测量酶活性的新方法与流程

1.本公开涉及一种在诸酶、尤其诸多葡聚糖蔗糖酶当中选择对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶的方法及一种测量其活性的方法。

背景技术：

2.葡聚糖蔗糖酶从糖释放葡萄糖，并且与此同时，催化葡萄糖的聚合物聚合反应，因而产生作为聚合物材料的多糖如葡聚糖或低聚糖。另外，诸如甜菊糖(stevia)(甜菊醇糖苷(steviol glycoside))、多酚等物质在底物中存在时，则葡聚糖蔗糖酶从糖释放葡萄糖，原因在于其底物专一性宽，并且随后显示出能够转移葡萄糖至甜菊糖、多酚等的转糖基活性。在这个方面，经转糖基的甜菊糖、多酚等可以具有改善的工业价值，如改善的溶解度、改善的滋味等。
3.葡聚糖蔗糖酶的上述活性通常通过测定还原糖(dns)来测量，所述方法通过测量游离果糖分析多少糖水解成果糖和葡萄糖。然而，上述方法仅可以测量葡聚糖蔗糖酶对糖的水解程度，并且具有它不反映转糖基活性的问题。换言之，当使用dns选择改进型葡聚糖蔗糖酶时，高度有可能仅选择出具有优异糖水解或葡聚糖聚合活性的葡聚糖蔗糖酶，未选出具有优异转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶。
4.但是，即便存在以上问题，在测量葡聚糖蔗糖酶活性方面尚无除dns之外的方法，并且仍需要开发测量葡聚糖蔗糖酶活性的新方法。
5.发明概述
6.技术问题
7.本发明人已经开发了通过测量在借助葡聚糖蔗糖酶进行糖水解反应后游离葡萄糖的量与糖水解反应和转糖基反应后游离葡萄糖的量之间的差异，迅速且高效选择或改进对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶的高速选择方法，因而完成本公开。
8.技术方案
9.本公开提供一种选择对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶的方法，所述方法包括步骤：(i)通过使糖与葡聚糖蔗糖酶反应，确定游离葡萄糖的量；(ii)通过使糖和葡萄糖接纳体的混合物与葡聚糖蔗糖酶反应，确定游离葡萄糖的量；和(iii)比较(i)的游离葡萄糖量与(ii)的游离葡萄糖量。
10.有益效果
11.本公开的方法可以用来通过测量在葡聚糖蔗糖酶进行糖水解反应后游离葡萄糖的量与糖水解反应和转糖基反应后游离葡萄糖的量之间的差异，分析对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶的活性，因而迅速且高效地选择或改进对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的具有优异葡聚糖蔗糖酶活性的酶。
12.附图简述
13.图1显示如相对于对照酶所测量，糖水解反应后游离葡萄糖的量、糖水解反应和转糖基反应后游离葡萄糖的量、以及二者之间的差异；
14.图2显示如相对于实验酶所测量，糖水解反应后游离葡萄糖的量、糖水解反应和转糖基反应后游离葡萄糖的量、以及二者之间的差异；和
15.图3显示根据对照和实验酶的浓度的转糖基模式。
16.发明描述
17.本公开将如下详述。同时，本公开中所披露的每种描述和实施方案也可以适用于其他描述和实施方案。即，本公开中所披露的多种要素的全部组合均落于本公开的范围内。进一步地，本公开的适用范围不受下述具体描述限制。
18.本公开的一个方面提供一种选择对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶的方法，所述方法包括步骤：(i)通过使糖与葡聚糖蔗糖酶反应，确定游离葡萄糖的量；(ii)通过使糖和葡萄糖接纳体的混合物与葡聚糖蔗糖酶反应，确定游离葡萄糖的量；和(iii)比较(i)的游离葡萄糖量与(ii)的游离葡萄糖量。
19.现有的还原糖测定法(dns)有效确认葡聚糖蔗糖酶对糖的水解程度，但是在测量转糖基活性方面存在限制。具体地，在直接确认葡萄糖接纳体是否已经糖基化方面还存在限制，并且因此，本公开以开发一种通过比较游离葡萄糖的量间接确认葡萄糖接纳体糖基化的方法为特征。
