甲胎蛋白(AFP)定量测定试剂盒及其检测方法

甲胎蛋白(AFP)定量测定试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清中甲胎蛋白(AFP)含 量的试剂盒及其测试方法。

背景技术

甲胎蛋白(AFP)是分子量为70KD的糖蛋白。正常情况下，在胎儿发育早期由肝脏和卵 黄囊合成，小量由胎儿卵黄素细胞及胎儿胃肠道合成。AFP是最主要的胎儿血清蛋白，出生 后在血清中的含量急速下降，第二年末降至最低值直至成年。临床上发现肝癌细胞和生殖系 肿瘤细胞可以合成AFP，使血清AFP浓度升高，因此血清AFP含量是早期诊断这类肿瘤的重 要指标。非恶性疾病的成人血清AFP升高的情况，主要出现在妊娠女性的第6-9个月，以及 一些肝病患者尤其是出现肝细胞病变者，如肝硬化、急慢性肝炎和肝坏死。妊娠女性AFP值 的异常预示发生唐氏症(Down syndrome)的可能。目前临床上检测AFP的方法主要有放免法， ELISA法，化学发光法等。

过去以放免为代表的甲胎蛋白(AFP)测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力 严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化 学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起 来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放 射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。

磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技 术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法，抗原、抗 体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗 原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统ELISA相比 具有灵敏度高，检测用时少的优点。

发明内容

本发明需要解决的技术问题在于提供一种甲胎蛋白(AFP)定量测定试剂盒及其检测方 法，采用该试剂盒进行AFP检测具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间 和更简便的操作方式。

本发明提供了一种甲胎蛋白(AFP)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有AFP磁分离试 剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，标准品、质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。

所述的磁分离试剂含有标记有抗AFP单克隆抗体的磁性微球。

所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗AFP单克隆抗体。

所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液。

所述稀释液是含有BSA溶液。

所述的标准品及质控品是含有一定量的AFP抗原的BSA蛋白溶液。

所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液。

所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。

本发明甲胎蛋白(AFP)的定量测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

第一步：磁分离试剂的制备过程

一、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制1L：

1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量 水使其完全溶解后，倒入上述容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容 器中，然后在上述1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；

3、调节PH计测量其PH值，调PH，控制PH在7.95-8.05之间；

4、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；

5、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存。

二、磁分离试剂的制备过程

1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗AFP单克隆抗体溶于PH 9.5 的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；

2、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1 的抗体溶液中，置室温90min；

3、将步骤2抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g 下浓缩30min至体积为0.5ml；

4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；

5、每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步 骤4获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；

6、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟；

7、每次加入1.5ml PH 7.20.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清， 重复操作3次；

8、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的AFP磁分离试剂；磁珠保存 液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存。

9、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的比例混匀，即得本发明试剂盒中磁 分离试剂。

第二步：酶反应物制备过程

一、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制1L：

1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl₂0.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl₂0.05g于烧瓶中， 然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；

2、调PH，控制PH在7.35-7.45范围内；

3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中；

4、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得。

二、碱性磷酸酶ALP与抗AFP单克隆抗体的偶联

1、取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1 毫升；

2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟，然 后装入透析袋中，用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液；

3、向步骤3获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0，然后立即 加入2.5mg抗AFP单克隆抗体，室温避光轻轻搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg/ml NaBH ₄溶液，混匀，置4℃下2小时；

4、将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；

5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后3000rpm离心 半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4 的PBS中；

6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析5个小时去除 铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1∶ 100的比例添加1M MgCl₂溶液，即得碱性磷酸酶(ALP)与AFP单克隆抗体的偶联物，最后将 收集到的碱性磷酸酶(ALP)与AFP单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1∶1000的体 积比混合均匀，即得酶反应物。

第三步：

反应增强剂配制步骤，配制1L：

1、称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

2、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解调PH，控制PH在 7.35-7.45之间；

3、称取Mak330.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤。

第四步：

稀释液配制步骤，配制1L：

1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；

3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期 为12个月。

第五步：

校准品和质控品的配制：

校准品浓度分别为2、10、50、200、500ng/ml；质控品浓度分别为10、200ng/ml。

第六步：

清洗浓缩液配制步骤，配制1L：

1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；

2、称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L容器中；

4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；

5、调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；

6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。

第七步：

底物溶液配制步骤，配制1L：

1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na₂SO₃ 0.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；

