用于提取细菌中质粒DNA的固液分离装置的制作方法

用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置
技术领域
1.本技术涉及生物制药技术领域,特别是涉及用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，更具体地,本技术涉及一种在碱裂解后从裂解液中提取质粒dna的装置。

背景技术：

2.质粒dna作为一种常见的基因运载工具，在生物医药方面有着极为广泛的应用前景。因其安全、方便等极为独特的优点，近年来被广泛应用于核酸疫苗、基因、细胞等技术领域。然而，质粒dna亦存在某些缺点，如在靶细胞中的基因表达率低、持续时间短等，故其用药剂量相对于其他类型的产品要大。如质粒dna疫苗的剂量为0.1～1.0mg，大约是甲型肝炎疫苗剂量50ng的2000～20000倍。全球每年对甲型肝炎疫苗的需求为5g，但对质粒dna的需求量就达10～100kg，而且这种需求量随着生物产品的发展趋势不断提高。另外，对于质粒dna除了产量上的高需求外，对其质量的要求也是十分苛刻，特别是对质粒dna超螺旋的比例，由此凸显出建立一种能够大规模、连续地生产高质量的质粒dna的方法显得迫在眉睫。
3.科学家们从未停止过对质粒dna提取方法的探索和研究。实验室早期就采用溶菌酶裂解、胰rna酶降低宿主dna的含量、使用苯酚和氯仿降低细胞蛋白浓度、用溴化乙锭、氯化铯离心纯化质粒dna等。另外，还有一些方法是在裂解液中使用各种无机盐或多聚物如:硫酸铵、氯化钙、peg等来选择性沉淀纯化质粒。然而上述列举的这些方法多为实验室方法，只能满足于毫克级的质粒dna的纯化，而对于克级及其以上产量的质粒dna纯化生产则上述方法是不适用的。随着科学技术的不断发展，质粒dna的纯化方法也有最新进展，总结归纳目前从原核生物大肠杆菌中提取和纯化质粒dna主要包括以下步骤：首先是通过碱裂解法将菌体裂解释放出质粒dna，然后是通过固液分离法将菌体裂解液进行处理从而粗提取质粒dna，最后是通过离子交换层析、疏水层析等方法进一步纯化出高纯度的质粒dna。而对于上述步骤，其中最重要的部分之一是将碱裂解后的料液进行固液分离，即如何将80％以上的杂质与目标质粒dna分离开则成为下游放大中的一个技术瓶颈。细胞裂解后，释放的宿主dna和其他杂质与细胞碎片包裹在一起形成白固体状絮凝物。实验室常利用固定角转子离心机离心分离，但耗时且不适合大规模生产。工业上一般使用连续离心的方式来获得高处理量，然而高速离心过程产生的剪切力会破坏质粒dna的超螺旋结构，从而影响质粒dna在基因表达时的有效性。另外，较强的剪切力还会使得一些杂质包括宿主dna、rna、蛋白质等裂解为细小的分子，从而给后续层析增加难度。另外，有研究人员指出膜过滤是质粒工业化生产的最佳选择，并且在过滤时加入助滤剂，能够减少因过滤压而引起的剪切力，以及防止gdna残片的再溶解。然而，对菌体裂解液直接进行膜过滤，过滤压力较大，而且不同的膜材质和助滤剂对质粒dna会产生静电吸附，在一定程度上会大大降低质粒dna的收率。此外，利用中空纤维和板框过滤和化学絮凝沉淀等方法虽大幅度提高了质粒dna的提取规模，但这些方面提取的质粒dna的杂质往往远多于离心方法提取的质粒dna，而且还潜在着由化学絮凝物带来的污染的问题。
4.因此，发明一种能够操作简单、稳定高效地从料液中提取高质量质粒dna的装置成为一种必然趋势。

技术实现要素：

5.针对上述目的，本技术的目的是提供一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置及从细菌中提取质粒dna的固液分离方法，能够稳定高效地从中和反应后的料液中提取高质量质粒dna，满足了基因药物、病毒类药物、核酸药物和疫苗产品，尤其是核酸疫苗的研发和后期产品大规模生产的需要。
