瞬时转染和稳定转
收稿日期：2020-04-29
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（ 1507219059)；同济大学第15朗实验教改项目（2000104092 )
作者简介：盛哲津（1982—男，上海.硕士，实验师，研究方向为实验室管理与模式生物技术，**********************。
通信作者：李利妹（1980—），女，浙江温岭，博士，助理研究员，主要从事表皮干细胞的功能研究，136****************。
引文格式：盛竹津，王亮，周斌，等.一种由piggyBac转座子介导高效构建稳定细胞株的策略[J].实验技术与管理,2021, 38(3): 45-50. Cite this article: SHENG Z J, WANG L, ZHOU B, et al. Strategy of efficient construction of stable cell lines mediated by piggyBac transposon[J], Experimental Technology and Management, 2021, 38(3): 45-50. (in Chinese)
46实验技术与管理
染2种方法[5]。瞬时转染技术得到的外源基因表达系 统存在表达不稳定、时间短等缺点，严重影响了目的 基因的功能研究或应用[5]。因此，为了提高基因表达 的稳定性，往往需要构建含有目的基因的
稳定细胞株，但其操作步骤繁琐，周期长，至少需要3个月才能完 成+7]。而且经常不能筛选到特别满意的稳定细胞株，主要有两大原因，一是在不借助任何“外力”的情况 下，外源DNA插人靶细胞基因组的效率低[7]。另一个 原因是导人细胞内的D N A由于整合到基因组上的“沉 默区”引起导入的目的基因被“沉默”不能表达[7]。因此，需要尽可能多地筛选到不同插人位点的细胞稳 转株（系），然后通过功能鉴定获取最佳的细胞株。
转座子，又名转座因子是一类在基因组内可以“跳 跃、移动”的遗传因子。与Sleeping Beauty转座子、丁〇丨2转座子相比，piggyBac转座子（简称P B转座子）具有更广泛的转座活性，较少地依赖于宿主因子即可 实现高效转座[8_13]。P B转座子的转座功能是由一个含 有594个氨基酸残基的转座酶PBase介导的[8]。该酶 是在细胞质中表达成熟，而PBase介导的转座在细胞 核内进行。核膜将真核细胞内的空间分隔为细胞核和 细胞质2个不同的区域。核膜是不连续的，其上存在 很多小孔。这些小孔结构本质上为核孔复合物（nuclear pore complex,N PC)，是细胞质和细胞核之间来回运 输物质的通道[14_15]〇因此，PBase转座酶需要“穿越”核孔才能到达其发挥作用的部位——细胞核。核定位 信号（nuclear localization signal,NLS)是蛋白质的一 个结构域，能够与核转运蛋白相互作用，将蛋白通过 核孔运进细胞核。第一个被确认的NLS来自病毒SV40 的丁抗原（SV40-NLS)。研究证实SV40-N L S具有很 强的核定位能力，不少科学家尝试开发它的应用，譬 如用于构建人工合成的分子生物转运工具等[^18]。
因此，本文在PB ase蛋白的N-端或C-端分別加 人N L S来改造P B转座子以提高转座酶的基因组整合 效率。N-端加人NLS的PB转座酶命名为yNLSPBase，C-端加人N L S的P B转座酶命名为SWLSPBase。本文 先构建各种PBase转座酶和含有PBase转座酶识别位 点的转基因载体，然后导人细胞系中考察这些转座酶 的基因整合效率。 1实验材料与方法
1.1 细胞系
人源胚胎肾细胞293、HeLa细胞购自中国科学院 生物化学与细胞生物学研究所细胞库。上述2种细胞 系培养于5%C02,37 °C的细胞培养箱中，培养基为 添加有青霉素和链霉素及10%小牛血清的高糖DMEM 细胞培养液。1.2常用试剂
