一种无创产前诊断先天性耳聋遗传病的方法

本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种以微阵列基因芯片技术为平台技术的无创产前诊断先天性耳聋遗传病的方法。 

聋病是影响人类健康和造成人类残疾的常见原因，我国现有2000多万聋哑人，占残疾人总数1/3，并以每年新生儿3万的速度增长。耳聋发生的原因、是否具有遗传性、生育或再次生育是否安全，是耳聋患者及耳聋家庭极为关心的问题。据各国统计，有1/2000(0.05％)一1/1000(0.1％)的儿童出生时为极重度耳聋；同时，一半以上的儿童期耳聋是由于遗传因素造成的。另外在大量的迟发性听力下降患者中，亦有许多患者由自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多态性造成对致聋环境因素易感性增加而致病。 

在遗传性耳聋中，有70％为NSHI(nonsyndromie hearingim pairment非综合征型耳聋)，大约75％～85％的NSHI表现为常染体隐性遗传模式，15％～24％为常染体显性遗传模式，其余1％～2％为X连锁遗传模式。随着人类基因组计划的完成以及对耳聋疾病致病机制的研究不断深入，遗传性耳聋的病因学研究有了很大进展，目前至少有60余个耳聋基因被克隆，这些发现提示我们遗传性耳聋具有很高的遗传异质性，遗传性耳聋的基因诊断涉及到多个基因的检测，从而加重了遗传性耳聋分子诊断的难度。 

大量的研究表明，GJB2、SLC26A4(PDS)和线粒体基因(mtDNA)的病理性突变导致了大部分的遗传性耳聋，并被证明是中国聋哑人三种最常见的致聋基因突变。利用基因诊断技术对这三个常见基因检测，可在大约70％的遗传性耳聋患者发现致聋基因突变，这不仅可以耳聋患者明确病因，还使耳聋的遗传咨询与产前诊断成为可能。这不仅使耳聋患者明确病因，还为耳聋的遗传咨询提供了理论依据及科学手段，使先天性耳聋产前诊断结果更客观准确。 

目前，可用于先天性耳聋产前诊断的技术主要有聚合酶链式反应、荧光原位杂交及基因芯片等技术。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)该技术是分子实验室重要的诊断技术之一，在体外扩增DNA片段用于遗传学分析，包括巢式PCR、多重PCR、荧光PCR、荧光定量PCR等。主要用于由于基因缺失而引起的疾病的诊断和多态性分析，即在致病基因附近寻几个与其紧密连锁的DNA多态性位点，通过连锁分析进行诊断和携带者检测。 但是PCR技术受到扩增效率、等位基因脱扣、污染的可能的影响可能导致误诊，并且PCR仅能检测已知的异常。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)该技术是利用荧光素标记的探针与DNA片段特异性杂交，探针与特异DNA片段结合形成的杂交分子可以在荧光显微镜荧光激发下显示荧光信号，依据判定信号的有无及类型达到诊断染体病的目的。此方法无需细胞培养，仅24小时即可得到结果，污染机率小、信号直观、检测时间短，应用较广泛。荧光原位杂交的探针包含以下几种：着丝粒探针(combining centromere probe，CEP)、位点特异性探针(focus-specific probe，LSI)、端粒探针(telomere probe，Tel)、全染体涂抹探针(whole chromosome probe，WCP)和跨断裂点探针(span break-point probe)。应用不同类型的探针可以筛查先天性耳聋疾病基因携带者进行遗传学诊断。 

PCR及FISH技术即成为大家公认并相继使用的方法。但是这两种方法都存在本身的缺陷，PCR仅可检测已知的异常。荧光原位杂交技术是利用荧光素标记的探针与染体特异性杂交，依据显微镜观察荧光信号判定结果正常与否，信号直观、检测时间短。但是由于检验的样本来源极为有限，通常仅有1-2个卵裂球细胞。FISH技术仅可检测少量染体及基因。然而先天性耳聋疾病的发生涉及多条染体的多个基因，FISH技术并不能满足产前先天性耳聋筛查的需要。 