6.本技术提供一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，该固液分离装置包括筒体、筒盖、滤网组件，筒体、筒盖可拆卸地连接，滤网组件位于筒体内，筒体上方侧壁设有进液口，反应液从进液口进入筒体内部的滤网组件中进行固液分离，筒体下端部设有出液口，固液分离后的液体从出液口流出。
7.滤网组件包括折叠滤袋，反应液从进液口流进折叠滤袋，经过滤后，从出液口流出。
8.进一步地，滤网组件还包括用于支撑折叠滤袋的支撑滤网，支撑滤网为一端开口且另一端闭合的桶状结构，支撑滤网的直径小于筒体内径，大于折叠滤袋的最大部位直径，便于将支撑滤网放置于筒体内，以及便于将折叠滤袋放置于支撑滤网内；支撑滤网上设有若干小孔，便于反应液流出。
9.进一步地，滤网组件还包括用于避免反应液旁漏的密封件，密封件包括密封环和提手部，密封环用于压住折叠滤袋，使得密封环紧贴并覆盖筒体和支撑滤网、支撑滤网与折叠滤袋之间的缝隙，从而避免反应液旁漏。
10.折叠滤袋上设有上端部，上端部周向设有弹性挡条，密封环的截面为l形结构，与弹性挡条的形状相匹配，便于压住弹性挡条，确保良好的密封性。而在本技术的其他实施例中，在折叠滤袋上没有弹性挡条的情况下，密封件还包括o形密封圈，o形密封圈为弹性材料，o形密封圈设置于密封环与折叠滤袋之间的部位，即o形密封圈与密封环的结构相匹配，能起到较好的密封效果。
11.进一步地，提手部的一端与密封环内圈a点连接，提手部的另一端与密封环内圈b点连接，a点与b点的距离为密封环的内径。提手部为具有一定弹性的金属材质，非工作状态时(即自由状态时)提手部的高度为d1，处于工作状态时(即支撑滤网、折叠滤袋、密封件位于筒体内，筒体和筒盖连接后，筒盖压住提手部时)提手部的高度为d2，其中d1＞d2，利用筒盖下压提手部，确保密封环紧贴筒体、支撑滤网、弹性挡条，密封环完全压住筒体与支撑滤网之间的缝隙以及支撑滤网与折叠滤袋之间的缝隙，从而达到避免反应液旁漏的目的。
12.进一步地，筒体与筒盖通过螺栓紧固连接，具有良好的防漏性能。
13.进一步地，为了监测过滤时筒体内的压力，筒盖上设有压力表，当压力过大时，能及时进行更换，防止折叠滤袋在受到过大压力时破裂。具体地，当压力超过0.6bar时，需要更换滤袋。
14.进一步地，为了实时观察筒体内过滤情况，筒盖上设有可视窗。
15.进一步地，筒盖上设有把手，便于取下筒盖。
16.本技术还提供了用于提取细菌中质粒dna的固液分离方法，包括以下步骤：
17.(1)将发酵后的含有质粒dna的大肠杆菌菌液重悬后加入裂解液裂解，裂解后加入中和液中和，得到中和反应后的料液；
18.(2)将料液低温静置，待料液分成上层、中间层、下层，将中间层的清液泵入固液分离装置中进行第一级过滤；将滤出的清液再次泵入固液分离装置中进行第二级过滤；
19.(3)收集过滤后的清液。
20.在本技术的优选实施例中，所述固液分离装置包括筒盖、筒体、滤网组件。
21.在本技术的优选实施例中，所述滤网组件包括支撑滤网、折叠滤袋、密封件。
22.在本技术的优选实施例中，所述折叠滤袋为rocket折叠滤袋。
23.在本技术的优选实施例中，所述折叠滤袋的孔径为150-250um或0.5-5um。
24.在本技术的优选实施例中，所述折叠滤袋的孔径为200um或1um。
25.在本技术的优选实施例中，第一次过滤时采用200um的rocket折叠滤袋，第二次过滤时采用1um的rocket折叠滤袋。
26.在本技术的优选实施例中，所述密封件包括密封环、提手部，密封环紧贴并覆盖筒体和支撑滤网、支撑滤网与折叠滤袋之间的缝隙。
27.在本技术的优选实施例中，所述筒盖上设有压力表。
28.在本技术的优选实施例中，所述料液低温静置8～20h。