20.如本文所用，术语“葡聚糖蔗糖酶”，其为一种分泌自微生物的酶，指这样的酶，所述酶通过从糖释放葡萄糖，并且与此同时通过催化葡萄糖的聚合物聚合反应，产生作为聚合物材料的多糖如葡聚糖或低聚糖，或所述酶显示当葡萄糖接纳体如甜菊糖(甜菊醇糖苷)、多酚等在底物中存在时，能够从糖释放葡萄糖后转移葡萄糖至甜菊糖、多酚等的转糖基活性。
21.如本文所用，术语“对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶”指在上述葡聚糖蔗糖酶当中的一种葡聚糖蔗糖酶，所述酶显示当葡萄糖接纳体如甜菊糖(甜菊醇糖苷)、多酚等在底物中存在时，能够从糖释放葡萄糖后转移葡萄糖至甜菊糖、多酚等的转糖基活性。换言之，如本文所用，“对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶”可以是具有糖水解活性且对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶。
[0022]“葡萄糖接纳体”指向其转移葡萄糖的目标物质，并且在本公开中，葡萄糖接纳体可以是不包括葡萄糖在内的天然产物，具体地是甜菊糖或多酚并且更具体地是甜菊糖。但是，不限制葡萄糖接纳体，只要它是向其转移葡萄糖的天然产物。
[0023]
如本文所用，术语“甜菊糖”指存在于甜叶菊(stevia rebaudiana)叶子中的甜味化合物，甜叶菊为菊科(asteraceae)植物，原产于南美洲。甜菊糖作为甜味剂经常用作代糖，因为它在人体中不代谢且不诱导血糖反应。甜菊糖也称甜菊醇糖苷。
[0024]
就本公开的方法而言，步骤(i)可以是通过使糖与葡聚糖蔗糖酶反应，确定游离葡萄糖的量。
[0025]
可以通过添加各种浓度的葡聚糖蔗糖酶，使葡聚糖蔗糖酶反应，但是不限于此。
[0026]
具体地，在步骤(i)中，将糖作为底物，混合葡聚糖蔗糖酶液并且允许反应，并且随后可以根据反应时间测定因水解产生的游离葡萄糖量。
[0027]
作为测定游离葡萄糖量的方法，可以在无限制情况下使用本领域已知的任何方法。例如，可以使用诸如葡萄糖氧化酶(god)
–
过氧化物酶(pod)测定法、还原糖测定法(dns)、使用折射率检测器(rid)的液相谱法(lc)等的方法。在本公开中，测定游离葡萄糖
量的方法可以是god-pod测定法。
[0028]
就本公开而言，步骤(ii)可以是通过使糖和葡萄糖接纳体的混合物作为底物与葡聚糖蔗糖酶反应，确定游离葡萄糖的量。
[0029]
可以通过添加浓度与步骤(i)中相同的葡聚糖蔗糖酶，使葡聚糖蔗糖酶反应，但是不限于此。
[0030]
具体地，在步骤(ii)中，将糖和葡萄糖接纳体的混合物与葡聚糖蔗糖酶液混合并且允许反应，并且随后可以根据反应时间测定因水解产生的游离葡萄糖的量。
[0031]
测定游离葡萄糖量的方法同上文所述。
[0032]
在本公开中，步骤(i)和(ii)可以依次或同时进行，但不限于此。
[0033]
就本公开的方法而言，步骤(iii)可以是，比较步骤(i)的游离葡萄糖量与步骤(ii)的游离葡萄糖量。
[0034]
具体地，这种比较可以是通过从步骤(i)的游离葡萄糖量扣减步骤(ii)的游离葡萄糖量来比较。
[0035]
在本公开中，选择可以是在诸葡聚糖蔗糖酶当中选择对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶，但不限于此。
[0036]
具体地，就本公开的方法而言，在步骤(iii)中，将步骤(i)的游离葡萄糖量与步骤(ii)的游离葡萄糖量比较，并且作为结果，如与步骤(i)的游离葡萄糖量相比，步骤(ii)的游离葡萄糖量减少时，则确定葡聚糖蔗糖酶为对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶，并且因此可以选择该葡聚糖蔗糖酶作为对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶。
[0037]
进一步地，就本公开的方法而言，在步骤(iii)中，将步骤(i)的游离葡萄糖量与步骤(ii)的游离葡萄糖量比较，并且作为结果，当步骤(i)的游离葡萄糖量类似于步骤(ii)的游离葡萄糖量时，可以确定葡聚糖蔗糖酶为对葡萄糖接纳体没有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶。
[0038]
