图片简介:
本技术涉及本技术涉及稳定液体SAA校准品的制备方法，包括进行SAA原核表达载体构建，将SAA蛋白的基因序列的氮端插入连接臂和组氨酸标签的碱基序列中；进行SAA蛋白可溶表达处理，添加诱导剂进行大肠杆菌菌浓度调节；进行SAA蛋白纯化处理，包括亲和吸附，利用咪唑进行洗杂及洗脱，获得纯度为95%的重组蛋白样品；最后配置SAA蛋白稀释液，将上述稀释液与重组蛋白样品混合搅拌得到最终校准品溶液。本技术与化学发光法相比结果具有较高的一致性，且成本更低，更适合临床检测的运用及推广，本技术的技术方案能够提供一种水溶状态下SAA稳定性好的蛋白液，能满足作为临床诊断的校准品要求、制备效率高且制造成本低的稳定液体SAA校准品的制备方法。 技术要求
1.一种稳定液体SAA校准品的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤一：进行SAA原核表达载体构建，包括先通过现有生物信息数据库网站获取人SAA 蛋白的基因和氨基酸序列，将SAA蛋白的基因序列的氮端插入连接臂和组氨酸标签的碱基序列中，并构建于PET-30a原核表达质粒载体中；
步骤二：进行SAA蛋白可溶表达处理，将上述重组蛋白在大肠杆菌中进行表达，添加0.2-1mM浓度的IPTG诱导剂，将蛋白表达过程中大肠杆菌菌浓度调节至OD600nm=1.5-1.8；
步骤三：进行SAA蛋白纯化处理，包括通过Ni NTA beads 6FF介质亲和吸附，分别利用10倍柱体积的20mM咪唑、50mM咪唑、100mM咪唑浓度依次进行洗杂后，再用300mM咪唑洗脱，获得纯度为95%的重组蛋白样品；
步骤四：最后采用如下配方配置SAA蛋白稀释液，包括20mM三羟甲基氨基甲烷、75mM 氯化钠、5%甘油、1-4% Triton X100、0.1% ProClin 950，并控制溶液PH环境数值在9.0，将上述稀释液与重组蛋白样品混合搅拌得到最终校准品溶液。
2.根据权利要求1所述的一种稳定液体SAA校准品的制备方法，其特征在于：所述步骤一种的SAA蛋白作为验证反应蛋白并对宿主细胞具有生理毒性，选择BL21（DE3）plys感受细胞为表达宿主。
3.根据权利要求2所述的一种稳定液体SAA校准品的制备方法，其特征在于：所述步骤四中的蛋白稀释液的配置配方还可采用如下配方替换，具体包括20mM三羟甲基氨基甲烷、75mM氯化钠、5%甘油、1-4% Triton X405和0.1% ProClin 950，并控制溶液PH环境数值在9.0。
4.根据权利要求1所述的一种稳定液体SAA校准品的制备方法，其特征在于：所述步骤四中的蛋白稀释液的配置配方中的PH环境还可以选择包括PH7.0或PH7.5磷酸盐溶液环境中任一种，或者PH8.0或PH8.5三羟甲基氨基甲烷中任一种。
5.根据权利要求5所述的一种稳定液体SAA校准品的制备方法，其特征在于：所述步骤四中的蛋白稀释液的配置配方中的NaCl盐浓度还可以选择包括150mM或200mM或300mM中任一种。
6.根据权利要求1所述的一种稳定液体SAA校准品的制备方法，其特征在于：所述步骤四中的蛋白稀释液的配置配方中的甘油浓度还可以选择包括10%或20%或30%或40%中任一种。
7.根据权利要求1所述的一种稳定液体SAA校准品的制备方法，其特征在于：所述步骤四中的蛋白稀释液的配置配方中的抑菌剂还可以选择包括ProClin 300或叠氮化钠中任一种。
8.根据权利要求1所述的一种稳定液体SAA校准品的制备方法，其特征在于：所述步骤四中的蛋白稀释液的配置配方中的表面活性剂还可以选择包括Triton X405或吐温-20或吐温80的任一种。
9.根据权利要求1所述的一种稳定液体SAA校准品的制备方法，其特征在于：所述步骤四中的蛋白稀释液的配置配方中还可增加搭配添加剂包括海藻糖、BSA、EDTA、精氨酸和氯化钙中的一种或多种。
技术说明书
一种稳定液体SAA校准品的制备方法
技术领域
本技术涉及校准品技术领域，尤其涉及一种稳定液体SAA校准品的制备方法。
背景技术