29.本技术具有有益效果：本技术固液分离装置包括筒体、筒盖、滤网组件，滤网组件包括折叠滤袋，反应液从进液口流进折叠滤袋，经过滤后，从出液口流出，滤网组件还包括用于支撑折叠滤袋的支撑滤网，解决过滤时折叠滤袋在受到反应液对袋身和底部的冲击后容易破裂的问题，滤网组件还包括用于避免反应液旁漏的密封件，有效防止滤液不经过折叠滤袋过滤直接从筒体和支撑滤网以及支撑滤网与折叠滤袋之间的缝隙流到出液口，影响质粒dna的质量；本技术提手部为具有一定弹性的金属材质，非工作状态时提手部的高度大于处于工作状态时提手部的高度，利用筒盖下压提手部，确保密封环紧贴筒体、支撑滤网、弹性挡条，密封环完全压住筒体与支撑滤网之间的缝隙以及支撑滤网与折叠滤袋之间的缝隙，从而达到避免反应液旁漏的目的。
30.本技术对折叠滤袋的固定方式进行了改进，第一级滤袋的主要功能是截留泡沫漂浮物和大颗粒杂质，同时也是引导截留物的走向。基于这个目的，将第一级折叠滤袋固定在固液分离装置中，同时在过滤过程中给予压力控制，从而提高了滤袋的通量。第二级折叠滤袋的主要功能是分级截留不同大小杂质，同时快速让质粒dna溶液通过。为达到这个目的，还将第二级折叠滤袋固定在固液分离装置中，同时亦给予压力控制，从而有效地控制过滤液的浊度大小，使得含质粒dna的料液杂质含量更少。本技术采用折叠滤袋，提高了单位时间的料液过滤量，大大降低了滤袋的更换频率，从而减少了对洁净环境的污染风险，在某种程度上也提高了过滤收率。此外，本技术实施例1质粒dna溶液澄清度最高，澄清度越高说明料液里面的固体杂质少，后续超滤过程通量会大幅度提升，同时也会降低层析过程杂质的负载，更大程度上提高目标产品的纯度，提高了质粒dna的收率，同时降低后续纯化成本。由此说明合适的固液分离装置能够有利于减少宿主dna的残留，对提高产品的纯度和产量，降低大规模生产时的成本等，有很大帮助。
31.本技术克服了现有技术中存在的操作不便、收率低等导致提取的质粒dna的质量低下的技术问题；本技术能够大规模地从细菌中提取质粒dna，并且收率高，纯度及质量高，
满足了基因药物、病毒类药物、核酸药物和疫苗产品，尤其是核酸疫苗研发和后期产品大规模生产的需要。
附图说明
32.为了更清楚地说明本技术实施例，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅是本技术的一个或几个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
33.图1为固液分离装置示意图；
34.图2为图1的俯视图；
35.图3为图1中a处放大图；
36.图4为自由状态下密封件示意图；
37.图5为实施例1和对比例1-4固液分离后的清液，其中图5a为对比例1分离后清液，图5b为对比例2分离后清液，图5c为对比例3分离后清液，图5d为对比例4分离后清液，图5e为实施例1分离后清液。
具体实施方式
38.以下将结合实施例和附图对本技术的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本技术的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术实施例中的特征可以相互组合。
39.下面将结合附图，对本技术做进一步说明。
40.图1为本技术用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置的一个实施例的具体结构示意图，该固液分离装置包括筒体1、筒盖2、滤网组件，筒体1、筒盖2可拆卸地连接，滤网组件位于筒体1内，筒体1上方侧壁设有进液口101，反应液从进液口101进入筒体内部的滤网组件中进行固液分离，筒体下端部设有出液口102，固液分离后的液体从出液口102流出。
41.滤网组件包括折叠滤袋105，反应液从进液口101流进折叠滤袋105，经过滤后，从出液口102流出。
42.为了解决过滤时折叠滤袋105在受到反应液对袋身和底部的冲击后容易破裂的问题。滤网组件还包括用于支撑折叠滤袋的支撑滤网104，支撑滤网104为一端开口且另一端闭合的桶状结构，支撑滤网104的直径小于筒体1内径，大于折叠滤袋105的最大部位直径，便于将支撑滤网104放置于筒体1内，以及便于将折叠滤袋105放置于支撑滤网104内；支撑滤网104上设有若干小孔，便于反应液流出。