基因芯片技术是指将特定寡核苷酸片段作为探针固定于支持物上，掺入标记物的目的DNA片段通过PCR等技术扩增后，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过信号检测系统对芯片进行扫描，并配用相关分析软件对每一探针上的信号作出比较和检测。目前该技术在疾病检测领域已得到了广泛的应用。通过检测孕妇及其配偶常见遗传性耳聋致病基因突变携带情况，可早期发现遗传性耳聋生育风险，结合产前诊断有效降低遗传性耳聋的发病率。相对PCR扩增测序等方法，遗传性耳聋基因芯片检测具有结果可信度高、通量大、速度快、可操作性强等优点，适用于遗传性耳聋产前基因检测。 

传统的先天性耳聋诊断方法需要对孕17-20周的孕妇进行羊水穿刺，对羊水细胞及羊水培养细胞进行相应耳聋基因全序列扩增测序，从而对夫妇双方携带先天性耳聋致病基因进行检测，并进行遗传性耳聋生育风险评估。这大大的加大了检测的时间，并给受检测者带来了精神和身体上的双重痛苦，不适用于产前诊断。因此，寻一种高灵敏度的无创产前诊断先天性耳聋遗传病的方法是非常必要的。 

本发明的内容在于克服现有技术的不足，提供一种以基因芯片技术为平台技术的无创产 前诊断先天性耳聋遗传病的方法。本发明诊断先天性耳聋遗传病的诊断技术操作步骤简便，具有高通量的特点，可以快速筛查先天性耳聋相关基因的变异，并将先天性耳聋疾病的诊断提高到基因水平上；检测的特异性好，且具有高分辨率、高灵敏度、准确、快速的特点，采用无创产前诊断技术，节约成本时间，减少病人痛苦。能用于产前先天性遗传病的诊断，在无创产前诊断领域具有很大的潜力。 

本发明的技术方案是通过如下的技术方案实现的。 

第一方面，本发明涉及一种分布如表1-1所示的核苷酸序列的微阵列基因芯片，包括微阵列芯片的片基及固定在片基上的检测先天耳聋相关基因的探针。 

优选地，所述的探针的序列如表1-1所示： 

表1-1.探针序列 

序号 探针名称 序列(5’-3’)

P1 mtDNA-W1 AGTACAGCGTCAAAGATGTAATGAG

P2 mtDNA-M1 TAAAACTTTCTTTATGCACCCTACTA

P3 mtDNA-W2 AGTACCATGATGATACCGGAA

P4 mtDNA-M2 GAATGCACAATCATGATGATACCGG

P5 SLC26A4-1-W1 CAGACTTTGCTCGAACATTAAACAG

P6 SLC26A4-1-M1 TCCACATTTATTGTTTAATTAATTA

P7 SLC26A4-1-W2 ATGCTTTCGATTTAAATGGTGAT

P8 SLC26A4-1-M2 TCTGTGATCGAAAAGTAATGAGC

P9 SLC26A4-2-W1 TCAACAGCTCTAACTTGCAACC

P10 SLC26A4-2-M1 AAATAAATTGTTTAATTGGTTACA

P11 SLC26A4-3-W1 AACATCGCATTGTCGTGTTGCCTGT

P12 SLC26A4-3-M1 GAGTACCTGAGTAATGTCTGGTGCA

P13 GJB2-W1 TGCACCAATCACTCAGGTACTCCGA

P14 GJB2-M1 CTGACACGGGCACTCTTCGC

P15 GJB2-W2 CGTCGAATACTTCGAARAGAAGA

P16 GJB2-M2 TTGCTGCAGCTAGTCTTAGCTTCG

。 

优选地，所述的片基为载玻片，硅片或膜。 

优选地，所述的片基的材质为高分子材料。 

第二方面，本发明涉及前述的微阵列基因芯片的制备方法，包括如下步骤：片基的酸碱预处理，醛基化处理，异硫氰酸化处理，芯片探针的设计，探针的点制，立即将玻片在80℃烘烤10min，制成微阵列玻片，存储在带有干燥剂的盒子里，室温保存，即得。 