各种限制性内切酶、Taq酶和T4DNA连接酶购自 TaKaRa或 NEB公司。DNA marker (Hind III digest,
1kb ladder,DL2000 )购自TaKaRa公司。凝胶回收 试剂盒、质粒小S抽提试剂盒购自天根生化科技（北 京）有限公司。质粒大抽试剂盒购自Qiagen公司。细 胞转染试剂Lipofectam ine购自美国英杰生命技术有 限公司（invitrogen)。EDTA,SDS，DMSO等常规化 学试剂主要购自国药集团化学试剂有限公司。
引物合成和测序由北京擎科新业生物技术有限公 司兒成。
1.3载体构建
转座子编码的转座酶识别转座子的反向末端重复 序列（inverted terminal repeats,ITR)并催化该兀件 的转位。因此，需要构建2个载体：一个是携带有目 的基因的P B转座子识别载体，另一个为表达P B转座 酶的辅助载体。
1)含有P B转座酶iR别位点的neo基因筛选载体。
先从PB3XP3G F P a f载体中分别扩增得到
p ig g y B ac转座酶识别的左右臂-piggyB acL和piggyBacR，然后分别用Xba I和Mlu I限制性内切酶 酶切PiggyBac L，用Not I和Kpn I限制性内切酶酶 切piggyBacR。再通过PC R从pcDNA3.1上扩增得到 新霉素抗性基因（neomycin resistance gene,NeoR)
的表达框（包括 SV40 promoter、SV40 o ri、NeoR/KanR、SV40 poly(A)signal)，通过 Mlu I 和Not I 限制性内切 酶酶切。然后将上述3个片段共同通过T4 D N A连接 酶组装到pGL3-Basic载体的Xba丨和Kpn I之间，得到 含有PB转座酶识别位点的neo基因筛选载体PB(NeoR)。
有关引物如下：
FpBac L：5rGGATCTAGAgacaatgttcagtgcagagac3';
RpBac L：5"AAGACGCGTgtcgacctgcaggcatgcaag3'；
FpBac R:5’AATGGTACCcgatgttttgttttgacggac3’；
RpBac R：5'AATGCGGCCGCgatcaaaacgcaaatcgacg3r;
FNeo：5'AAGACGCGTgtgtgtcagttagggtgtgg3'；
RNeo：5(AATGCGGCCGCtacagacatgataagatacattg3,,
2) pcDNA3.1-PBase、pcDNA3.1-5，NLSPBase 及 pcDNAS.U N LSPB aseS种PB转座酶表达载体的构建。
使用fPBase和rPBase引物通过高保真PCR技术 从MA help pig A3质粒上得到P B转座酶的cDNA,
然后经限制性内切酶Hind III和Xho 1酶切，再使用 T4 DNA连接酶将PB转座酶的cDNA插人到pcDNA3.1载体的Hind11丨和Xho I酶切位点之间，得到了由CMV 驱动的PB转座酶表达载体pcDNA3.1-PBase。SV40-NLS 是由pro-lys-lys-lys-arg-lys-val7个氨基酸组成的短肽，编码其的核苷酸为CCAAAAAAGAAACGTAAAGTT 。
盛哲津，等：一种由p i g g y B a c转座子介导高效构建稳定细胞株的策略47
fPBase-NLS引物的5'端含有编码SV40-N LS的7个短 肽的21个核苷酸。直接通过fPBase-NLS引物和rPBase 引物，以M A helppigA3质粒为模板，用高保真PCR 酶扩增得到5"NLSPBase。再同上操作，得到pcDNA3.1- 5'NLSPBase载体。同法，利用引物fP B ase和引物 rPBase-NLS得到 pcDNA3.1- 3，NLSPBase载体。
有关引物如下：
fPBase:5'AGCAAGCTTatgggatgttctttagacgatg3’；