43.为了防止反应液在进入筒体1内部时，不经过折叠滤袋105过滤直接从折叠滤袋105与筒体1之间的缝隙流到出液口102，故滤网组件还包括用于避免反应液旁漏的密封件103，密封件103包括密封环1032和提手部1031，密封环1032紧贴并覆盖筒体1和支撑滤网104、支撑滤网104与折叠滤袋105之间的缝隙，从而避免反应液旁漏。
44.需要说明的是，在本实施例中，如图3所示，折叠滤袋105上设有上端部1051，上端部1051周向设有弹性挡条1052，密封环1032的截面为l形结构，与弹性挡条1052的形状相匹配，便于压住弹性挡条1052，确保良好的密封性。而在本技术的其他实施例中，在折叠滤袋上没有弹性挡条的情况下，密封件103还包括o形密封圈，o形密封圈为弹性材料，o形密封圈
设置于密封环1032与折叠滤袋105之间的部位，即o形密封圈与密封环1032的结构相匹配，能起到较好的密封效果。
45.进一步地，如图1所示，提手部1031的一端与密封环1032内圈a点连接，提手部1031的另一端与密封环1032内圈b点连接，a点与b点的距离为密封环的内径。需要说明的是，在本技术的其他实施例中，a点与b点仅不为密封环内圈上的相同的点。
46.在又一实施例中，为了实现较好的密封效果，提手部1031为具有一定弹性的金属材质，非工作状态时(即自由状态时)提手部1031的高度为d1(见图4)，处于工作状态时(即支撑滤网104、折叠滤袋105、密封件103位于筒体1内，筒体1和筒盖2连接后，筒盖2压住提手部1031时)提手部1031的高度为d2(见图1)，其中d1＞d2，即工作状态时筒盖2下压提手部1031，提手部1031弯曲，给予密封环1032向下的压力，使得密封环1032内表面紧贴筒体1、支撑滤网104、弹性挡条1052，密封环1032完全压住筒体1与支撑滤网104之间的缝隙、支撑滤网104与折叠滤袋105之间的缝隙，从而达到避免反应液旁漏的目的。
47.在又一实施例中，筒体1与筒盖2通过螺栓紧固连接，具有良好的防漏性能。
48.在又一实施例中，为了监测过滤时筒体内的压力，如图2所示，筒盖2上设有压力表201，当压力过大时，能及时进行更换，防止折叠滤袋在受到过大压力时破裂。具体地，当压力超过0.6bar时，需要更换滤袋。
49.在又一实施例中，为了实时观察筒体内过滤情况，筒盖2上设有可视窗202。
50.在又一实施例中，筒盖上2设有把手203，便于取下筒盖2。
51.上述实施例中的固液分离装置可用于下述实施例1，具体提取细菌中质粒dna的固液分离方法如下：
52.实施例1
53.1)将含有质粒dna的大肠杆菌菌体与重悬液(溶液i)混合，混合过程可使用机械搅拌装置，待充分混匀后得到菌体重悬液，然后菌体重悬液和裂解液(溶液ii)分别均以3.5l/min的流速进入裂解混匀泵中进行混匀，混匀过程中裂解混匀泵的转速为300rpm，快速混匀之后进入螺旋管中进行裂解反应5分钟，得到碱裂解后的菌体裂解液。
54.2)将菌体裂解液以7.0l/min的流速与同等流速的中和液(溶液iii)在中和混匀泵中进行混合，混合过程中裂解混匀泵的转速为300rpm/min，快速混合之后，细胞碎片将会与宿主dna、rna、蛋白质交联复合形成浮于液面的泡沫杂质。这些泡沫杂质会与清液一起进入相应规格大小的储存罐中暂存，暂存过程中控制低温。
55.3)低温静置8～20h，料液会分自然分层，其中上层为大片状的泡沫杂质，下层为细小的不溶杂质，中间层为清液。首先将底部的不溶杂质废弃，中间层的上清液先被泵入固液分离装置中进行过滤，其中折叠滤袋为孔径200um的rocket折叠滤袋，滤出的清液第二次被泵入固液分离装置中进行过滤，其中折叠滤袋为孔径1um的rocket折叠滤袋，单位时间过滤量为6l/min，折叠滤袋更换频率为1次/2h，最后将上清液收集至相应规格大小的储存罐中暂存。