第三方面，本发明涉及前述的微阵列基因芯片的操作步骤，包括如下步骤：待测DNA制备，多重PCR扩增，产物标记，芯片杂交，数据处理和图像分析，芯片扫描，获得结果。 

优选地，扩增所需要的扩增引物如表1-2所示： 

表1-2.扩增所需要的扩增引物 

第四方面，本发明涉及一种微阵列基因芯片无创产前诊断先天性耳聋遗传病的试剂盒，所述的试剂盒包括前述的微阵列基因芯片。 

本发明的基于孕妇外周血的cf-fDNA的无创产前诊断先天性耳聋遗传病微阵列芯片，是以待测孕妇外周血的cf-fDNA(胎儿与母体游离DNA混合物)为模板进行多重PCR扩增，将得到的PCR扩增产物后，与芯片进行杂交，根据杂交结果确定胎儿是否携带有先天耳聋相关基因。 

本发明具有如下的有益效果：本发明所述的无创产前诊断先天性耳聋遗传病的诊断方法简便，只需通过将待测DNA通过PCR扩增后，与芯片杂交并扫描分析即可获得结果；检测具有高通量的特点，可以快速筛查先天性耳聋相关基因的变异，并将先天性耳聋疾病诊断提高到基因水平上；检测的特异性好，且具有高分辨率、高灵敏度、准确、快速的特点，采用无创产前诊断技术，节约成本时间，减少病人痛苦。 

图1为胎儿混合携带有耳聋突变基因mtDNA-1、SLC26A4和GJB2的扫描图。 

图2为胎儿未携带有任何先天性耳聋相关基因的扫描图。 

图3芯片探针顺序示意图 

下面结合具体实施例，进一步阐释本发明。应理解为，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的具体实施范围。下例实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见NEW YＯRK CＯLD Spring harbor laboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

本发明的微阵列芯片采用一种以基因芯片技术为平台技术的无创产前诊断先天性耳聋遗传病的方法，诊断人中常见的先天性耳聋的现象，以如表1-2所示的核苷酸序列为探针。每个芯片上共20条探针，所述微阵列所述先天性耳聋三个相关基因八个相关突变位点的野生型和突变型的16条探针，探针序列及名称见表1-1。阳性质控探针2条，阴性质控探针1条，空白对照探针1条。所述探针名称如表用专门的仪器即点样仪将20条探针点样至覆盖特定介质的玻片上，按照在先后顺序，每条探针重复三次，靶点顺序见图3所示。对样品进行制备，多重PCR扩增，芯片杂交后，按照所相应位点的荧光信号值大小，判断该待测样本是否携带先天性耳聋相关基因。 

本发明涉及前述的微阵列基因芯片的制备方法，包括如下步骤：片基的酸碱预处理，醛基化处理，异硫氰酸化处理，芯片探针的设计，探针的点制，立即将玻片在80℃烘烤10min，制成微阵列玻片，存储在带有干燥剂的盒子里，室温保存，即得。 

本发明的具体操作步骤 

1.待测DNA制备及扩增 

准备血浆样品，并采用血液DNA提取试剂盒提取DNA，并利用前面所述的引物进行扩增。 

2.杂交 

将PCR产物及杂交液等比例混匀后在95℃条件下变性10min后，立即置于冰浴中5min，同时将芯片在0.2％SDS中漂洗20s后，再在超纯水中漂洗5s。甩去芯片表面的水，在室温条件下晾干。 

取变性的扩增产物10μl，小心加入芯片反应区中，使其分布均匀(以杂交混合液覆盖杂交反应区且不溢出为准)。将杂交混合液加入芯片反应区时，应注意切不可使头与芯片接触，以免影响探针阵列。将芯片平置于杂交盒中，在待定杂交温度的水浴中杂交1小时。杂交反应时应防止冷凝水滴落在芯片上；移动杂交盒时应小心，以防各反应区的反应液交叉污染。杂交反应结束后，将芯片在SSC洗涤液中漂洗。取出芯片，甩去残留在芯片上的液体，室温晾干。 

3.数据处理和图像分析 

杂交结果采用激光共聚焦基因芯片扫描仪进行扫描，并采用信号分析软件进行分析。 

4.芯片效果验证 

使用上述芯片检测经测序验证为正常人样品20份和mtDNA突变型样品6份、SLC26A4-1突变型样品10份、SLC26A4-2突变型样品8份、SLC26A4-3突变型样品5份，GJB2突变型样品7份，共计56份(包括混合病例)，检测结果均与直接测序结果一致，证明了本发明的芯片检测耳聋基因突变时具备特异性。