2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围在 7.95-8.05之间；

3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml， 混匀后即得。

本发明工作原理：本品为夹心法化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一 种检测方法。在标本、校准品和质控品中加入定量的酶标AFP单抗、结合着磁性微粒的AFP 单克隆抗体及稳定增强剂。37℃孵育后，磁性微粒上结合的AFP单克隆抗体与酶标单克隆抗 体分别与AFP分子的不同表位结合，形成“三明治”结构。在外加磁场中直接沉淀，不需离 心即可分离。倒去上清液，清洗沉淀的复合物，然后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用 下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成 发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度，根据标准曲线即可算出样品中的AFP含量。 在检测范围内，发光强度与样本中的AFP浓度成正比。

本发明的主要创新之处在于：

1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系， 与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，同时在出结果时间上相对 现有技术缩短了至少10分钟，并达到了较佳的性能参数。

2、本发明公开了一种新的专用稳定增强剂以及清洗液浓缩液，使得反应过程更加稳定可 靠，实验数据灵敏有效，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本；

3、试剂盒中的磁分离试剂，酶反应物，稳定增强剂，标准品、质控品，清洗液浓缩液、 稀释液以及底物溶液均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供 了有力保障。

具体实施方式

实施例1、

一、磁珠缓冲液配制操作规程：配方见表1，以配制1L为例：

1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量 水使其完全溶解后，倒入上述容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容 器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；

3、调节PH计测量其PH值；用HCl或NaOH调PH，测量其PH在7.95-8.05之间即符合要求；

4、称取BSA(牛血清白蛋白)3g倒入上述容器中；

5、最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95-8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤； 过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存，磁珠缓冲液有效期为12个月；

磁珠缓冲液表1

二、磁分离试剂的制备过程

1、将1.0mg DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)溶于50ul DMSO中，即浓度为20mg/ml；取2mg 抗AFP单克隆抗体(天健生物制药(天津)有限公司，浓度为3.29mg/ml)溶于PH 9.5的 0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；

2、计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/C_DSS)，其中C_DSS 指代DSS的物质的量浓度mol/L；

3、用移液吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；

4、将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机 中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；

5、取0.5ml磁珠，磁珠浓度为0.5g/ml，所述的磁珠直径在0.9μm之间，加入5ml反应杯 中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；

6、每次加入1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将 步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；

7、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37度15分钟，其中TRIS的加样量为1mg抗体加0.15mlTRIS；

8、每次加入1.5ml PH 7.20.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清， 重复操作3次；

9、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的AFP磁分离试剂；磁珠保存 液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存。

10、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的比例混匀；

11、贴好标签于2-8℃冷库贮存，磁分离试剂有效期为12个月；

实施例2

一、酶反应物稀释液配制操作规程：配方见表2，以配制1L为例：

1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl₂ 0.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl₂ 0.05g于烧瓶中； 然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；

2、用HCl或NaOH调PH，测量使PH在7.35-7.45范围内；

3、称取BSA 3g倒入上述容器中；

4、最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤； 过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月；

酶反应物稀释液表2

二、碱性磷酸酶(ALP)与抗AFP单克隆抗体的偶联

1、取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到Centriprep YM10浓缩管中，3000RPM离心大 约20分钟，浓缩至1毫升。

2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟，然 后装入透析袋中，用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液；

3、向步骤2获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0～9.5，然后 立即加入2.5mg抗AFP单克隆抗体(天健生物制药(天津)有限公司，浓度为3.29mg/ml)， 室温避光轻轻搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg/ml NaBH₄(硼氢化钠)溶液，混匀，再 置4℃下2小时；

4、将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；

5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后3000rpm离心 半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的 PBS中；

6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时去 除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1∶100的比例添加1M Mgcl₂溶液，即得碱性磷酸酶(ALP)与AFP单克隆抗体的偶联物，最后 将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与AFP单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1∶1000的 体积比混合均匀，即得酶反应物。