56.4)上清液然后经过超滤、深度过滤、层析等步骤，最后得到质粒dna溶液。
57.依据药典方法，通过hplc检测上述方法制得的质粒dna，结果表明：通过此方法大规模制备的超螺旋状的质粒dna比例》95～98％，宿主残留rna《0.1ug/mg，宿主残留dna《0.1ug/mg，宿主残留蛋白《0.1ug/mg，固液分离后质粒dna收率＞75％，质粒dna总收率(原
液)＞40％。
58.本实施例在对比例3-4的基础上，将普通滤袋更换为折叠滤袋，并提供了适宜的固液分离装置，提高了单位时间料液过滤量，减少了滤袋的更换频率。如图5所示，实施例1中质粒dna溶液的澄清度最高。澄清度越高说明料液里面的固体杂质少，后续超滤过程通量会大幅度提升，同时也会降低层析过程杂质的负载，更大程度上提高目标产品的纯度，且降低后续纯化成本。
59.注：溶液i为25mm氨丁三醇和10mm的易地酸二钠，溶液ii为0.2m氢氧化钠和1％十二烷基硫酸钠，溶液iii为1m乙酸钾和7m乙酸铵。
60.对比例1
61.1)将含有质粒dna的大肠杆菌菌体与重悬液(溶液i)混合，混合过程使用机械搅拌装置，待充分混匀后得到菌体重悬液，然后菌体重悬液和裂解液(溶液ii)分别均以3.5l/min的流速进入裂解混匀泵中进行混匀，混匀过程中裂解混匀泵的转速为900rpm/min，快速混匀之后进入螺旋管中进行裂解反应5分钟，得到碱裂解后的菌体裂解液。
62.2)将菌体裂解液以7.0l/min的流速与同等流速的中和液(溶液iii)在中和混匀泵中进行混合，混合过程中裂解混匀泵的转速为700rpm/min，快速混合之后，细胞碎片将会与宿主dna、rna、蛋白质交联复合形成浮于液面的泡沫杂质。这些泡沫杂质会与清液一起进入相应规格大小的储存罐中暂存，暂存过程中控制低温。然后通过低速搅拌使得中和反应液混匀，搅拌速度为50rpm/min，搅拌均匀后进行碟式离心，进料流速为200l/h，离心转速为8500rpm/min，离心后的上清液收集至相应规格大小的储存罐中暂存。
63.3)上清液经过超滤、深度过滤、层析等步骤，最后得到质粒dna溶液。
64.依据药典方法，通过hplc检测上述方法制得的质粒dna，结果表明：通过此方法大规模制备的超螺旋状的质粒dna比例》90～93％，宿主残留rna《1ug/mg，宿主残留dna》5ug/mg，宿主残留蛋白《1ug/mg，固液分离后质粒dna收率＞60％，质粒dna总收率(原液)＞35％。
65.对比例1采用连续碟式离心方法，进料流速200l/h，离心转速为8500rpm/min，得到的质粒dna的宿主dna残留高于原液质量标准，可能原因在于离心过程产生的剪切力使得宿主dna分子破碎为一些小分子，这些小分子在后续的层析过程中无法与质粒dna分子分离开来。
66.注：溶液i为25mm氨丁三醇和10mm的易地酸二钠，溶液ii为0.2m氢氧化钠和1％十二烷基硫酸钠，溶液iii为1m乙酸钾和7m乙酸铵。
67.对比例2
68.1)将含有质粒dna的大肠杆菌菌体与重悬液(溶液i)混合，混合过程可使用机械搅拌装置，待充分混匀后得到菌体重悬液，然后菌体重悬液和裂解液(溶液ii)分别均以3.5l/min的流速进入裂解混匀泵中进行混匀，混匀过程中裂解混匀泵的转速为500rpm/min，快速混匀之后进入螺旋管中进行裂解反应5分钟，得到碱裂解后的菌体裂解液。
69.2)将菌体裂解液以7.0l/min的流速与同等流速的中和液(溶液iii)在中和混匀泵中进行混合，混合过程中裂解混匀泵的转速为300rpm/min，快速混合之后，细胞碎片将会与宿主dna、rna、蛋白质交联复合形成浮于液面的泡沫杂质。这些泡沫杂质会与清液一起进入相应规格大小的储存罐中暂存，暂存过程中控制低温。然后通过低速搅拌使得中和反应液混匀，搅拌速度为50rpm/min，搅拌均匀后进行碟式离心，进料流速为300l/h，离心转速为
8000rpm/min，离心后的上清液收集至相应规格大小的储存罐中暂存。
