张英;朱颖;姚拓
【摘 要】为了获得优良的菌株资源,采用溶磷圈法、钼锑抗比法和Spot、S2比法,定性、定量测定了分离自三叶草根际10株溶磷细菌的溶磷和分泌植物生长激素（IAA）的能力,结果表明：各菌株在PKO无机磷培养液中的有效磷增量在106.63～666.01mg/L（P〈0.05）,菌株ls1-3有效磷增量最大;各菌株在蒙金娜有机磷培养液中的有效磷增量在0.32～58.42mg/L（P〈0.05）,菌株lhs11有效磷增量最大;有些菌株既能溶解无机磷,又能溶解有机磷,如菌株lhs4和lhs11;有些菌株能溶解无机磷,但无溶解有机磷的能力,如菌株ls1-3和ls1-5。除3个菌株（ls2-11、ls2-16和ls3-2）外,其他菌株都能分泌IAA,分泌量在0.36～20.39mg/L（P〈0.05）,菌株ls3-5分泌能力最强（20.39μg/mL）。菌株ls1-3、ls2-3、ls3-5、lhs4和lhs11有望作为研制微生物肥料的优良菌株。%In order to obtain excellent strains resources,ten strains of phosphorus-solubilizing bacteria were isolated and screened from rihizosphere of Trifolium repens and Trifolium pratense The ability of solubilizing phosphate and producing IAA were tested.The ability of solubilizing phosphate were determined by the method of dissolved ph osphorus circle and molybdenum-bule,and the ability of producing IAA were determined based on Spot and S2 colorimetry methool.The results showed that,for inorganic phosphorus culture solution,strain had the increment of effective-phosphorus from 106.63 mg/L to 536.2 mg/L(P0.05),and ls1-3 strains showed the highest increment of effective-phosphorus.For organic phosphorus culture solution,strain had the increment of effective-phosphorus from 0.32 mg/L to 58.42 mg/L(P0.05),lhs11 strain had the highest effective-phosphorus increment.Lhs4 and lhs11 strains not only can dissolve abio-phosphorus,but also can dissolve organic phosphorus,while some strains can dissolved inorganic phosphorus,but can not dissolve organic phosphorus.Some strain had the ability of producing IAA,and quantity of product is between 0.36~20.39 mg/L(P0.05),and ls3~5 strain had the strongest capability of producing IAA.Ls1-3,ls2-3,ls3-5,lhs11 and lhs4 strains are expected to develop as the microbiological fertilizer.
【期刊名称】《草原与草坪》
【年(卷),期】2012(032)005
【总页数】5页(P36-40)
【关键词】溶磷菌;溶磷能力;IAA
【作 者】张英;朱颖;姚拓
【作者单位】甘肃农业大学草业学院／草业生态系统教育部重点实验室／甘肃省草业工程实验室／中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃兰州730070／青海大学农牧学院草业科学系,青海西宁810016;甘肃农业大学草业学院／草业生态系统教育部重点实验室／甘肃省草业工程实验室／中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃兰州730070;甘肃农业大学草业学院／草业生态系统教育部重点实验室／甘肃省草业工程实验室／中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃兰州730070