实施例3

反应增强剂配制操作规程：配方见(表3)，以配制1L为例：

1、称取TRIS(三羟甲基氨基甲烷，分子式：(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl 4.23g于1L容 器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L 容器中；

2、用量筒量取800ml纯化水于1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；用HCL或NaOH调PH， 测量其范围在7.35-7.45之间；

3、称取Mak330.9g于上述1L容器中；

4、最后定容1000ml，完全溶解后，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um 滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月；

反应增强剂的配制(表3)

实施例4

稀释液配方见(表4)，以配制1L为例：

1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；

3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期 为12个月。

稀释液的配制(表4)

实施例5

校准品和质控品的配制：

1、最高点：最高浓度点为X，目标点浓度为A，B，C，D，E，F，配制V体积的溶液时，需加入原 料的体积为分别为：表5

浓度 加入标准品稀释液体积 加入X体积

A V-A*V/X A*V/X

B V-B*V/X B*V/X

C V-C*V/X C*V/X

D V-D*V/X D*V/X

E V-E*V/X E*V/X

0F V-F*V/X F*V/X

2、甲胎蛋白(AFP)定量测定试剂盒AFP校准品原料(购于天健生物制药(天津)有限公司， 浓度为2.5mg/ml)用稀释液(具体配方见实施例4)配制成浓度点为2、10、50、200、500ng/ml； 质控品用稀释液配制的浓度点为10、200ng/ml。

3、完全溶解后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。

实施例6：

清洗浓缩液配制操作规程：配方见(表6)，以配制1L为例：

1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；

2、称取5g Tween-20于100ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；

3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L容器中；

4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；

5、用HCL或NaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；

6、最后定容1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，完全溶解后用0.2um滤 器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月；

清洗浓缩液的配制(表6)

实施例7

底物溶液配制操作规程：配方见(表7)，以配制1L为例：

1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na₂SO₃0.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；

2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用HCl或NaOH调PH， 测量其范围在7.95-8.05之间；

3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml， 混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。

化学发光底物的配制(表7)

本发明的测试方法如下

1、加15μl AFP标准品、质控品、待测标本至对应试管底部。

2、加45μl酶反应物至每一试管中。

3、加45μl反应增强剂至每一试管中。

4、加30μl磁分离试剂至每一试管中。

5、用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴30分钟。

6、试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转 分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去 粘在管壁上的所有液滴。

7、清洗液浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μl稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混 匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底。

8、重复步骤6、7、6一遍。

9、加200μl底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。

10、如遇到高值HOOK样本，为了避免出现高值HOOK效应，建议临床医师根据其余测试指标 选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。

临床试验：

1、检测数据

标本采自1500例正常体检、供血者。样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病，半 年内无输血和大手术史，妇女不在妊娠期和哺乳期。将测值进行统计学分析，得出正常血清 参考范围：＜25.00ng/ml。与国外知名公司生产的试剂盒的检测结果相比，本发明试剂盒更 加精确，精确到小数点后两位。

本数据仅供参考，不同地区、不同个体以及采用不同方法进行检测，所测得的AFP水平 也会有所不同，建议各实验室建立自己的正常值范围。不可仅凭本方法得出的AFP值作出诊 断，仅作为中间数据参考作用，应结合临床其他资料分析结果，包括病人的具体情况和 状况。通过其他方法得到的样品中的AFP浓度值与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。 超出试剂盒测定范围的样本，系统将无法给出确切的数值。如欲测定其确切的结果，建议稀 释后再进行测定。本试剂盒的检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据， 为达到诊断目的，此检测结果要与临床检查、病史和其它的检查结合使用。本品可用于血清 样本的测定，用于其他体液样本中AFP浓度测定的可靠性未得到充分确认。

2、本发明试剂盒性能指标

分析灵敏度定义为：对20次零标准品的测定，取其2倍的平均偏差，其在标准曲线上所 对应的浓度即为分析灵敏度；

分析灵敏度：0.30ng/ml

精密性：批内变异CV％≤10.0％；批间变异CV％≤13.0％

线性系数：r≥0.9900

线性范围：0.30-300ng/ml

特异性：测定1000μg/L的AFP，干扰度＜0.03％。