一种固定化酶法耦合膜技术制备羟基酪醇的方法

一种固定化酶法耦合膜技术制备羟基酪醇的方法

技术领域

本发明涉及植物中有效成分的制备方法，具体设计羟基酪醇的提取制备方法。

背景技术

3,4-二羟基苯乙醇（羟基酪醇）的分子式维C₈H₁₀O₃，结构式

是一种天然的多酚类化合物，它主要是以酯化物橄榄苦甙的形式存在于橄榄的各个部位，橄榄苦甙经过水解后可得到游离的羟基酪醇。研究发现羟基酪醇具有很多有益于人体健康的生物药理活性，近年来深受生物和医学界的重视。

羟基酪醇在橄榄中主要是以橄榄苦甙的形式存在，橄榄苦甙在橄榄各个部位都占有相当的比例，在干燥的橄榄叶子中占6%~9%(质量分数)，也是橄榄果实具有强烈库位的原因。在橄榄油加工过程中，为出去橄榄油中的酸涩味道，水解橄榄苦甙后得到多酚类化合物，羟基酪醇是这些酚类混合物的主要成分。目前羟基酪醇主要是从橄榄果、叶以及在制备橄榄油过程中产生的残渣和废水中分离出来的。而羟基酪醇的纯化主要采用谱分离的方法，如硅胶柱、离子交换柱。如公开号为CN1665764的发明专利，公开了一种制备富含羟基酪醇的组合物的方法，包括①用橄榄制备植物液；②将酸加入植物液中，由此制得算话的植物液；③将酸化的植物液培养一段时间直至植物液中原先存在的油橄榄苦甙（环烯醚萜类葡糖苷油橄榄苦甙）有至少50%转化成羟基酪醇，其中所说的一段时间至少为2个月，通常为2~12个月。虽然该方法可以使植物液中原先存在的油橄榄苦甙的90%转化为羟基酪醇，但完成这一转化需要花费的时间太长，导致生产周期长，不适于工业化生产。又如公开号为CN10129811的发明专利，公开了一种从橄榄提取物液中提取羟基酪醇的方法，包括如下步骤：①将橄榄提取液加入去离子水稀释；②过聚乙烯类树脂层析柱，用去离子水冲洗，弃去前300mL~500mL的流出液，然后开始收集透明洗脱液；③浓缩所述透明洗脱液，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层浓缩，回收乙酸乙酯，浓缩汁不能再浓缩，得浅橘黄胶状物；④将浅橘黄胶状物进行分子蒸馏，得到羟基酪醇粗品。该发明所得产品的纯度较高，也较大程度的保持了天然物的原有品质，但该方法并没有将橄榄提取液中油橄榄苦甙转化成羟基酪醇这一步骤，只是将提取液中单独存在的羟基酪醇提取分离出来而已，因此该申请的得率比较低。公开号CN101973853的发明专利，公开了一种生产周期短、成本低且原料多样化的羟基酪醇的提取方法，包括如下步骤：①玄参科、木犀科、冬青科、金丝桃科、紫草科或马鞭草科和橄榄科橄榄属植物为原料，制备提取液；②取上述提取液，加入浓盐酸，煮沸2~4h水解，水解液过大孔吸附树脂，用10~30%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得到羟基酪醇。该发明虽然将提取液算话后通过煮沸工序实现羟基酪醇的转化，并缩短了转化时间，但高温煮沸破坏了羟基酪醇的分子结构，因此是羟基酪醇的纯度和得率偏低。目前的技术还不能大量的将羟基酪醇从含有不同分子量的多酚类化合物的废水中萃取并分离出来。

羟基酪醇因其特殊的生物和药理活性，用途十分广泛。在食品工业中，可作为天然的防腐剂，防止食品的氧化变质；在营养保健领域，可作为营养补充剂、抗菌剂，添加到各种食品中；还可以添加到化妆品中，利用其捕捉自由基的能力，减少紫外线对皮肤的损伤作用，延缓皮肤老化。

