一种基于人工修饰引物的定量突变检测系统

本发明属于生物技术领域。更具体而言，本发明涉及基因突变的检测。

随着测序技术的飞速发展，人类及各种动植物、微生物基因组被测序完成，海量的基因组学数据对医学、生物学、农学和林学等领域中的基因功能研究提出了新的挑战。

突变指细胞中的遗传基因发生的改变。它包括单个碱基改变所引起的突变，或多个碱基的插入、缺失和重复等。随着基因和疾病关联研究的深入，致病基因、药物敏感及耐受基因的突变检测已经被广泛应用于疾病发生机理研究中。同时，以突变为基础的分子遗传标记技术也使动植物育种跨入了分子育种时代。由于突变检测在疾病发生机理研究和动植物育种及遗传改良等领域的广泛应用，使得高灵敏度、高选择性的准确快速基因突变检测方法受到前所未有的关注。

基因检测技术发展至今种类繁多，有单链构象异构多态分析技术(Single-strand conformation polymorphism, SSCP)、异质性双链构象多态性分析(Heteroduplex, HTX)、变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Get Electrophoresis, DGGE)、错配裂解法(Dismate cleavage, DC)、变性高效液相谱分析(Denaturing high-performance liquid chromatograph, DHPLC)、等位基因特异性寡核苷酸杂交(Allele-Specific Oligonucleotide Hybridization, ASOH)、PCR(Polymerase Chain Reaction)测序法、等位基因特异性扩增(Allelegene-specific Amplification, ASA)等。但能同时具备高灵敏度、高选择性的准确快速检测方法还为数不多。

目前，使用最多的基因检测方法是PCR测序法，亦称聚合酶链式反应法。PCR测序法是目前默认的“金标准”。但PCR测序法敏感度较低，对低质量或含量较低的样本检测会产生较大的假阳性和假阴性。PCR测序法中的PCR引物位于突变位点两侧，会将正常序列和突变序列都进行扩增。由于突变序列往往所占比例极小，而PCR扩增反应中，模板所含比例较大的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)具有扩增优势。因此，PCR测序法的选择性较低，仅为10%-30%。同时，该方法不能对样品所含突变进行定量分析。

因此，有人开发了一种叫作扩增阻碍突变系统法(Amplification Refractory Mutation System, ARMS)，它是等位基因特异性扩增法(ASA)的一种。ARMS方法利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物。研究表明，ARMS法能将突变检测的选择性提高到1%，但是对于质量低或含量低的DNA样品，这样的选择性依然偏低。另外，ARMS法依靠常规凝胶电泳或探针杂交来检测PCR产物，对于因样品含量较低导致扩增效率较低的突变产物，在电泳条带上可能不能显示。同时，该方法不能对样品所含突变进行定量或半定量分析。

常规PCR方法及ARMS法都不能解决假阳性的问题。首先，在DNA复制的时候，多聚酶所覆盖的核酸大概有10个碱基，6个碱基是双链（有引物结合的），另外4个碱基是即将要合成的模板序列。所以这6个双链碱基就是多聚酶能否有效结合的关键，也可以理解为引物与模板的结合的空间构象才是聚合酶结合并延伸的关键。在实际的实验中，经常出现3’端错配仍然能延伸的情况。具体地，3’端错配并不能完全阻止延伸反应，尤其在错配模板（如正常序列）与完全匹配的模板（突变序列）比例较大时，假阳性常有发生的原因就是这些引物与模板形成了聚合酶所能识别的空间构象。例如，在某些情况下，虽然3’端是错配，但由于紧邻3’端的碱基结合稳定性比较高，进而将本来应该距离较远的3’端错配硬生生“拉”到了一起，产生了所谓的“临近”效应。其次，有些虽然是错配，但其结合仍然具有相当高的稳定性，例如“G-G”错配。对于这两类情况，一般的PCR方法没有考虑到某些错配在热力学上依然比较稳定的，也能触发PCR延伸反应的情况；而ARMS方法，没有考虑引物与模板结合的后面6个双链碱基区域对DNA聚合酶结合能力的影响，因此现有方法均没有妥善解决假阳性问题。