在本公开中，选择可以是选择对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶，但不限于此。选择还可以包括测量其活性，但不限于此。
[0039]
具体地，就本公开的方法而言，在步骤(iii)中，将步骤(i)的游离葡萄糖量与步骤(ii)的游离葡萄糖量比较，并且作为结果，如与步骤(i)的游离葡萄糖量相比，步骤(ii)的游离葡萄糖量减少时，则可以确定该葡聚糖蔗糖酶为对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶。因此，有可能选择对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶。
[0040]
进一步地，就本公开的方法而言，在步骤(iii)中，将步骤(i)的游离葡萄糖量与步骤(ii)的游离葡萄糖量比较，并且作为结果，如与步骤(i)的游离葡萄糖量相比，步骤(ii)的游离葡萄糖量减少，且量的减少水平随葡聚糖蔗糖酶浓度增加而升高或高于其他葡聚糖蔗糖酶的那些水平时，则可以借助量的减少水平测量葡聚糖蔗糖酶的转糖基活性。
[0041]
也就是说，当步骤(ii)的游离葡萄糖量的减少水平高于步骤(i)的游离葡萄糖量时，则确定葡聚糖蔗糖酶的转糖基活性高，并且因此可以比较和/或测量彼此不同的葡聚糖蔗糖酶的转糖基活性。
[0042]
步骤(i)的水解反应以及步骤(ii)的水解反应和转糖基反应可以在1小时以内进行，但不限于此。然而，取决于酶，当水解反应和转糖基反应甚至在1小时后继续时，这些反
应可以在特定时间限制以内进行。
[0043]
在本公开中，具有糖水解高活性和转糖基低活性、同时具有多糖聚合高活性的葡聚糖蔗糖酶通过糖水解后释放葡萄糖(a)，增加游离葡萄糖的量。然而，当添加葡萄糖接纳体(甜菊糖，多酚)(b)时，葡萄糖仍类似于反应器中的(a)，因为用于转糖基中的葡萄糖的量非常少，并且因此(a)-(b)的值趋近0(图3，左侧)。然而，具有糖水解高活性和转糖基高活性、同时具有多糖聚合低活性的葡聚糖蔗糖酶通过糖水解后释放葡萄糖(a)，增加游离葡萄糖的量，并且当添加葡萄糖接纳体(甜菊糖，多酚)(b)时，游离葡萄糖被转移至葡萄糖接纳体，并且因此可以提出(a)-(b)的值作为转糖基葡萄糖的量。在这个方面，观察到随着针对葡萄糖接纳体(甜菊糖，多酚)的转糖基活性增加，(a)
–
(b)的值亦增加(图3，右侧)。
[0044]
因此，可以如上文所述通过完成葡聚糖蔗糖酶的(a)糖水解和(b)多糖聚合或转糖基反应后检查游离葡萄糖量的差异，区分并选择具有葡聚糖蔗糖酶活性的酶。
[0045]
发明的具体实施方案
[0046]
下文将参考实施例更详细地描述本公开。但是，这些实施例仅用于示意目的，并且本领域技术人员显而易见，本公开的范围不意在受这些实施例限制。
[0047]
实施例1：使用糖水解后游离葡萄糖量与糖水解和转糖基后游离葡萄糖量之间的差异评估糖基转移酶活性
[0048]
将具有不同葡聚糖蔗糖酶活性(0.5u/ml、1.0u/ml、2.0u/ml、3.0u/ml，基于还原糖测定法(dns))的酶液各自添加至200mm糖溶液并且进行水解，并且随后首先测定游离葡萄糖的量，并将具有不同葡聚糖蔗糖酶活性的酶液分别添加至含有200mm甜菊糖的同浓度(200mm)糖溶液，并且进行水解和转糖基，并且随后测定游离葡萄糖的量。假定两个已测定量之间的差异是纯的转糖基葡萄糖的量，则检查是否可以评估该酶的转糖基活性。
[0049]
详细地说，将单独的糖底物和每种对照或实验性葡聚糖蔗糖酶酶液(0.5u/ml至3.0u/ml)混合并且允许反应，并随后根据每个反应时间，通过god(葡萄糖氧化酶)
–
pod(过氧化物酶)测定法首先测定因水解产生的游离葡萄糖的量(1)。进一步地，将糖与甜菊糖的底物混合物和每种对照或实验性葡聚糖蔗糖酶酶液(0.5u/ml至3.0u/ml)混合并且允许反应，并根据每个反应时间，通过god-pod测定法测定因水解和转糖基产生的游离葡萄糖的量(2)。此后，从(1)的测定值扣除(2)的测定值，并且检查转糖基葡萄糖的量是否具有依赖酶浓度的模式。此时，使用具有糖水解活性、同时具有转糖基低活性和多糖聚合高活性的肠膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)atcc 13146衍生的葡聚糖蔗糖酶作为阴性对照组，并且使用具有糖水解活性、同时具有转糖基高活性和多糖聚合低活性的马里乳杆菌(lactobacillus mali)dsm20444衍生的葡聚糖蔗糖酶作为实验组。
