工业技术
科技创新导报 Science and Technology Innovation Herald
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DOI：10.ki.1674-098X.2017.36.109
①
贾冰凝 何微 岳苑 吴明 张慧玲
(宁夏回族自治区食品检测中心 宁夏银川 750001)
摘 要：根据狐狸线粒体DNA(mtDNA)序列设计了狐狸特异性引物和探针，建立了食品中狐狸源性成分的实时荧光PCR检测方法。该方法的检测灵敏度可达0.1pg，而且与常见的12个物种无交叉反应，可作为食品中狐狸源性成分鉴别的有效方法。关键词：实时荧光PCR 狐狸源性 线粒体DNA 清真食品中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1674-098X(2017)12(c)-0109-03
我国少数民族众多，遍布各个省份，其中回族、维吾尔族、哈萨克族等少数民族信奉伊斯兰教。他们在饮食、起居等方面形成了独具特的风俗习惯，尤其在饮食方面有着严格的宗教特禁忌，禁食奇形怪状、污秽不洁、性情凶恶、行为怪异的飞禽、猛兽及鱼类等食物以及不反刍的动物，如猪、狗、猫、鼠、蛇、驴、马、骡、狗、狐狸等[1]。
狐狸作为一种经济附加值很高的畜类，在中国广泛养殖，人们主要通过饲养狐狸获取其皮毛制作衣服、围巾等产品。在将狐狸剥去皮后，剩余的肉及内脏就成为了“废物”，一些不法商贩将废肉低价买入再将其送往食品加工厂做成牛肉、羊肉、狗肉等制品并高价卖出，从中获得暴利。由于狐狸肉没有通过检验检疫，带有大量的病毒、细菌、寄生虫，而且为了得到光泽好的高质量的皮毛，养殖户会给狐狸喂食激素。这不仅仅是食品安全问题，更涉及到人们身体健康和宗教信仰等问题[1]。因此，对于肉制品中掺假的检测显得尤其重要。
动物源性检测手段主要有蛋白分析法和核酸分析法，但由于蛋白分析法要求样品不能经过高温等能使
蛋白变性的烹饪手段，这就极大地限制了其在实际生活中的应用[1]。随着分子生物学的进步，PCR技术很好地解决了这一问题。实时定量荧光PCR可以实时检测目标片段的表达情况，是目前检测食品中动物源性成分的主要手段，它有着专一性强、对样品加工程度要求低等特点[2]。目前已有关于猪、牛、羊、马、驴、兔[4-5]动物源性成分分析的报道，但采用实时定量荧光PCR法检测清真食品中狐狸源性还鲜有报道。本实验选择狐狸线粒体设计引物和探针，建立快速准确地检测清真食品中狐狸源性成分的实时定量荧光PCR检测方法，给食品掺假检测以及规范清真食品市场提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品及来源
肉及其制品包括牛、羊、猪、鱼、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑、驴、马、狗、狐狸。猪、牛、羊、鱼、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑采购自超市，驴、马采购自餐馆，狐狸采购自银川市西夏区兆狐狸养殖合作社，犬血液购自银川市兴庆区宠康动物诊所。
1.1.2 实验试剂
基因组DNA提取试剂盒购自于大连TA K A R A公司； PCR扩增纯化试剂盒，购自于Promager公司。
1.1.3 实验仪器
实时荧光定量PCR仪（Ep p e ndor f公司）；高速冷冻离心机（日本HTACHI公司）；恒温加热器（HAITEC公司）。
1.1.4 引物及探针的设计
根据NCBI基因数据库中公布的基因数据，选择狐狸细胞素b基因[3]，在线粒体DNA的区域设计了用于检测狐狸DNA的特异性引物和探针，此外，为了防止假阴性结果的出现以及监控PCR反应的正常与否，在真核生物的16sRNA保守区域设计了通用上下游引物。引物及探针的序列见表1。1.2 方法
1.2.1 样品DNA的提取
采用TA K A R A公司基因组DNA提取试剂盒，具体步骤：
(1)称取10mg样品加入Ep管中，充分剪碎；(2)70℃加热10min，其间指弹2～3次；(3)12000rpm、4℃离心10min，取200μL上清于新离心管中备用。阴性样品同样通过该法提取DNA，溶解于100μL TE溶液中备用。
1.2.2 实时荧光PCR反应
①基金项目：宁夏回族自治区重点研发计划（科技惠民）项目（项目编号:2016KJHM133）。
作者简介：贾冰凝（1968—），女，宁夏吴忠人，本科，高级工程师，研究方向：食品微生物检测与动物源性成分分析。
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反应体系40μL：PCR Mix25μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物（10μM）1μL，探针(5μM)2μL，模板DNA(10～50ng)2μL，无菌水补至40μL。
反应条件为：50℃保温2m i n，95℃预变性2m i n，95℃变性15s、60℃延伸45s进行40个循环，同时扩增目标物和内参。