rPBase：5,ATGCTCGAGtcagaaacaactttggcac3,；
fPBase-NLS：5(AGCAAGCTTatgCCAAAAAAG-AAACGTAAAGTT g gatgttctttagacgatg3,;
rPBase-NLS： 51ATGCTCGAGtcaCCAAAAAAGA-AACGTAAAGTT g aaacaactttggcac3"
1.4 Lipofectamine转染细胞
转染前一天，用胰酶消化处理细胞并进行细胞计 数铺板。转染前1h将细胞培养基更换成无血清和无
抗性的培养基。分别使用OPTI-MEM5〇n L培养基稀 释3 pL Lipofectamine2000转染试剂和载体室温放置 5 m in之后，将上述已稀释的Lipofectamine2000转染 试剂和载体混合，室温放置30 m in后加入需要转染的 细胞孔板中。6 h后将细胞培养基更换成含有10% FBS 血清和双抗性的完全培养基。
细胞共分为 4 组:pcDNA3.1/P B(NeoR);pcDNA3.1-PBase/PB (NeoR)；pcDNAS.l-S'NLSPBase/PB (NeoR)和pcDNA3.1-3'NLSPBase/PB (NeoR)。
载体混合物的制备：3种C M V启动子驱动的PB 转座酶表达载体分别和环形质粒形式的PB (NeoR)在质量比1 : 2的比例下混合，分别得到pcDNA3.1- PBase/PB(NeoR),pcDNA3.1-5'NLSPBase/PB(NeoR)和 pcDNA3.1-3，NLSPBase/PB (N eoR) 3 种 PB 转座 酶介导的转座系统。
1.5稳定细胞株的筛选
本系统用于筛选稳定细胞株的真核细胞抗性基因 为NeoR，选用G418进行抗性筛选。细胞转染3天后，将上述转染完毕的细胞用胰酶消化转移到10 c m细胞培养皿中，然后加人G418至终浓度为300 ng/mL。
1.6亚甲基蓝显细胞克隆
称取2 g亚甲基蓝定溶于100 m L无水乙醇中，转 移人滴瓶中，贴标签备用。用4%多聚甲醛固定细胞
10 min，弃液，蒸溜水洗漆2 m in，每次2次。力口人上述配制的新鲜亚甲基蓝染料染10 min (可以根据染 结果调整染时间）。用蒸馏水或自然水充分洗涤，进行观察和拍照。
2实验原理和流程
P B转座子长2 476 bp，两端含有末端反向重复序列ITR，中间包含一个约2.1k b大小的转座酶的编码 框（图1(a))。piggyBac转座子可以在基因组中切出并 转座到新的位置。其转座的本质就是在基因组的不同 位点间进行插人。P B转座子的T.作原理为：P B转座 酶（PBase)通过识别自身的左侧P B左臂（PBL)和右侧P B右臂（PB R)并完全切离其左右臂；然后通 过其3'O H末端攻击靶D N A序列的TTA A位点的5'末端实现转座（图1(b))。因此，P B转座系统需要2 部分元件组成。一个部分是表达P B转座酶的元件，另一部分为携带有目的基因的P B转座子识别位点。
.PBR PBL,
PBase
(a) PB转座子的结构
目的基因
(b) PB转座子的转座原理
图1P B转座子的结构与转座原理
利用P B转座系统获取稳定转染细胞株的实验流 程：先分别构建含有PB ase编码框的表达载体（称辅 助载体）和含有PBase识别位点的携带有目的基因的 识别载体；然后将上述载体以环形的状态、1: 1的形 式一起转染人真核细胞中；最后通过抗药基因的筛选 获得稳转细胞系。
3 实验结果与讨论
3.1构建P B转座子介导的载体系统
本系统用于筛选稳转细胞株的抗性基因为NeoR，因此在新霉素抗性基因表达框的端和3'端分别插入 PBase识别的左右臂，获得筛选载体PB(NeoR)(图2(a))〇P B转座子的转座是通过其编码的转座酶PBase 来实现的。再直接通过PC R从质粒MA help pig A3上 扩增得到P B转座酶PBase，组装人pcDNA3.1载体得 到由广谱表达的启动子C M V驱动的P B ase表达系统 (图 2(b))。