[0050]
实施例2：对照酶所致糖水解后游离葡萄糖量与糖水解和转糖基后游离葡萄糖量之间的差异
[0051]
在使用肠膜明串珠菌atcc 13146衍生的葡聚糖蔗糖酶的糖水解反应后，首先通过god(葡萄糖氧化酶)
–
pod(过氧化物酶)测定法测定游离葡萄糖的量(1)。在使用糖与甜菊糖的底物混合物的水解/转糖基反应后，随后测定反应混合物中游离葡萄糖的量(2)。(1)-(2)的值预计是转糖基反应中所用的葡萄糖的量，并且(1)的值和(2)的值彼此相似，这表明(1)-(2)的值接近于0(表1)。
[0052]
详细地说，具有糖水解活性、同时具有转糖基低活性和多糖聚合高活性的对照葡
聚糖蔗糖酶未显示糖水解后游离葡萄糖量与糖水解和转糖基后游离葡萄糖量之间有差异(表1)，表明无根据活性和反应时间的模式(表2和图1)。因糖水解产生的游离葡萄糖立即作为多糖聚合反应的底物使用，并且因此检出反应混合物中游离葡萄糖的量为低。
[0053]
[表1]
[0054][0055][0056]
[表2]
[0057][0058]
实施例3：实验酶所致糖水解后游离葡萄糖量与糖水解和转糖基后游离葡萄糖量之间的差异
[0059]
在使用马里乳杆菌dsm20444衍生的葡聚糖蔗糖酶的糖水解反应后，首先通过god(葡萄糖氧化酶)
–
pod(过氧化物酶)测定法测定游离葡萄糖的量(1)。在使用糖与甜菊糖底物混合物的水解/转糖基反应后，随后测定反应混合物中游离葡萄糖的量(2)。(1)-(2)的值预计是转糖基反应中所用的葡萄糖的量，并且观察到随着转糖基活性高，(1)-(2)的值升高(表3)。
[0060]
详细地说，具有糖水解高活性和转糖基高活性、同时具有多糖聚合低活性的葡聚糖蔗糖酶显示根据每种酶活性1小时反应时间的清晰模式(表4和图2)。
[0061]
[表3]
[0062][0063][0064]
[表4]
[0065][0066]
实施例4：使用糖水解后游离葡萄糖量与糖水解和转糖基后游离葡萄糖量之间的差异评估糖基转移酶活性的重现性
[0067]
为评估实施例1的重现性，通过变动甜菊糖浓度和酶浓度进行实验。将具有不同葡聚糖蔗糖酶活性(0.5u/ml、1.0u/ml、3.0u/ml、5.0u/ml，基于还原糖测定法(dns))的酶液各自添加至200mm糖溶液并且进行水解反应，并且随后首先测定游离葡萄糖的量，并将具有不同葡聚糖蔗糖酶活性的酶液分别添加至含有100mm甜菊糖的同浓度(200mm)糖溶液，并且进行水解反应与转糖基反应，并且随后测定游离葡萄糖的量。假定两个已测定量之间的差异是纯的转糖基葡萄糖的量，则检查是否可以评估酶的转糖基活性。
[0068]
详细地说，将单独的糖底物和每种对照或实验性葡聚糖蔗糖酶酶液(0.5u/ml至5.0u/ml)混合并且允许反应，并随后根据每个反应时间，通过god(葡萄糖氧化酶)
–
pod(过氧化物酶)测定法首先测定因水解产生的游离葡萄糖的量(1)。进一步地，将糖与甜菊糖的底物混合物和每种对照或实验性葡聚糖蔗糖酶酶液(0.5u/ml至3u/ml)混合并且允许反应，并根据每个反应时间，通过god-pod测定法测定因水解反应和转糖基反应产生的游离葡萄糖的量(2)。此后，从(1)的测定值扣除(2)的测定值，并且检查转糖基葡萄糖的量是否具有依赖酶浓度的模式(表5和表6)。
[0069]
[表5]
[0070][0071]
[表6]
[0072][0073]
作为结果，根据酶浓度在反应开始后1小时以内观察到转糖基模式，其为反应初始阶段，并且确认有可能选择对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶(图3)。
[0074]
基于上文描述，本领域技术人员将理解本公开可以在不改变其技术精神或实质特征情况下按不同的具体形式实施。在这个方面，应当理解以上实施方案并无限制性，而是在全部方面均为说明性的。本公开的范围为所附权利要求所限定而非为其前的说明书所限定，并且落于权利要求界限或这类界限之等同物范围内的全部变化和修改因此意在为权利要求所包含。