感染是指细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应，感染的途径有：呼吸道感染、消化道感染、创伤感染、接触感染、垂直传播（母婴传播），而根据入侵病原体的不同，感染又分为：细菌感染、病毒感染、真菌感染等，近些年来，由于不能高效的鉴别感染病原体而导致抗生素的滥用现象越来越严重，细菌感染引发的耐药细菌性疾病不断发生，抗生素耐药性的现象也频频出现。 SAA全名血清淀粉样蛋白A，是一种由肝细胞产生后被分泌到血清中的一种急性时相蛋白，当机体发生感染或损伤时，可在4-6h内迅速升高约1000倍，当机体抗原清除后则迅速降低至正常水平。
SAA的特点包括：第一，快升快降：SAA是急性相蛋白，机体受感染后，4-6h内即可迅速升高约1000倍，清除病原体后又可迅速的降低至正常水平，是反映机体感染情况和炎症恢复的灵敏指标；第二，互补应用：SAA与目前临床最广泛使用的CRP相比较，有一个最重要的不同之处：SAA升高见于病毒、支原体、细菌感染，且敏感性高于CRP；CRP升高见于细菌感染，病毒及支原体等病原体感染不升高或仅轻微升高。
将具有有效活性的重组SAA蛋白稀释一定的倍数后，由SAA胶乳增强比浊试剂盒测定赋值，加入保护剂，通过真空冷冻干燥仪连续工作几小时到十几小时制成冻干粉，抽样用SAA胶乳增强比浊试剂盒检测赋值正确后，即为成品，2-8℃冷藏保存。使用时加水溶解，不能重复使用，现有该制备过程操作发杂、时间长、耗能高、复溶后样品不稳定且不能重复使用的缺点。
技术内容
本技术目的是为了克服现有技术的不足而提供一种水溶状态下SAA稳定性好的蛋白液，能满足作为临床诊断的校准品要求、制备效率高且制造成本低的稳定液体SAA校准品的制备方法。
下面关于后续技术方案表述中涉及的专业名词解释如下:
PET-30a是指蛋白原核表达质粒载体的代号；
IPTG诱导剂是指异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；
OD是指吸光值；
Ni NTA beads 6FF是指镍离子亲和纯化介质；
Triton X100是指曲拉通X100；
ProClin是指防腐剂型号；
BL21（DE3）plys是指耐毒性蛋白表达大肠杆菌菌株；
BSA是指牛血清白蛋白；
EDTA是指乙二胺四乙酸二钠盐。
为达到上述目的，本技术采用了如下技术方案。
一种稳定液体SAA校准品的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一：进行SAA原核表达载体构建，包括先通过现有生物信息数据库网站获取人SAA 蛋白的基因和氨基酸序列，将SAA蛋白的基因序列的氮端插入连接臂和组氨酸标签的碱基序列中，并构建于PET-30a原核表达质粒载体中；
步骤二：进行SAA蛋白可溶表达处理，将上述重组蛋白在大肠杆菌中进行表达，添加0.2-1mM浓度的IPTG诱导剂，将蛋白表达过程中大肠杆菌菌浓度调节至OD600nm=1.5-1.8；
步骤三：进行SAA蛋白纯化处理，包括通过Ni NTA beads 6FF介质亲和吸附，分别利用10倍柱体积的
20mM咪唑、50mM咪唑、100mM咪唑浓度依次进行洗杂后，再用300mM咪唑洗脱，获得纯度为95%的重组蛋白样品；
步骤四：最后采用如下配方配置SAA蛋白稀释液，包括20mM三羟甲基氨基甲烷、75mM 氯化钠、5%甘油、1-4% Triton X100、0.1% ProClin 950，并控制溶液PH环境数值在9.0，将上述稀释液与重组蛋白样品混合搅拌得到最终校准品溶液。
作为本技术的进一步改进，所述步骤一种的SAA蛋白作为验证反应蛋白并对宿主细胞具有生理毒性，选择BL21（DE3）plys感受细胞为表达宿主。
作为本技术的进一步改进，所述步骤四中的蛋白稀释液的配置配方还可采用如下配方替换，具体包括20mM三羟甲基氨基甲烷、75mM氯化钠、5%甘油、1-4% Triton X405和0.1% ProClin 950，并控制溶液PH环境数值在9.0。
作为本技术的进一步改进，所述步骤四中的蛋白稀释液的配置配方中的PH环境还可以选择包括PH7.0或PH7.5磷酸盐溶液环境中任一种，或者PH8.0或PH8.5三羟甲基氨基甲烷中任一种。
作为本技术的进一步改进，所述步骤四中的蛋白稀释液的配置配方中的NaCl盐浓度还可以选择包括150mM或200mM或300mM中任一种。
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