促进土党参离体增殖的套盒和方法

促进土党参离体增殖的套盒和方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是促进土党参离体增殖的套盒和方法。

背景技术

目前土党参离体快速繁殖的研究较少。王祝年等(2007)以成熟果实为外植体，取 种子进行无菌萌发获得幼苗，将幼苗切为茎段，采用MS+6-BA 1.0mg·L^-1+NAA 0.1mg·L^-1， 以20天为周期进行繁殖，繁殖率为5-6倍，之后在生根培养基MS+NAA 0.5mg·L^-1上进行生 根，生根率为100％，移栽后获得了完整植株。我们采用相同的方法进行种子无菌萌发获得 幼苗，将幼苗切为茎段，采用MS+6-BA 1.0mg·L^-1+NAA 0.1mg·L^-1进行繁殖时，接种的茎段 侧芽萌发，但不继续伸长，逐渐黄化死亡，未能重现文献的结果，表明现有的土党参离体快 速繁殖方法并不可靠。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能实现土党 参离体快速繁殖的套盒和方法，以提高土党参的繁殖率。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：促进土党参离体快速增殖的套盒，所 述套盒包含用以诱导出带不定芽块的茎段的培养基1和用以反复继代培养培养基2，所述培 养基1和培养基2均包含以下组分：6-苄基氨基嘌呤、噻苯隆和MS培养液。由此，本发明首次 加入噻苯隆(TDZ)配合6-苄基氨基嘌呤(BA)诱导带不定芽块的茎段，解决了仅采用BA和NAA 进行初次继代时存在的繁殖率低、植株黄化不能持续继代繁殖的问题；利用本发明的套盒 可以促进土党参茎段反复继代至少5次，经壮苗、生根、移栽后获得数量可观的无菌土党参 苗。

优选地，所述培养基1中，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.4～0.6mg/L，噻苯隆的浓度 为0.01～0.1mg/L；所述培养基2中，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.4～0.6mg/L，噻苯隆浓度为 0.01～0.02mg/L。应当说明的是，培养基2中采用TDZ和BA的配合在茎段基部诱导出的不定 芽块，在培养基3中继代，此类带不定芽块的茎段可在较低浓度的TDZ和BA中继代培养5次以 上；以30天为培养周期，繁殖倍数为10～15倍，植株基部丛生，高度约为4～6cm。

优选地，所述培养基1和培养基2分别还包括以下组分：25～35g/L的蔗糖以及6.5 ～7.5g/L的琼脂。由此，培养基1包括以下组分：MS培养液、0.4～0.6mg/L的6-苄基氨基嘌 呤、0.01～0.1mg/L的噻苯隆、25～35g/L的蔗糖以及6.5～7.5g/L的琼脂；培养基2包括以下 组分：MS培养液、0.4～0.6mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.01～0.02mg/L的噻苯隆、25～35g/L的 蔗糖以及6.5～7.5g/L的琼脂。

优选地，所述套盒还包含用以继代和壮苗的培养基3，所述培养基3包含以下组分： MS培养液、0.5～1.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.05～0.1mg/L的萘乙酸、25～35g/L的蔗糖以 及6.5～7.5g/L的琼脂；由此，在壮苗阶段，采用此配方的培养基3可使不定芽块消失，叶 深绿、生长健壮、叶柄处带有芽点，符合生根和成苗要求。

优选地，所述套盒还包含用于生根的培养基4和作为前处理液的100～300mg/L的 吲哚丁酸；所述培养基4包含以下组分：MS培养液、25～35g/L的蔗糖以及6.5～7.5g/L的琼 脂。由此，本套盒采用此配方，可使茎段生根迅速、侧根多，根系质量好。

优选地，所述培养基1包含以下组分：MS培养液、0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、 0.1mg/L的噻苯隆、30g/L的蔗糖以及7g/L的琼脂；所述培养基2包含以下组分：MS培养液、 0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.01mg/L的噻苯隆、30g/L的蔗糖以及7g/L的琼脂；所述培养基 3包含以下组分：MS培养液、1mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.1mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖以及 7g/L的琼脂；所述培养基4包含以下组分：MS培养液、30g/L的蔗糖以及7g/L的琼脂；所述套 盒还包含300mg/L的吲哚丁酸。本申请的发明人经多次试验发现，本发明的套盒中培养基采 用上述成分及浓度时，可以使土党参的繁殖倍率可达到15倍，并获得健壮无菌苗，生根率和 移栽成活率均达到100％；在生根阶段，在无菌条件下用300mg/L的IBA溶液浸泡茎段的远生 长端15min后，转入此配方的培养基4，培养30d后生根率达100％，长度大于1cm的侧根的数 量高达5.8。