【正文语种】中 文
【中图分类】S144.5
植物根际中存在着大量的能够溶解磷矿粉的微生物［1－4］。长期以来，国内外的学者对
溶磷微生物的种类和能力开展了广泛的研究［5－11］，取得了一些开拓性成果，但多年的实践结果也表明，溶磷微生物的实际应用效果并不理想，很多菌株在实验室条件下表现出明显溶磷能力，但应用到田间溶磷效果却不明显，难以适应不同的生长环境［12，13］。所以，从特定地区和植物根际筛选溶磷、适应能力强，兼有其他优良特性的菌株有着重要的意义。
白三叶（Trifolium repens）和红三叶（Trifolium pratense）为豆科车轴草属［14］多年生牧草。红三叶是优质的多年生牧草，同时又是良好的蜜源植物及绿肥植物，是优良的园林绿化及水土保持植物资源，植株中富含异黄酮类化合物，具有抗肿瘤（胃癌、乳腺癌），防治骨质疏松、改善更年期综合症等作用［15］，是一种极有开发前景的天然药材，是园林绿化、水土保持和水源涵养地建设的优良草本植物。
目前，有关车轴草属植物根际溶磷菌的研究报道较少。对分离自白三叶和红三叶草根际的10株溶磷细菌的溶磷能力和分泌IAA能力进行测定，筛选优良菌株，为溶磷菌菌株特性的研究和菌肥的开发利用提供优良用菌株资源。
1 材料和方法
1.1 菌株来源
供试菌株为前期［16－18］在兰州、定西、酒泉地区白三叶和红三叶根际分离、筛选获得的10株溶磷细菌（菌株编号为：ls1－3、ls1－5、ls2－11、ls2－12、ls2－16、ls3－1、ls3－2、ls3－5、lhs11、lhs4）。
1.2 培养基及试剂
LB培养基［19］，PKO 无机磷培养基［20］，蒙金娜有机磷培养基［17］，King培养基［21］，Spot比液和 S2比液［22］。
1.3 溶磷能力测定
1.3.1 定性测定 将LB斜面培养基中保存的菌株，活化后点接种于PKO无机磷和蒙金娜有机磷平板上，28℃恒温培养，第10d后观察、测量各菌株形成的溶磷圈大小。根据溶磷圈直径（D）和菌落直径（d）比值（D/d）初步确定菌株溶磷能力。
1.3.2 定量测定 将50mL液体PKO无机磷（或蒙金娜有机磷）培养基装入150mL三角瓶，12
1℃灭菌20min，冷却后，分别将500μL各待测菌株的菌悬液（108 cfu/mL）接种至三角瓶中。每菌株设3个重复，以基础培养基（不接种菌株）为对照。将上述三角瓶置于28℃、160r/min摇床培养10d后，用酸度计测定培养液pH值。将培养液10 000r/min、4℃离心15 min，取上清液，用钼锑抗比法测定有效磷增量（扣除对照后的值（mg/L））［23］。
1.4 分泌IAA能力测定
1.4.1 定性测定 将50mL液体King培养基装于150mL三角瓶，121℃灭菌20min，冷却后分别将500 μL各待测菌株菌悬液（108 cfu/mL）接种至三角瓶中。每菌株设3个重复，以基础培养基（不接种菌株）为对照。将三角瓶置于28℃，129r/min摇床培养12d，取菌株悬浮液50μL滴置于白陶瓷板上，同时加50 μL Spot比液，对照只在比液中加50μL 10mg/L的植物生长激素（3－吲哚乙酸）；将白瓷板置室温下，在15min内观察其颜变化，颜变粉红者表示能分泌IAA，颜越深表示分泌IAA能力越强；不变为阴性，即不分泌IAA［22］。
1.4.2 定量测定 取上述培养12d的培养液10 000 r/min、4℃离心10min，取上清液1mL加1mL S2比液在黑暗下静置30min，迅速用分光光度计比（波长530nm）［22］，标准
曲线用纯3－吲哚乙酸制作。
1.5 数据分析
数据处理采用SPSS 16.0软件，多重比较采用LSD法。
2 结果与分析
2.1 溶磷能力的测定
溶磷圈直径（D）、菌落生长直径（d）及比值（D/d）是表征溶磷菌相对溶磷能力的一个指标，可初步确定溶磷菌株的溶磷效果。对各菌株在PKO无机磷和蒙金娜有机磷固体培养基培养10d，用溶磷圈法分别测定了各菌株的D/d值（图1、2），结果表明，各菌株的D/d值大小差异显著（P＜0.05）。在PKO无机磷培养基上，各菌株的D/d值在1.07～1.52，其中，菌株ls1－3的 D/d 值 （1.52）最大，菌 株ls3－2 的 D/d 值（1.07）最小，菌株ls2－11，ls2－16和ls3－2的溶磷透明圈不明显。在蒙金娜有机磷培养基上，各菌株的D/d值在1.00～1.45，其中，菌株lhs1的D/d值（1.45）最大，菌株ls1－3、ls1－5、ls2－11、ls2－13的 D/d值为1，并发现各菌株无明显的溶磷透明圈。