因为PB转座子介导的转座事件在细胞核内进行，但是PBase转座酶在细胞质内合成与成熟研究表明 只有含有核定位序列的蛋白质才能够迅速、高效地通 过核孔转运人核。SV40-N L S是第一个被确定的核定 位信号，而且与其他多种蛋白的核定位信号相比，其 核定位的能力更强
。譬如有研究证实与视网膜母
48
实验技术与管理
辅助载体(b)定量分析经G418筛选获得的克隆数
辅助载体
(c)相对于pcDNA3.1/PB(NeoR )组的克隆形成情况
图3
在293细胞中比较P B 转座子介导的克隆形成能力
根据“稳定转染细胞的效率（又名转化率）=阳 性克隆+ (转染的细胞量x 转染效率）X 100%”这个公 式计算，分别得到各种PBase 在293细胞中的转化率。 在没有P B ase 存在下的转化率为0.031%，野生型
PBase 、3'NLSPBase 和5'NLSPBase 介导的转化效率分 别为 0.212%、0.274%和 0.244%。
为了研究通过piggyB ac 转座子获取的细胞株遗
PB (NeoK)
SV40启动子SV4〇早期p 〇iy(A )信号
(a )识别载体
pcDNA3.1-CMV-PBase
TC CMVpromoter : PBase
pcDNA3.1-CMV-3fNLSPBase
BGHpA
TC CMVpromoter S PBase
\ BGHpA
SV40-NLS
_r r
>
CMVpromoter
PBase
\ BGHpA
SV40-NLS (b )辅助载体
注：T C ：终止密码子；B G H p A ：牛生长激素poly(A)信号。
图2 P B 转座子介导的用于构建稳定转染细胞株的系统
细胞瘤（retinoblastoma , RB )抑癌因子的核定位信号 (简称RB-NLS )相比，SV 40-NLS 将与其相连的目的 蛋白导人细胞核内的量和导人速度方面都远高于RB - NLS [19]。核定位信号可以位于蛋内的C 端，也可以位
pcDNA3.1
PBase
于N 端。为了提高PBase 定位到细胞核内的量和速率，将SV 40-N L S 装入到PBase 的N -端或C -端，分别得到
N -端和C -端含有核定位信号肽的PB 转座酶5'NLSPBase 、3，NLSPBase (图 2(b ) )〇
3.2克隆形成的比较及克隆稳定性的评价3.2.1 转染293细胞
选用293细胞评价本研究改造的PBase 转座酶的 转座效率。首先将实验分为4组，一组为对照组 pcDNA 3.1/PB ( NeoR )，另夕卜3组为实验组口。0财3.1- PBase /PB ( NeoR )，pcDNA 3.1-5'NLSPBase /PB ( NeoR ) 和 pcDNAS .U N LSPBase/PB ( NeoR )〇 然后分别将上 述载体通过Lipofectamine 2000转染到接种有1.5x l 05
细胞量的人源胚胎肾细胞293细胞中。通过G 418筛 选获得稳定表达抗性基因的稳定细胞株，通过亚甲基 蓝染显示细胞克隆（见图3(a ))。统计结果显示PB 转座子介导的克隆形成与对照组比存在极为显著的差 异，其介导的克隆形成能力是野生型的6.7倍，表明 piggyBac 转座子可以显著提高基因组插人的效率(图3(c ))。 再通过分析发现与野生型PB ase 相比，5'NLSPBase 和 3'NLSPBase 均能提高基因组插人的效率，3'NLSPBase 提 高得更多，达1.3倍（图3(c ))。
3mSPBase
5f NLSPBase
(a)亚甲蓝染敁承G418筛选获得的克隆情况
淼
遡栊嬖
思
盛哲津，等：一种由p i g g y B a c转座子介导高效构建稳定细胞株的策略49