优选地，所述套盒还包含用以诱导无菌苗的初代培养基，所述初代培养基包含以 下组分：MS培养液、25～35g/L的蔗糖以及6.5～7.5g/L的琼脂。

优选地，所述套盒还包含基质，所述基质包含以下重量比的组分：黄泥3份、泥碳2 份和沙子1份。

作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种促进土党参离体增殖的方法，包 括如下步骤：

(1)选取健壮的土党参植株，采摘成熟果实作为外植体；

(2)在无菌条件下，对步骤(1)所得成熟果实中尚未裂开的果实进行表面消毒后， 取出种子直接接种在初代培养基上以诱导无菌苗；

(3)将步骤(2)中获得的无菌苗剪切为带不小于两个节的带芽茎段，接种于培养基 1上，以获得带不定芽块的茎段；

(4)将步骤(3)中获得的带不定芽块的茎段及不定芽块，接种于培养基2上进行繁 殖得苗；

(5)将步骤(4)中获得的苗，接种于培养基3上进行壮苗；

(6)将步骤(5)中获得的苗，经100～300mg/L的吲哚丁酸溶液浸泡后接种于培养基 4上以生根；

(7)将步骤(6)中获得的植株根部的培养基清洗干净，移栽于基质上，即可获得完 整的土党参植株，

其中，所述培养基1包括以下组分：MS培养液、0.4～0.6mg/L的6-苄基氨基嘌呤， 0.01～0.1mg/L的噻苯隆、25～35g/L的蔗糖以及6.5～7.5g/L的琼脂；

所述培养基2包括以下组分：MS培养液、0.4～0.6mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.01～ 0.02mg/L的噻苯隆、25～35g/L的蔗糖以及6.5～7.5g/L的琼脂；

所述培养基3包含以下组分：MS培养液、0.5～1.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.05～ 0.1mg/L的萘乙酸、25～35g/L的蔗糖以及6.5～7.5g/L的琼脂；

所述培养基4包含以下组分：MS培养液、25～35g/L的蔗糖以及6.5～7.5g/L的琼 脂；

所述初代培养基包含以下组分：MS培养液、25～35g/L的蔗糖以及6.5～7.5g/L的 琼脂；

所述基质包含以下重量比的组分：3份黄泥、2份泥碳和1份沙子。

应当说明的是，本方法首次采用间接生根法，生根效果比直接转入MS培养液更好； 步骤(2)中种子来源于成熟但未开裂的果实(新鲜种子)，种子活力高，污染少，无菌处理十 分容易，污染率接近为零，萌发率几乎为100％；本发明的套盒还包含培养基4的前处理液： 100～300mg/L的吲哚丁酸溶液；步骤(6)中生根阶段分为两个小阶段：首先用高浓度的吲哚 丁酸溶液浸泡步骤(5)所得苗中茎段的基部，再将茎段转移到培养基4上。

优选地，所述步骤(2)中消毒处理过程包括：将种子加入70～75％v/v的酒精浸泡 30～60s，无菌水清洗干净，再用质量百分比浓度为0.08～0.12％的溶液浸泡10～ 15min，无菌水清洗6～8次，无菌滤纸吸干表面水分。

优选地，所述步骤(2)～(6)中均采用以下培养条件：24～26℃、光照10～14h/d、光 照强度2500～3500lx。

优选地，所述步骤(5)与步骤(6)之间还包括步骤(5a)：将步骤(5)壮苗处理所得苗 的带叶茎段的远生长端于浓度为100～300mg/L的吲哚丁酸溶液中浸泡10～15min。更优选 地，先将步骤(5)壮苗处理所得苗的带叶茎段的远生长端用300mg/L的吲哚丁酸溶液浸泡 15min。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1、本发明的套盒在继代的过程中加入TDZ配合BA诱导带不定芽块的植株，在生根 之前采用NAA和BA配比进行壮苗，最后进行驯化移栽；

2、本发明的方法解决了采用NAA和BA配比进行繁殖的过程中，繁殖苗细弱、枯黄、 死亡以及繁殖率低的问题；

3、以30天为培养周期，利用本发明的套盒可以使土党参的繁殖倍率达到10-15倍， 并获得健壮无菌苗，生根率和移栽成活率均为100％。

具体实施方式

除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员 通常理解的含义。以下对文中出现的缩略词和培养基的配制方法进行了说明。

1、本文中涉及的英文缩略词

TDZ、噻苯隆，BA、6-苄基氨基嘌呤，IBA为吲哚丁酸，NAA为萘乙酸、GA3为赤霉素。

2、培养基的配制

本发明中的MS培养液组成成分如下表所示：

配制1L MS培养液：准确称取上表中所述的各种化合物，加适量蒸馏水溶解，用玻 璃棒搅拌促溶，用NaOH调pH至6.0，最后定容到1L。

初代培养基：在MS培养液的基础上添加25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；

培养基1：在MS培养液的基础上添加0.4～0.6mg/L的BA、0.01～0.1mg/L的TDZ、25 ～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；