为了解决上述技术存在的问题，本发明引入了人工突变并考虑了DNA聚合酶的稳定性，基于此全新的引物设计理念，提供了一种加荧光并结合毛细管电泳的阻滞PCR技术方法，可高灵敏度和高选择性地进行突变的定量检测。

本发明涉及基于人工修饰引物的定量突变检测系统(Mutation Detection System by Artificial Modified Primers, AMP-MDS)，其原理图如图1所示。

因此，本发明提供了一种检测突变的方法，所述方法包括如下步骤：

1) 针对要检测的突变，设计外引物和内引物的组合，在所述内引物3’端5个碱基的区域，从3’到5’的方向，依次按照热力学稳定性“高低高低”或者“低高低高”的高低相间模式来引入人工错配；

2) 以引物进行PCR反应，得到配对扩增的产物；

3) 对所述产物进行半定量分析。

在一个具体的实施方案中，所述方法包括如下步骤：

1)  针对要检测的突变，设计一对外引物和一对内引物的组合；

所述外引物位于突变位置两侧的内含子上或跨内含子；

所述两个内引物方向相向，3’端位于突变位置处，一个内引物的3’端和正常碱基互补，另一个内引物的3’端与突变位置的突变碱基互补；

所述两个外引物分别和一个内引物可以配对进行PCR扩增，它们自身也可以进行配对扩增；

荧光加在外引物的5’端，且使用不同颜的荧光染料对两个内引物进行标记；

所述两个外引物配对扩增的产物以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的两个产物的长度差均须在5 bp以上，优选10 bp以上，更优选20 bp以上；

对所述内引物3’端倒数5个碱基的区域引入错配，按照热力学稳定性高低相间的模式，详细原则如下：

如果3’端错配具有一定的稳定性，那么在倒数第三位和第五位可以引入相应的错配（如图2a、b所示）；

如果3’端错配对稳定性具有较低的破坏性，那么则需要根据倒数第二个碱基对的稳定性进一步判断是否应该引入错配（如图2c、d所示）；

如果3’端错配对于稳定性具有较强的破坏性（即稳定性较差），那么不在倒数第三位引入错配，但当倒数第二位是具有较强稳定性的碱基对时例外（如图2e、f所示）；例如，对于AGCGA/TCGCT这一组引物，其热力学稳定性为：_---_（“_”代表低热力学稳定性，“-”代表高热力学稳定性），因此可以在倒数第三位引入错配，其热力学稳定性改为：_-_-_，同时将倒数第四位也引入错配作为备选引物，其热力学稳定性为：___-_；这里用热力学稳定性高低来反映引物与模板的结合能力强弱；低热力学稳定性是指引物与模板结合能力弱，不稳固，例如含有两个氢键的AT配对，或者AC，AG等错配；高热力学稳定性是指引物与模板结合能力强，比较稳固，如含有三个氢键的CG配对。

内、外引物保持解链温度尽量一致，例如相差6摄氏度以内，优选4摄氏度以内，更优选2摄氏度以内；

内、外引物GC含量尽量保持一致，例如相差20%以内，优选15%以内，更优选5%以内；

内、外引物长度尽量保持一致，例如相差6 nt以内，优选4 nt之内；

内、外引物自身不能形成发卡结构；

内、外引物之间不能形成二聚体，发生非特异扩增；

2）以步骤1）的引物进行PCR反应，得到所述两个外引物配对扩增的产物1以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的产物2和产物3；

3）将上述产物通过荧光毛细管电泳进行半定量分析，其中在产物1、产物2和产物3满足均有明显峰值时，表示在突变位置有突变碱基；进一步将每一个峰值与标准品的峰值进行比值处理，即可对突变碱基的含量和正常碱基的含量进行半定量比较。