技术特征：

1.选择对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶的方法，所述方法包括步骤：(i)通过使糖与葡聚糖蔗糖酶反应，确定游离葡萄糖的量；(ii)通过使糖和葡萄糖接纳体的混合物与葡聚糖蔗糖酶反应，确定游离葡萄糖的量；和(iii)比较(i)的游离葡萄糖量与(ii)的游离葡萄糖量。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)和(ii)依次或同时进行。3.根据权利要求1所述的方法，其中作为比较的结果，当与(i)的游离葡萄糖量相比较，(ii)的游离葡萄糖量降低时，则确定葡聚糖蔗糖酶为对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶。4.根据权利要求1所述的方法，其中选择是在诸葡聚糖蔗糖酶当中选择对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶。5.根据权利要求1所述的方法，其中选择是选择对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶或测量其活性。6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)的葡萄糖接纳体是甜菊糖。

技术总结

提供了在诸酶、尤其诸多的葡聚糖蔗糖酶当中选择对葡萄糖接纳体具有转糖基活性的葡聚糖蔗糖酶的方法及测量其活性的方法。糖蔗糖酶的方法及测量其活性的方法。糖蔗糖酶的方法及测量其活性的方法。

技术研发人员：

金贞银 秋善 朴晟喜 边成倍 朱哉映

受保护的技术使用者：

CJ第一制糖株式会社

技术研发日：

2021.04.21

技术公布日：

2023/3/28