培养基2：在MS培养液的基础上添加0.4～0.6mg/L的BA、0.01～0.02mg/L的TDZ、25 ～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；

培养基3：在MS培养液的基础上添加0.5～1.0mg/L的BA、0.05-0.1mg/L的NAA、25～ 35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；

培养基4：在MS培养液的基础上添加25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；培养前 用100～300mg/L的IBA溶液浸泡带叶茎段的远生长端10～15min；

基质(按重量比):黄泥:泥炭:沙子＝3:2:1。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。如无特殊说明，以下实施例中无菌苗的诱导以及继代培养条件均为24～26 ℃、光照12h/d、光照强度2500～3500lx。

实施例1

2014年10月从广州市华南植物园温室采集果实5个，经离体萌发、继代、壮苗、生根 和移栽，具体步骤如下：

(1)果实的采摘：2014年10月20日，在广州市华南植物园温室选取健壮的土党参植 株，采摘成熟但未开裂的果实，当天拿回实验室，保存在4℃冰箱；

(2)外植体无菌处理及无菌苗的诱导：2014年10月21日，在超净工作台上，用75％ 酒精擦拭果实进行表面消毒，再剥开果实，取出种子。直接接种于初代培养基(在MS培养液 的基础上添加30g/L蔗糖以及7g/L琼脂)上诱导种子发芽。30天后种子萌发率接近100％，60 天后植株高约3-4厘米；

(3)第一次继代培养：将无菌苗剪切为带2个节的茎段，高度约为2cm，接种于培养 基1(在MS培养液的基础上添加0.4～0.6mg/L的BA、0.01～0.1mg/L的TDZ、25～35g/L蔗糖以 及6.5～7.5g/L琼脂)上，一共培养了30个茎段；这里保持蔗糖和琼脂的量不变，通过调整BA 和TDZ的浓度比例来观察其对土党参继代繁殖的影响；

(4)反复继代：将第一次继代获得的无菌苗剪切为带2个节的茎段，接种于培养基 上2(在MS培养液的基础上添加0.4～0.6mg/L的BA、0.01～0.02mg/L的TDZ、25～35g/L蔗糖 以及6.5～7.5g/L琼脂)；培养30天后，增殖倍数为12～15倍；

(5)壮苗：培养基3中MS培养液的基础上添加1.0mg/L的BA、0.1mg/L的NAA、30g/L蔗 糖以及7g/L琼脂，可使不定芽块消失，茎段伸长、叶深绿、生长健壮、叶柄处带有芽点，符 合生根和成苗要求；

(6)生根(间接生根法)：切取长约3-4cm，生长健壮的茎段，在无菌条件下将距切口 处长0.2～0.5cm的远生长端浸泡于100～300mg/L的IBA溶液中，分别浸泡10、15min后接种 于生根培养基4上(在MS培养液的基础上添加25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂)；30天 后生根率100％，长度大于1cm的侧根的数量为5.3，植株叶深绿，根粗壮，长达1-3cm，符合 移栽要求；

(7)移栽至基质:该基质按重量比包括：黄泥3、泥炭2、沙子1。

部分结果如下表所示：

由上表可知：其他条件不变，当初次继代培养时，接种于培养基1(含有BA 0.5mg/L +TDZ 0.05mg/L)中时，培养30天后，增殖倍数为12倍；此时的无菌苗浓绿、粗壮，不定芽块 直径中等，无任何黄化现象出现，增殖效果最好。

带不定芽块的茎段接种于培养基2(含有BA 0.5mg/L+TDZ 0.1mg/L)中时，茎段的 侧芽大量萌发；同时，茎段基部的不定芽块分化出新的茎段；以30天为培养周期，反复继代5 代以上，增殖倍数均保持在10-15倍。生根前，将带不定芽块的茎段接种于培养基3(含有 0.5mg/L的BA、0.1mg/L的NAA)中，茎段基部的不定芽块消失，幼苗生长健壮、叶浓绿。最后 转入培养基4和基质中进行生根和移栽，获得完整植株。

实施例2

2015年10月从广州市华南植物园温室采集果实5个，经离体萌发、继代、壮苗、生根 和移栽，具体步骤如下：

(1)果实的采摘：2015年10月10日，在广州市华南植物园温室选取健壮的土党参植 株，采摘成熟但未开裂的果实，当天拿回实验室，保存在4℃冰箱。

(2)外植体无菌处理及无菌苗的诱导：2015年10月11日，在超净工作台上，用75％ 酒精擦拭果实进行表面消毒，再剥开果实，取出种子。直接接种于初代培养基(在MS培养液 的基础上添加30g/L蔗糖以及7g/L琼脂)上诱导种子发芽。30天后种子萌发率接近100％，60 天后植株高约3-4厘米。

