第一章 总则
1.1 意义
准确可靠的CD4+T淋巴细胞检测是评价HIV感染者免疫状况，预测判断疾病进程、评价抗病毒药物效果和估测预后的重要指标；世界卫生组织(WHO)和欧美等国家均推荐，艾滋病病毒（HIV）感染者每3-6个月监测一次CD4+T淋巴细胞水平，并以该指标作为开始预防间质性浆细胞肺炎和其它机会性感染，以及作为开始抗逆转录病毒的主要指标。依照世界卫生组织和美国CDC成年人和未成年人AIDS病例中HIV感染和病例监测分类系统定义，CD4+T淋巴细胞水平也作为判断HIV相关临床病程的标准。我国“国家免费艾滋病抗病毒药物手册”中也将CD4+T淋巴细胞CD4<200/mm3做为开始抗病毒的标准。因而保证CD4+T淋巴细胞检测质量是非常重要的。《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量保证指南》对保证CD4+T淋巴细胞检测质量有重要的指导意义。 1.2目的
指导我国从事HIV感染者和AIDS患者CD4+T淋巴细胞检测工作的实验室人员，规范CD4+T淋巴细胞检测方法和程序，完善实验室质量保证与质量控制，提高检测的准确性。 1.3 适用范围
适用于我国采用单平台法检测艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞的所有实验室。
1.4 缩略语
HIV/AIDS: 艾滋病病毒感染者和艾滋病患者；HIV：艾滋病病毒； AIDS：艾滋病； SOP：标准操作程序； FCM：流式细胞术；SPT：单平台技术；ID：患者编号；PMT：光电倍增管； PT：能力验证
第二章 实验室环境与设施
2.1 CD4+T 淋巴细胞检测实验室设施
理想的CD4+T淋巴细胞检测实验室应该有专用实验室。如果空间有限，CD4+T淋巴细胞检测可以与HIV检测的筛查和确认实验室共享一个空间。本指南推荐的是理想的CD4+T淋巴
细胞检测实验室的空间安排。样品接收、处理在一单独房间，样品检测、分析和报告在另一单独房间。该类实验室应符合国家生物安全二级 (BSL-2)实验室的有关规定。
2.2 CD4+T淋巴细胞检测实验室空间安排的一般性原则
实验室应有以下区域：
2.2.1 样品接收区；
2.2.2 样品存放区；
2.2.3 样品处理区；
2.2.4 样品检测区；
2.2.5 结果分析和发布区；
2.2.6 资料存放区（实验室档案)
图1 CD4+T淋巴细胞检测实验室规划图(建议)
(注: 具体空间尺寸应与设备大小相一致)
如在独立实验室进行CD4+T淋巴细胞检测，其实验室规划和工作流程应如图1所示。虚线以上相对独立。如果属于共用实验室也应按照如图1所示的区域设计实验室。 实验室空间规划应参考仪器制造商提供的主机及其附属设备的尺寸。样品检测和数据分析可以在同一实验室或不同实验室进行。
第三章 实验室安全
实验室负责人应保证所有涉及CD4+T淋巴细胞检测的检验员和管理者接受足够的生物安全培训，并接受年度复训，了解生物安全保障的一般性导则。相关人员要接受实验室安全员和实验室安全负责人的监督。所有实验室事故和意外要根据艾滋病实验室事故和意外处理的原则进行处理、记录和报告。
实验室安全负责人的责任是保证实验室处于安全状态。所有人员有责任实现自身保护和其他工作人员的安全。所有人员的安全培训均应记录在实验室和人事档案中。具体操作应遵照国家卫生部2004年4月颁布的《医务人员艾滋病病毒职业暴露防护工作指导原则（试行）
》，2003年8月颁布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（WS 233-2002）》中华人民共和国卫生行业标准，和中国疾病预防控制中心《全国艾滋病检测技术规范(2004版)》中的相关条文和一般性导则规定。
3.1 环境
应符合国家二级生物安全实验室(BSL-2)有关规定。
3.2 制度与管理
实验所涉及的称量器具和测试仪器均要求建立管理与登记制度。使用管理制度应参照国家生物安全相关规定，结合本实验室其他HIV检验工作安全制度，并使称量器具和测试仪器的使用规程相一致。CD4+T淋巴细胞检测最基本的管理内容应包括：移液器、细胞计数仪、冰箱、计算机及其附属设备等。使用登记内容应当尽量涵盖必要的管理要素，按执行日期登记。
3.3 样品安全
本节内容包含与CD4+T淋巴细胞检测检测相关的样品采集、包装、运输、接收、分装、测试和储存等各环节的安全要求。采集、包装、运输三部分为实验室外部过程，应遵循现场工作安全规范。
接收样品的所有措施、规程和制度均应符合国家相关规定。在实际操作中(包括各级各类筛查、确认和参比实验室)应在符合2级生物安全实验室（BSL-2）要求的实验室中进行。
3.4 废弃物处理
所有废弃物应按照HIV污染物品处理。由专人按特定程序和方法进行清洁和消毒。只有在确认彻底消毒后，才能移出污染区，妥善包装后移交专门机构进行销毁，不得循环使用。 3.4.1废弃物分类
按照物理特性分类，主要有液体、可燃性物质与不可燃性物质。不可燃性物质又可分为金属和非金属类。分类有助于选择适宜的消毒方法。
3.4.2 消毒方法
液体类消毒应注意消毒剂被废液稀释后，最终稀释浓度必须保持在有效消毒浓度。计算消毒剂用量应以需处理的废液总量为分母。可燃性物质应遵循先消毒后焚烧的程序。焚烧应由环保部门认可的专业机构进行，防止造成环境污染；不可燃物质中非一次性用品应遵循先消毒后清洗，清洗后常规消毒包装后再使用的程序。一次性用品应按照先消毒后深埋的程序进行。