70.3)上清液经过超滤、深度过滤、层析等步骤，最后得到质粒dna溶液。
71.依据药典方法，通过hplc检测上述方法制得的质粒dna，结果表明：通过此方法大规模制备的超螺旋状的质粒dna比例》90～93％，宿主残留rna《1ug/mg，宿主残留dna》8ug/mg，宿主残留蛋白《1ug/mg，固液分离后质粒dna收率＞60％，质粒dna总收率(原液)＞35％。
72.对比例2采用连续碟式离心方法，进料流速300l/h，离心转速为8000rpm/min，得到的质粒dna的宿主dna残留高于原液质量标准，可能原因在于离心过程产生的剪切力使得宿主dna分子破碎为一些小分子，这些小分子在后续的层析过程中无法与质粒dna分子分离开来。
73.注：溶液i为25mm氨丁三醇和10mm的易地酸二钠，溶液ii为0.2m氢氧化钠和1％十二烷基硫酸钠，溶液iii为1m乙酸钾和7m乙酸铵。
74.对比例3
75.1)将含有质粒dna的大肠杆菌菌体与重悬液(溶液i)混合，混合过程可使用机械搅拌装置，待充分混匀后得到菌体重悬液，然后菌体重悬液和裂解液(溶液ii)分别均以3.5l/min的流速进入裂解混匀泵中进行混匀，混匀过程中裂解混匀泵的转速为500rpm，快速混匀之后进入螺旋管中进行裂解反应5分钟，得到碱裂解后的菌体裂解液。
76.2)将菌体裂解液以7.0l/min的流速与同等流速的中和液(溶液iii)在中和混匀泵中进行混合，混合过程中裂解混匀泵的转速为300rpm/min，快速混合之后，细胞碎片将会与宿主dna、rna、蛋白质交联复合形成浮于液面的泡沫杂质。这些泡沫杂质会与清液一起进入相应规格大小的储存罐中暂存，暂存过程中控制低温。
77.3)低温静置8～20h，料液会分自然分层，其中上层为大片状的泡沫杂质，下层为细小的不溶杂质，中间层为上清液。首先将底部的不溶杂质废弃，中间层的上清液先被泵入200um的单层滤袋进行过滤，滤出的清液然后被泵入100um+50um(套袋模式)的单层滤袋组合，单位时间过滤量为5l/min，折叠滤袋更换频率为2次/h，最后将上清液收集至相应规格大小的储存罐中暂存。
78.4)上清液然后经过超滤、深度过滤、层析等步骤，最后得到质粒dna溶液。
79.依据药典方法，通过hplc检测上述方法制得的质粒dna，结果表明：通过此方法大规模制备的超螺旋状的质粒dna比例》95～98％，宿主残留rna《0.1ug/mg，宿主残留dna《0.1ug/mg，宿主残留蛋白《0.1ug/mg，固液分离后质粒dna收率＞75％，质粒dna总收率(原液)＞40％。
80.对比例3中采用二级滤袋过滤的固液分离方式，第一级滤袋为200um的单层滤袋，第二级滤袋为100um+50um(套袋模式)的单层滤袋组合，质粒dna的超螺旋比例从90～93％提高到95～98％，宿主dna残留从》5ug/mg降低到《0.1ug/mg，其他的杂质残留也有明显的降低，同时收率提高到40％以上。滤袋相对于离心有利于提高质粒的收率，减少开环质粒产生，并且降低杂质rna的残留，使其更有利于下游的纯化，得到浓度和纯度更高的产品。
81.注：溶液i为25mm氨丁三醇和10mm的易地酸二钠，溶液ii为0.2m氢氧化钠和1％十二烷基硫酸钠，溶液iii为1m乙酸钾和7m乙酸铵。
82.对比例4
83.1)将含有质粒dna的大肠杆菌菌体与重悬液(溶液i)混合，混合过程可使用机械搅
拌装置，待充分混匀后得到菌体重悬液，然后菌体重悬液和裂解液(溶液ii)分别均以3.5l/min的流速进入裂解混匀泵中进行混匀，混匀过程中裂解混匀泵的转速为300rpm，快速混匀之后进入螺旋管中进行裂解反应5分钟，得到碱裂解后的菌体裂解液。
84.2)将菌体裂解液以7.0l/min的流速与同等流速的中和液(溶液iii)在中和混匀泵中进行混合，混合过程中裂解混匀泵的转速为300rpm，快速混合之后，细胞碎片将会与宿主dna、rna、蛋白质交联复合形成浮于液面的泡沫杂质。这些泡沫杂质会与清液一起进入相应规格大小的储存罐中暂存，暂存过程中控制低温。