目前国外已经相继有羟基酪醇的胶囊、片剂和粉末产品问世：Life Extension（延寿机构）的注册商标产品为Polyphen-oil^TM（颗粒）；Indena公司的产品为Oleaselect^TM（片剂）；西班牙公司的Genosa的产品为Hytolive^TM（颗粒）；法国Seppic公司的产品Prolivols^TM（片剂）；CreAgri公司和荷兰帝斯曼（DSM）公司合作开发了HIDROX^TM（干粉）。除了将羟基酪醇作为一种营养性、功能性的物质直接使用以外，对于其一些衍生物，如橄榄苦甙、羟基酪醇的乙酰化衍生物，带有多不饱和脂肪链的衍生物等的应用研究也不断进行。这对于不断增加羟基酪醇的应用具有很重要的促进作用。

发明内容

本发明是采用酶法耦合膜技术制备羟基酪醇的方法。采用该方法制备羟基酪醇，转化率高、收率高。本发明采用以下技术方案：

①制备橄榄提取液，所述原料为橄榄科橄榄属植物的果肉、茎或叶；

②取上述任一种提取液，加入固定化糖苷酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，50~55℃水浴反应2~4h。

③膜过滤水解液。

④浓缩，喷雾干燥，得到羟基酪醇。

在本发明所述的羟基酪醇的制备方法中，所述步骤②中加入的固定化糖苷酶，选用海藻酸钠为载体，与戊二醛交联后，将糖苷酶包埋成球状固定化酶。

在本发明所述的羟基酪醇的制备方法中，所述步骤③进一步包括使用微滤膜、超滤膜和纳滤膜过滤所述提取液。

与现有技术相比，本发明采用固定化酶水解提取液，与酸水解液比较，结果表明酸水解会产生较多的副产物，且橄榄苦甙没有被完全转化；而固定化酶水解，专一性强，橄榄苦甙可被完全转化为羟基酪醇，酶解条件温和，提高了羟基酪醇的收率。此外，酶的固定化起到保护酶的作用，为酶的重复利用提供了可能。从整个制备过程中缩短了生产周期，节约了生产成本。

具体实施方式

下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1：

①以橄榄叶为原料，粉碎成粗粉，加入6倍重量的50%乙醇水溶液中，在多功能提取罐中进行动态循环提取，提取两次，每次提取1h，获得提取液；

②浓缩提取液，搅拌均匀进行水沉12小时；

③将上述水沉液体板框过滤，分离获得清亮的滤液；

④滤液中加入10U固定化酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，50℃反应3小时；

⑤将上述水解液，加入到膜P型UF-19膜超滤装置的料液桶中，用截留相对分子量为3万的有机膜，进行连续式的超滤，超滤时物料温度控制在30℃左右，调节回流阀，控制料液出口的压力为100PSI，收集过滤液体；

⑥浓缩至浸膏，喷雾干燥，得到羟基酪醇，纯度40%，收率85%。

实施例2：

①以橄榄叶为原料，粉碎成粗粉，加入6倍重量的30%乙醇水溶液中，在多功能提取罐中进行动态循环提取，提取两次，每次提取1h，获得提取液；

②浓缩提取液，搅拌均匀进行水沉12小时；

③将上述水沉液体板框过滤，分离获得清亮的滤液；

④滤液中加入10U固定化酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，55℃反应2小时；

⑤将上述水解液，加入到膜P型UF-19膜超滤装置的料液桶中，用截留相对分子量为1万的有机膜，进行连续式的超滤，超滤时物料温度控制在30℃左右，调节回流阀，控制料液出口的压力为100PSI，收集过滤液体；

⑥浓缩至浸膏，喷雾干燥，得到羟基酪醇，纯度42%，收率88%。

实施例3：

①以橄榄叶为原料，粉碎成粗粉，加入6倍重量的70%乙醇水溶液中，在多功能提取罐中进行动态循环提取，提取两次，每次提取1h，获得提取液；

②浓缩提取液，搅拌均匀进行水沉12小时；

③将上述水沉液体板框过滤，分离获得清亮的滤液；

④滤液中加入10U固定化酶，加入pH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，52℃反应2.5小时；

⑤将上述水解液，加入到膜P型UF-19膜超滤装置的料液桶中，用截留相对分子量为1万的有机膜，进行连续式的超滤，超滤时物料温度控制在30℃左右，调节回流阀，控制料液出口的压力为100PSI，收集过滤液体；

⑥浓缩至浸膏，喷雾干燥，得到羟基酪醇，纯度45%，收率86%。