(3)第一次继代培养：将无菌苗剪切为带2个节的茎段，高度约为2cm，接种于培养 基1(在MS培养液的基础上添加0.4～0.6mg/L的BA、0.01～0.1mg/L的TDZ、25～35g/L蔗糖以 及6.5～7.5g/L琼脂)上，一共培养了30个茎段。培养30天后，增殖倍数为10～20倍。

(4)反复继代：将第一次继代培养获得的无菌苗剪切为带2个节的茎段，接种于培 养基上2(在MS培养液的基础上添加0.4～0.6mg/L的BA、0.01～0.02mg/L的TDZ、25～35g/L 蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂；)，这里保持蔗糖和琼脂的量不变，通过调整BA和TDZ的浓度比 例来观察其对继代增殖的影响。

(5)壮苗：培养基3中MS培养液的基础上添加0.5-1.0mg/L的BA、0.05-0.1mg/L的 NAA、25-35g/L蔗糖以及6.5-7.5g/L琼脂，茎段叶深绿、生长健壮，符合生根和成苗要求。

(6)生根：切取长约3-4cm，生长健壮的茎段，在无菌条件下将距切口处长0.2～ 0.5cm的远生长端浸泡于100～300mg/L的IBA溶液中，分别浸泡10、15min后接种于生根培养 基4上(在MS培养液的基础上添加25～35g/L蔗糖以及6.5～7.5g/L琼脂)。30天后生根率 100％，长度大于1cm的侧根的数量为5.5，植株叶深绿，根粗壮，长达1-3cm，符合移栽要 求。

(7)移栽至基质:该基质按重量比包括：黄泥3、泥炭2、沙子1。

结果如下表所示：

由上表可知：其他条件不变，当初次继代培养时，接种于培养基1(含有BA 0.5mg/L +TDZ 0.02mg/L)中时，对于茎段的增殖效果最好，培养30天后，获得30丛土党参无菌苗，平 均每丛苗含有30个节，增殖倍数为15倍，此时的无菌苗浓绿、粗壮，不定芽块直径中等，无 任何黄化现象出现；带不定芽块的茎段接种于培养基2(含BA 0.5mg/L+TDZ 0.02mg/L)中 时，茎段的侧芽大量萌发，丛生芽数量多于实施例1和实施例2中其它激素组合和浓度条件 下的丛生芽数量；同时，茎段基部的不定芽块分化出新的茎段，以30天为培养周期，可反复 继代5代以上，增殖倍数保持在12～15倍。生根前，将带不定芽块的茎段接种于培养基3(含 有0.5mg/L的BA、0.1mg/L的NAA)中，茎段基部的不定芽块消失，幼苗粗壮、叶浓绿。最后转 入培养基4和基质中进行生根和移栽，获得完整植株。

实例3不同浓度的IBA及浸泡时长对土党参生根的影响

选取实施实例1培养基3中培养的土党参无菌苗，在无菌的条件下将土党参切成3 ～4cm的茎段，将茎段距其切口0.2～0.5cm的远生长端浸泡于不同浓度的IBA中，浸泡时间 为10～15min后转入MS空白培养基，来观察不同浓度IBA及不同处理时间对土党参生根的影 响。

试验结果如下表所示：

由上表可知，随着增加IBA的浓度，土党参长度大于1cm的侧根的数量呈上升趋势， IBA浓度与生根率呈正相关关系。当IBA浓度为300mg/L、处理时间为15min时生根效果最好， 此时生根率达100％，长度大于1cm的侧根的数量达5.3，且植株叶浓绿，苗粗壮，长势良 好。

实施例4不同激素浓度配比及生根培养前的IBA溶液的浸泡时长对土党参生长的 影响

选取健壮的土党参母树的种子作为外植体；在无菌条件下，对种子进行处理，接种 在初代培养基上诱导无菌苗；进而将获得的无菌苗剪切为不小于两个节的茎段，接种于添 加BA和TDZ的培养基上获得带不定芽块的茎段；继代培养时，通过调整BA和TDZ的浓度，带不 定芽块的茎段可反复继代，茎段的侧芽大量萌发，同时茎段基部的不定芽块分化出新的茎 段；生根前在BA的基础上去除TDZ，添加NAA进行壮苗，然后用的IBA处理后转入生根培养基， 30d后统计增殖倍数、长度大于1cm的侧根的数量、生根率和移栽成活率，结果如下表所示：

注：上表中培养基的其他成分相同，例如MS培养液、30g/L的蔗糖以及7g/L的琼脂； 上表中各成分数值对应的单位与实施例1-3中相同。

如上表所示，当套盒中培养基组分采用c组的成分和浓度时，土党参的增殖倍数、 生根率、移栽成活率和长度大于1cm的侧根的数量均为最优值。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。