85.3)低温静置8～20h，料液会分自然分层，其中上层为大片状的泡沫杂质，下层为细小的不溶杂质，中间层为清液。首先将底部的不溶杂质废弃，中间层的上清液先被泵入200um的单层滤袋进行过滤，滤出的清液然后被泵入50um的单层滤袋，单位时间过滤量为5l/min，折叠滤袋更换频率为2次/h，最后将上清液收集至相应规格大小的储存罐中暂存。
86.4)上清液然后经过超滤、深度过滤、层析等步骤，最后得到质粒dna溶液。
87.依据药典方法，通过hplc检测上述方法制得的质粒dna，结果表明：通过此方法大规模制备的超螺旋状的质粒dna比例》95～98％，宿主残留rna《0.1ug/mg，宿主残留dna《0.1ug/mg，宿主残留蛋白《0.1ug/mg，固液分离后质粒dna收率＞75％，质粒dna总收率(原液)》40％。
88.对比例4与对比例3相比，第一级过滤采用200um的单层滤袋，第二级过滤采用50um的单层滤袋。超螺旋状的质粒dna比例、宿主残留rna、宿主残留dna、宿主残留蛋白、质粒dna总收率与对比例3相当，但是如图5所示，质粒dna溶液的澄清度有所提高。
89.注：溶液i为25mm氨丁三醇和10mm的易地酸二钠，溶液ii为0.2m氢氧化钠和1％十二烷基硫酸钠，溶液iii为1m乙酸钾和7m乙酸铵。
90.对比例1-2结果表明，连续碟式离心方法，采用不同的进料流速和离心转速，通过后续处理之后得到的质粒dna的宿主dna残留均高于原液质量标准。可能原因在于离心过程产生的剪切力使得宿主dna分子破碎为一些小分子，这些小分子在后续的层析过程中无法与质粒dna分子分离开来。
91.对比例3-4采用滤袋的固液分离方式，过滤过程中剪切力小，有效保护超螺旋结构质粒dna不因剪切力作用形成开环结构，同时也降低了对宿主dna、rna、蛋白质等杂质的结构破坏，减少提取的液体质粒dna中的杂质含量。采用二级滤袋过滤，孔径大的滤袋被安排在一级拦截，孔径小的放在次级拦截，这种分布即可保证泡沫漂浮物和大尺寸颗粒杂质截留在前面，让小尺寸杂质流入到次级滤袋中被有效截留，提高了滤袋的使用效率，同时也使质粒dna溶液顺利通过前、后滤袋进入到收集罐中，达到高效分离的效果。相比碟式离心方法，质粒dna的超螺旋比例从90～93％提高到95～98％，宿主dna残留从》5ug/mg降低到《0.1ug/mg，其他的杂质残留也有明显的降低，同时收率提高到40％以上。
92.为了提升滤袋的过滤通量，本技术(即实施例1)一方面改变单层滤袋为折叠滤袋，如此一来，一方面提高了单位时间的料液过滤量，另一方面，大大降低了滤袋的更换频率，从而减少了对洁净环境的污染风险，在某种程度上也提高了过滤收率。另一方面对折叠滤袋的固定方式进行了改进，首先第一级滤袋的主要功能是截留泡沫漂浮物和大颗粒杂质，同时也是引导截留物的走向。基于这个目的，将第一级折叠滤袋固定在固液分离装置中，同时在过滤过程中给予压力控制，从而提高了滤袋的通量。第二级折叠滤袋的主要功能是分
级截留不同大小杂质，同时快速让质粒dna溶液通过。为达到这个目的，还将第二级折叠滤袋固定在固液分离装置中，同时亦给予压力控制，从而有效地控制过滤液的浊度大小，使得含质粒dna的料液杂质含量更少。此外，实施例1中质粒dna溶液澄清度最高，澄清度越高说明料液里面的固体杂质少，后续超滤过程通量会大幅度提升，同时也会降低层析过程杂质的负载，更大程度上提高目标产品的纯度，提高质粒dna的收率，大大地降低了工业化大规模生产的成本。由此说明合适的固液分离装置和方法能够有利于减少宿主dna的残留，对提高产品的纯度和产量有很大帮助。
93.本技术克服了现有技术中存在的操作不便、收率低等导致提取的质粒dna的质量低下的技术问题；本技术能够大规模地从细菌中提取质粒dna，并且收率高，纯度及质量高，满足了基因药物、病毒类药物、核酸药物和疫苗产品，尤其是核酸疫苗研发和后期产品大规模生产的需要。