常用消毒剂配制浓度与物理消毒方法
3.4.2.1 含氯消毒剂（次氯酸钠，含有效氯2000-5000mg/L）适用于废液缸、溢出物
3.4.2.2 75%乙醇 适用于实验室桌面、生物安全柜工作台面和仪器表(非光学部件)
3.4.2.3 2%戊二醛
以上浸泡消毒时间为器具保持在液面下10 30 min。
3.4.2.4 高压蒸汽消毒，121℃，保持15 20min;
3.4.2.5 干燥空气烘箱消毒（干烤消毒），140℃，保持2 3h。
3.4.2.6 流式细胞仪内置的废液收集桶应按照HIV实验室废液处理方法和规程进行消毒。
3.4.2.7 标识与登记
所有消毒剂都应明确标记浓度。配制好的消毒剂应标明配制时间。
3.5 个人防护
个人防护应符合国家有关艾滋病实验室标准的要求。
尽管流式仪激光束属于低能量激光。但在实施仪器维护和检修过程中，应注意避免激光束对眼睛的直接照射。
3.6 人员培训与考核
CD4+T淋巴细胞检测的管理人员和检测人员应接受与工作相关的技术培训。所有工作人员必须经过HIV检测技术和省级以上艾滋病实验室安全培训，包括CD4+T淋巴细胞检测上岗培训和定期复训。接受实验室生物安全责任人和实验室管理人员的监督。实验室的安全责任人要对工作秩序和环境的安全负责，所有工作人员都有责任保护自己和他人的安全。
3.7 突发事件处理与报告
遵循国家HIV检测实验室有关突发性生物安全事件处理程序和认定原则进行登记上报和应急处理。
第四章 质量保证
实验室的质量保证是为达到质量目标而制定的一套规范行为的标准。质量保证的目的是持续为病人提供准确可靠的检测结果。实验室的质量保证要考虑自接受样品到发出检测报告过程中所有可能影响检测结果的因素。包括行政支持、实验室管理、环境要求、人员培训和质量控制等多方面的内容(见图2)。有关行政支持、实验室管理和环境等要求按照“全国艾滋病检测技术规范”和“全国艾滋病检测工作管理办法”的规定执行。工作人员应在实验室管理、CD4+T淋巴细胞检测技术和质量保证等方面得到全面培训。
质量控制包括室内质量控制（简称室内质控）和外部质量控制（简称外部质控）。室内质控要求工作人员做好仪器质控和过程质控（详见第五章）, 过程质控主要由试剂质控、样品
质控和数据质控构成。外部质控主要要求CD4+T淋巴细胞检测实验室参加检验能力验证（详见第六章）。
第五章 室内质控
5.1仪器质控
5.1.1 仪器应按照生产厂家的要求进行校准。正式检测样品前应先用仪器生产厂家的质控品校准仪器，质控品通过测试后方可检测样品。
5.1.1.1 通常仪器设置应当按照仪器生产厂家的要求用商业化的校准物质(如荧光微球)校准流式细胞仪并建立档案,保存记录并监测流式细胞仪的性能变化(电压,放大,补偿)。
5.1.2设置分析窗口
5.1.2.1 依据试验所用荧光单克隆抗体所带荧光素选择对应的通道，建立分析窗口。专门设置的分析窗口取决于流式细胞仪荧光性的范围通道特性与所使用的抗体组合。分析窗口的荧光范围由相应通道的特性决定。设计分析窗口在特定设置情况下，通过流式检测的荧光范围。
5.1.2.2 目的是可以达到荧光范围的重复性和细胞位置的标准化
5.1.2.3 使用荧光微球作为参考标准。
5.1.2.4 收集每个通道的信号作为靶标，记录保存建立的分析窗口为以后分析所用。
5.1.2.5 再开机检测时用此靶值作为标准值，调节PMT电压，得到同一窗口进行样品分析。
5.1.2.6 每天对电压做Levey-Jenning图。
5.1.3 每日应校正光路，确保所有的参数都有最明亮最窄的峰。
5.1.4 进行多分析时，颜补偿通常由自动软件完成，自动补偿一般情况下会运行很好。通常在一至两个月中定期设置一次荧光补偿。如果变异系数(CV)有较大变化或在样品获取时出现问题要及时进行调节或校准(见图3)。在某些情况下推荐手动补偿，例如：需确认现有光学滤镜与新的荧光剂的兼容性。手动补偿即是将每一抗体在单独的试管中与正常人阴性血样结合进行每一种单一抗体的补偿，然后混合单的样品，依照仪器生产厂家要求设置补偿。
5.1.5 使用多试剂( 三和四)，可用仪器质控软件成功运行后自动生成的仪器设置文件
内的荧光补偿。强力推荐每1-2个月使用正常人全血，对每一通道进行补偿和电压调节。使用单试剂，需要调用上述文件后，依据样本情况和图4的补偿原理进行优化。
5.2 过程质控
5.2.1试剂质控
5.2.1.1 所用试剂应在有效期内。
5.2.1.2 使用不同批号试剂时，需要进行平行实验。即新批号试剂在测定质控品(已知细胞数的商业质控品)时能够获得与原试剂相同的结果。
未补偿 补偿不足 正确补偿
A1–A3分布图，分别显示实验图。B1–B3是A1–A3相对应的示意图
图3 多补偿图
此图引自《用CD45设门的单平台法检测人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者的CD4＋T淋巴细胞实验操作指南（2003年版）美国ＣＤＣ》
5.2.1.3 对于同批试剂，应采用HIV阴性全血样品作为定值指标。
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