传代10代。结果表明由piggyBac介导构建的293稳 定细胞株能够长期稳定表达目的基因。该结果与之前 在小鼠中的结果一致U L等人在转基因小鼠模型 中，证实插人小鼠基因组中的piggyBac转座子识别载 体，在没有PBase转座酶的存在下，传代20代以上均 没有发现piggyBac转座子识别载体发生转座移位，一直稳定存在最初的基因组位点上[|°]。本研究中的含有 P B ase转座酶的辅助载体是以环形的状态转染进人 293细胞的，因此含有PB ase转座酶的辅助载体在随 后的传代中会逐渐丢失，但是插人基因组的piggyBac 转座子识别载体会一直稳定存在基因组中。
3.2.2 转染H eLa细胞
因为不同细胞的转染效率及基因组整合能力是不 同的。为了验证P B转座系统在非293细胞中的基因组整合效率，选用了另一株细胞系H eL a作进一步研 究比较。同人源胚胎肾细胞293细胞中的设计和操作。计数统计经亚甲基蓝染的细胞克隆，结果表明在细 胞系HeLa中PB转座子介导的克隆形成与对
照组比也 存在极为显著的差异，其介导的克隆形成能力是野生 型的24.7倍（图4(a))。与野生型PBase相比，5"NLSPBase 和3'NLSPBase均能提高基因组插人的效率，S^NLSPBase 提高得更多，达1.6倍（图4(b))。根据转化率公式计 算，分别得到各种PBase在HeLa细胞中的转化率。在 没有PBase存在下的转化率为0.015%，野生型PBase、3W LSPB ase和VN LSPBase介导的转化效率分別为 0.375%、0.593%和 0.391%。选取 3 个 PBase介导的稳 转株分别连续传代8代，结果表明由piggyBac介导构 建的HeLa稳定细胞株能够长期稳定表达目的基因。
辅助载体辅助载体
(a)定M分析经G418筛选获得的克隆数（b)相对于pC DNA3.1/PB(Ne〇R)组的克隆形成情况
图4在H e L a细胞中比较P B转座子介导的克隆形成能力
3.2.3 基因整合方式对比
按照目的基因插人基因组内的整合方式分为随机 整合和定点整合两种[M I。转座子、慢病毒等介导的基 因整合方式属于随机整合。慢病毒介导的基因整合效 率可高达10%，但是操作者若不注意会存在被病毒感 染的风险，因此需要在特殊的实验环境下进行[21]。另外，慢病毒介导的基因整合除了构建相应载体外，还需要 包装病毒获取高滴度的病毒等，操作繁琐，容易失败：归巢内切酶I-Scel、TALE
N和CRISPR/Cas9等基 因编辑系统介导的基因整合方式属于定点整合。归巢 内切酶I-S c e l的整合效率约0.02%~2%，但是归巢内 切酶在基因组上可用的切割位点比较少，只能在有限 位点进行定点整合，极大限制了其应用[M]。TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑丁.具可以提高效率达0.5%〜 20%[M]。但是，所有定点整合的基因编辑工具均存在 一个问题：定点插人的载体需要根据插人位点进行专 门的载体设计与构建，意味着每进行一个新的位点定 向整合就需要重新构建一次“打靶”载体，这给操作
者带来不少的T.作量，而且有时候某位点的整合效率 特别低或整合人该位点的外源基因表达效率低。而PB 转座子介导的基因整合编辑工具效率高，而且只需构 建一种载体即可；还可以通过反向PCR(reverse-PCR )技术鉴定出插人位点由此可见，P B介导构建稳 转细胞株的策略具有效率高、操作简单、位点易鉴定 等优势。
4结语
借助P B转座子的“插人”基因组D N A的特性，建立了一种由PB介导的高效获取稳定细胞系的技术，该技术的特征是将插入到基因内的转座事件通过筛选 获得一个稳定细胞株。通过人胚胎肾293细胞和人宫 颈癌H eLa细胞两种细胞系，证实野生型PB ase能够 显著提高细胞的克隆形成率，加人核定位信号肽后基 因组整合的效率更高，其中3'N LSPBase的转座效率 最高。连续传代实验表明由piggyBac介导构建的稳定 细胞株能够长期稳定表达目的基因。通过改造P B转毅
鲤
职
驾
思
友
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