图1 菌株在PKO培养基上的D/dFig.1 D/d vallue in PKO culture medium by phosphate－solub ilizing bacteria
图1 菌株在蒙金娜培养基上的D/dFig.2 D/d vallue in Mongoli culture medium by phosphate－solub ilizing bacteria
溶磷圈法只能定性测定各菌株溶磷能力。为进一步测定各菌株溶磷性强弱，将各菌株单独接种于PKO无机磷和蒙金娜有机磷液体培养基中10d后测定各上清液有效磷增量，结果各菌株都具有溶解磷酸三钙能力（表1），并且差异显著（P＜0.01）。各菌株在PKO无机磷培养液中有效磷增量在106.63～666.01 mg/L，其中，菌株ls1－3有效磷增量最大，有效磷增量大于 500mg/L 的菌株有 4 株（ls1－3、1s1－5、ls2－13、lhs4），占溶磷细菌总数40%。各菌株在蒙金娜有机磷培养液中的有效磷增量在0.32～58.42mg/L，其中，菌株lhs11有效磷增量（58.42mg/L）最大，菌株lhs4有效磷增量（35.08mg/L）次之，有效磷增量小于3mg/L的菌株有4株（ls2－11、1s2－13、ls2－16、ls3－2），并有2株菌株（ls1－3、1s1－5）不表现溶磷有机磷的能力。各菌株对不同磷源的分解能力均不同，菌株lhs11既能溶解无机磷（PKO培养液的有效磷增量为179.11 mg/L），又能溶解有机磷（蒙
金娜培养液的有效磷增量为58.42mg/L），但溶磷的能力差异较大；菌株ls2－13溶解无机磷（PKO培养液的有效磷增量为593.52 mg/L）的能力较强，但溶解有机磷（蒙金娜培养液的有效磷增量为0.46mg/L）的能力较弱；菌株ls1－3溶解无机磷（PKO培养液的有效磷增量为666.01mg/L）的能力很强，但无溶解有机磷的能力。
表1 各菌株在PKO无机磷和蒙金娜有机磷培养液中的有效磷增量Table 1 Available phosphorus increased on PKO and MENG Jin－na culture medium注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01）；下同菌株号有效磷增量/mg·L－1 PKO 无机磷培养液 蒙金娜有机磷培养液ls1－3 666.01aA 0.00fF ls2－13 593.52bB 0.46eE 1s1－5 569.13cB 0.00fF lhs4 556.31dB 35.08bB ls3－1 316.82eC 3.36cC lhs11 179.11fD 58.42aA ls3－5 153.01gD 3.35cC ls2－11 152.92gD 0.32eE ls2－16 118.42hE 1.24dD ls3－2 106.63iE 1.23dD ck 0.00jF 0.00fF
2.2 分泌IAA能力测定
各菌株用King培养基摇床培养12d，定性和定量测定各菌株IAA的能力，结果表明，各菌株IAA的能力和数量差异显著（P＜0.01）（表2）。测试菌株中7个菌株具有IAA的能力，占
供试菌株数的70%，分泌量在0.36～20.39mg/L，其中ls3－5分泌能力最强，分泌量（20.39μg/mL）也最大。而菌株ls2－16，ls3－2和ls2－11均无分泌IAA的能力。定性测定中，若显反应颜越深，说明菌株分泌IAA能力越强，反之越弱；若无颜反应，说明这些菌株没有分泌IAA能力。为进一步确定各菌株分泌IAA的能力，又进行了S2法比定量测定，测定的结果与定性测定结果一致。
表2 溶磷菌King培养基中分泌IAA量Table 2 Concentration of IAA secreted by phosphatesolubilizing bacteria in King culture medium注：＋、＋ ＋、＋ ＋ ＋和－分别表示浅红、粉红、深红、无菌株号 显反应 IAA含量/μg·mL－1 ls3－5 ＋＋＋ 20.39aA ls1－3 ＋＋＋ 16.52bB lhs4 ＋＋＋ 16.49bB ls2－13 ＋＋ 10.51cC ls3－1 ＋＋ 6.04dD lhs11 ＋ 0.87eE 1s1－5 ＋ 0.36eE ls2－16 －ls3－2 －ls2－11 －ck 0.00fF
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