在本发明中，热力学稳定性高低是用来反映引物与模板的结合能力强弱的；低热力学稳定性是指引物与模板结合能力弱，不稳固，例如含有两个氢键的AT配对，或者AC，AG等错配；高热力学稳定性是指引物与模板结合能力强，比较稳固，如含有三个氢键的CG配对。例如，对于AGCGA/TCGCT这一组引物，其热力学稳定性为：_---_（“_”代表低热力学稳定性，“-”代表高热力学稳定性），因此可以在倒数第三位引入错配，其热力学稳定性改为：_-_-_，同时将倒数第四位也引入错配作为备选引物，其热力学稳定性为：___-_。

本发明的技术优势如下：

1)  本方法通过基于PCR的技术检测突变，具有很高的灵敏度，低至5-10个拷贝即可准确检测。

2)  本方法通过在引物3’端5个碱基的区域引入一个或者一个以上的人工突变，一方面保证了DNA聚合酶结合的稳定性，另外一个方面又极大的提高了选择性。

3）通过在引物5’端加荧光以及通过荧光毛细管电泳来检测PCR产物，来进一步提高选择性，总体选择性在10-4-10-5之间。

4)  本方法设计的外引物位于内含子区域，通过在引物5’端添加荧光染料、避免引入额外的探针，进一步增加了特异性，降低了假阳性率。

5)  本方法结合荧光毛细管电泳技术，可实现对样品突变的半定量分析。

6)  本方法过程简单，仅包含两步，即PCR过程和毛细管电泳，因此检测速度快，整个过程仅需不到1小时。

图1示出：基于人工修饰引物的定量突变检测的原理图。

图2示出：引物3’端5个碱基区域人为引入错配的引物设计原理图。

除3’端最后一个碱基的错配是根据突变位点而设计的，其它的错配为人为引入，引入错配具体原则为：

如果3’端错配具有一定的稳定性，那么在倒数第三位和第五位可以引入相应的错配（a、b）；

如果3’端错配对稳定性具有较低的破坏性，那么则需要根据倒数第二个碱基对的稳定性进一步判断是否应该引入错配（c、d）；

如果3’端错配对于稳定性具有较强的破坏性，那么不建议在倒数第三位引入错配，但当倒数第二位是具有较强稳定性的碱基对时，则可以考虑（e、f）。

箭头标示热力学稳定性，长箭头表示高稳定性碱基对，短箭头则表示低稳定性碱基对，x表示错配且对稳定性破坏较低，X表示错配且对稳定性破坏较大，x及其上箭头表示虽然是错配，但仍然具有一定的稳定性。

图3示出：毛细管电泳检测的阳性和阴性结果对照示例图。

图4示出：PCR-测序法灵敏度实验结果峰图。

图5示出：基于人工修饰引物的定量突变检测的产物电泳图示例。

图6示出：利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测0%、0.02%、0.2%、2%、10%、20%、50%和100%的人肺癌组织EGFR基因L858R点突变标准品的毛细管电泳荧光峰图结果。

图7示出：利用PCR测序法、AMRS法、AMP-MDS法进行EGFR基因的L858R突变检测的准确率。

本发明涉及一种基于人工修饰引物的定量突变检测系统(Mutation Detection System by Artificial Modified Primers, AMP-MDS)。为了合理地估计引物与模板结合的3’端对DNA聚合酶结合的影响，兼顾稳定性与特异性，我们重点考虑在3’端5个碱基的区域引入错配，一方面保证必要的稳定性以利于DNA聚合酶结合，对DNA结合有重要影响的是3’端6个碱基。这里采用保守的做法，取5个碱基进行人工干预；另一方面，根据配对具体情况，适当引入错配，避免造成稳定性过高的3’端所引起假阳性结果。和传统方法相比，本发明的方法的创新之处是在引物3’端5个碱基的区域按照热力学稳定性高低相间的模式引入一个或者一个以上的人工突变的引物设计理念，既考虑了某些错配亦稳定的事实，也考虑了对DNA聚合酶的影响；最后并结合了毛细管电泳技术，使之可高灵敏度和高选择性地进行突变的定量检测。