94.以上详细描述了本技术的优选实施方式，但是，本技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本技术的保护范围。

技术特征：

1.一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，该固液分离装置包括筒体、筒盖、滤网组件；所述滤网组件位于筒体内；所述筒体上方侧壁设有进液口，下端部设有出液口。2.根据权利要求1所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述滤网组件包括折叠滤袋、支撑滤网、密封件。3.根据权利要求2所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述密封件包括密封环和提手部。4.根据权利要求3所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述提手部的一端与密封环内圈a点连接，提手部的另一端与密封环内圈b点连接，a点与b点的距离为密封环的内径。5.根据权利要求3或4所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述提手部为具有弹性的金属材质。6.根据权利要求2所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述折叠滤袋上设有上端部，上端部周向设有弹性挡条。7.根据权利要求1所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述筒体与筒盖通过螺栓紧固连接。8.根据权利要求1所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述筒盖上设有压力表、可视窗、把手。9.根据权利要求2所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述支撑滤网为一端开口且另一端闭合的桶状结构。10.根据权利要求9所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述支撑滤网的直径小于所述筒体内径，大于所述折叠滤袋的最大部位直径。11.根据权利要求1所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述筒体、筒盖可拆卸连接。12.根据权利要求2所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述支撑滤网用于支撑折叠滤袋。13.根据权利要求3所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述密封环紧贴并覆盖所述筒体和所述支撑滤网以及所述支撑滤网与所述折叠滤袋之间的缝隙。14.根据权利要求5所述的一种用于提取细菌中质粒dna的固液分离装置，其特征在于，所述提手部非工作状态时的高度为d1，处于工作状态时的高度为d2，其中d1＞d2。

技术总结

本申请公开了用于提取细菌中质粒DNA的固液分离装置，该固液分离装置包括筒体、筒盖、滤网组件，滤网组件包括折叠滤袋，反应液从进液口流进折叠滤袋，经过滤后，从出液口流出，滤网组件还包括用于支撑折叠滤袋的支撑滤网，解决过滤时折叠滤袋在受到反应液对袋身和底部的冲击后容易破裂的问题，滤网组件还包括用于避免反应液旁漏的密封件，有效防止滤液不经过折叠滤袋过滤直接从筒体和支撑滤网以及支撑滤网与折叠滤袋之间的缝隙流到出液口，影响质粒DNA的质量。本申请能够稳定高效地从料液中提取高质量质粒DNA，满足了基因药物、病毒类药物、核酸药物和疫苗产品，尤其是核酸疫苗的研发和后期产品大规模生产的需要。发和后期产品大规模生产的需要。发和后期产品大规模生产的需要。