1.2.3 特异性实验
为了考察本研究特异性，取1.1中所有样品的制作模板。根据1.2.2的反应体系和反应条件分别扩增。通用引物同步扩增[5]。
1.2.4 灵敏度实验
将狐狸D N A 溶液稀释至10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%，以含量不同的狐狸DNA样品为模板，进行PCR反应，用于确定方法的灵敏度。
1.2.5 重复性与稳定性验证
将狐狸DNA作为模板，按照1.2.2所述的反应体系与反应条件进行扩增，同一模板进行7次扩增反应，研究所建立体系的稳定性。
2 结果与讨论
2.1 狐狸源性成分特异性分析
用设计的狐狸源性引物和探针分别对12种样品的DNA 进行实时荧光P C R，结果如表2所示，C t 值的平均值为15.16，其余物种均无扩增，由此可见本研究所设计的狐狸源性引物和探针特异性良好。2.2 灵敏度试验结果
用特异性的引物和探针，以狐狸DNA含量分别为10%、
种类
引物和探针序列
片段长度
狐 狸
sense primer
5`-tggagcatcagtagaccttacaattt-3`109bp antisense primer
5`-ggcgggaggttttatattgataatag-3`probe FAM-ccctgcacctggccggagtc-TAMRA
通 用
sense primer
5`-gttcgtttgttcaacgattaa-3`74bp antisense primer
5`-agatagaaaccgacctggat-3`probe
FAM-ctccggtctgaactcagatcacgta-TAMRA 表1 狐狸源性引物和探针
表2 狐狸源性成分实时荧光PCR特异性试验结果
表3 狐狸源性成分重复试验结果
DNA含量由左至右依次为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%和0.00001%
图1 狐狸源性成分灵敏度试验
模板空白牛羊猪鱼鸡鸭鹅鸽鹌鹑马驴狗狐狸Ct
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
15.16
123.4567平均值标准差变异系数Ct值
15.36
15.07
15.53
14.81
14.85
15.04
15.24
15.13
0.26
1.74%
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1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%和0.00001%为模板扩增，结果见图1和图2。由图1和图2可知：当狐狸成分含量低至0.0001%时，仍能够呈现S型扩增曲线并且Ct值＜35，说明本方法可检出10-4n g的DNA量，因此方法的灵敏度为0.1pg。在10%至0.00001%浓度范围内，建立Ct值-DNA含量的标准曲线，R 2
为0.996，线性相关度良好。2.3 重复性与稳定性试验结果
狐狸源性成分重复性试验结果Ct值见表3。经统计学分析表明，实验稳定性和重复性良好，结果无显著性差异。
3 讨论与结论
3.1 目的基因的选择
之所以会选择线粒体细胞素b，是因为狐狸的细胞素b相对使用其余DNA片段作为物种鉴定的靶序列具有以下优点：(1)细胞素b 具有广泛的种内和种间多样性，比核DNA进化速度快，适于亲缘相近
物种的鉴别。(2)每个线粒体含2～6个环状DNA，在数量上远超过核DNA，适于加工样品的分析。(3)细胞素b在不同的物种中具有较高的变异性，特异性较强。3.2 检出限的确定
狐狸源性成分灵敏度试验0.1%、0.01%含量检测的Ct值均<35.0，但是为了区分偶然性和蓄意掺假，同时考虑检测过程中的实际意义，将检出限确定为0.1%。
参考文献
[1] 岳苑.实时荧光PCR法检测清真食品中马、驴源性成分
Slope:3.165 Y-Intercept:5.51 Efficiency:-0.52 R
2=0.996
图2 Ct值-DNA含量的标准曲线
[J].湖北农业科学,2014,53(22):5519-5521.
[2] 陈茹，林志雄，刘琳琳.应用PCR等核酸技术检验动物饲
料中牛羊组织成分[J].中国兽医科技,2001,31(9):3-8.[3] 曹际娟，卢行安，秦成，等.实时荧光PCR技术
检测肉骨粉中
牛羊源性成分的方法[J].生物技术通讯,2002,13(2):158-160.
[4] 杨宝华，宗卉.根据线粒体基因的特异性鉴别检测饲料中
的动物源性成分[J].科学试验与研究,2000(5):1-3.[5] Wang Q,Zhang X,Zhang HY ,et al.Identification
of 12 animal species meat by T-RFLP on the 12S rRNA gene[J].Meat Science,2010,85(2):265-269.
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