一种检测3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉中杂质的HPLC方法与流程

一种检测3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉中杂质的hplc方法
技术领域
1.本发明涉及药物分析领域，具体而言，涉及一种检测3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉中杂质的hplc方法。

背景技术：

2.富马酸贝达喹啉(bedaquiline fumarate)，化学名(1r，2s)-1-(6-溴-2-甲氧基-3-喹啉基)-4-(二甲基氨基)-2-(1-萘基)-1-苯基-2-丁醇化合物和富马酸(1:1)，于2012年在美国批准上市，2016年在中国批准上市，是一种二芳基喹啉类抗分枝杆菌药物，作为联合的一部分，适用于成人(≥18岁)耐多药(mdr-tb)。
3.3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉为合成富马酸贝达喹啉的关键中间体，3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉的合成反应中使用了对溴苯胺，有可能会引入杂质硝基苯、间溴硝基、2,6-二溴苯胺、2,4,5-三溴苯胺、2,4,6-三溴苯胺，所述杂质属于苯胺类或硝基苯类化合物，具有遗传毒性杂质警示结构，是潜在致突变杂质，必须严格监控。
4.潜在致突变杂质是指能直接或间接损害dna，导致基因突变或具有致癌倾向的物质，它可能存在于整个化学药物的合成过程，如起始物料、中间体、终产物和副反应产物等。由于潜在致突变杂质的高危险性，对潜在致突变杂质的控制在药物的质量控制中具有重要意义。根据“质量源于设计”的理念，要求尽可能在源头控制杂质来降低终产品的质量风险，因此有必要在起始物料中控制潜在致突变杂质的含量。目前暂未有上述杂质的质量研究方法。

技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种检测3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉中杂质的hplc方法，该方法灵敏度高，分离度好，操作简单，成本低，用高效液相即可控制。
6.本发明提供一种检测3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉中杂质的hplc方法，其中采用苯基己基键合硅胶填料谱柱，采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，用紫外检测器进行检测，所述流动相a为磷酸水溶液，所述流动相b为乙腈。
7.在一些实施方案中，所述磷酸水溶液中磷酸的体积是水体积的0.02～0.5％，优选为0.05～0.3％，更优选为0.1～0.2％。
8.在一些实施例中，所述梯度洗脱设置如下：0到13分钟：流动相a由85-60％线性减少至40-25％，流动相b由15-40％线性增加至60-75％；13到27分钟，流动相a由40-25％线性减少至30-15％，流动相b由60-75％线性增加至70-85％；27到27.1分钟：流动相a由30-15％线性增加至85-60％，流动相b由70-85％线性减少至40-25％；27.1分钟到37分钟，流动相a是85-60％，流动相b是40-25％。
9.在一些实施方式中，所述梯度洗脱设置如下：0到13分钟：流动相a由65％线性减少至30％，流动相b由35％线性增加至70％；13到27分钟，流动相a由30％线性减少至20％，流动相b由70％线性增加至80％；27到27.1分钟：流动相a由20％线性增加至65％，流动相b由
80％线性减少至35％；27.1分钟到37分钟，流动相a是65％，流动相b是35％。
10.在一些实施方案中，所述方法中的柱温为25～40℃，优选为30～35℃，流速为0.5～2ml/min，优选为1～1.5ml/min，检测波长为200～250nm，优选为220-250nm。
11.在一些实施方案中，所述苯基己基键合硅胶填料谱柱是phenomenex luna 3μm phenyl hexyl 100a(4.6mm
×
150mm)、kinetex phenyl(4.6mm
×
1250mm，5μm)或xbridge phenyl(4.6mm
×
150mm，3.5μm)，优选phenomenex luna 3μm phenyl hexyl 100a(4.6mm
×
150mm)。
12.在一些实施方案中，所述方法具体包括以下步骤：
13.1)配制供试品溶液：取供试样品溶于溶剂，得供试品溶液；
14.2)配制对照品溶液：分别取杂质的对照品，用溶剂溶解稀释制成对照品溶液；
15.3)分别取空白溶剂、步骤1)所述供试品溶液和步骤2)中的对照品溶液进样，进行高效液相谱分析，记录谱图。
16.在一些实施方案中，所述空白溶剂、步骤1)和步骤2)中的溶剂为四氢呋喃水溶液。
17.在一些实施方案中，所述四氢呋喃水溶液中四氢呋喃和水的体积比是1～10:1，优选2～8:1，更优选4～6:1。
18.在一些实施方案中，所述供试品溶液的浓度是10～50mg/ml，优选20～40mg/ml，更优选25～30mg/ml。
19.在一些实施方案中，所述对照品溶液的浓度是0.01～1μg/ml，优选0.03～0.5μg/ml，更优选0.05～0.1μg/ml。
20.在一些实施方案中，进样体积是5～60μl，优选10～50μl。
21.在一些实施方案中，步骤3)还包括在记录谱图后，确定杂质的保留时间，按外标法以峰面积计算供试样品溶液中杂质的含量，计算方程如下所示：
[0022][0023]
其中：
[0024]cr
为对照品溶液中各杂质浓度；c
x
为供试品溶液浓度；
[0025]ar
为对照品溶液中各杂质峰面积；a
x
为供试品溶液中各杂质峰面积。
[0026]
在一些实施方式中，所述的杂质选自硝基苯、间溴硝基苯、2,6-二溴苯胺、2,4,5-三溴苯胺或2,4,6-三溴苯胺。
[0027]
本发明提供的方法灵敏度高，分离度好，操作简单，成本低，能够有效准确的控制起始物料中潜在致突变杂质的量，保证最终产品的质量，确保药物的安全性和质量可控性。
[0028]
术语定义和说明
[0029]
除非本发明另外定义，与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
附图说明
[0030]
图1是硝基苯、间溴硝基苯、2,6-二溴苯胺、2,4,5-三溴苯胺、2,4,6-三溴苯胺典型的系统适用性溶液谱图；
[0031]
图2是供试品溶液谱图；
[0032]
图3是硝基苯定位溶液谱图；
[0033]
图4是间溴硝基苯定位溶液谱图；
[0034]
图5是2,6-二溴苯胺定位溶液谱图；
[0035]
图6是2,4,5-三溴苯胺定位溶液谱图；
[0036]
图7是2,4,6-三溴苯胺定位溶液谱图；
[0037]
图8是硝基苯、间溴硝基苯、2,6-二溴苯胺、2,4,6-三溴苯胺检测限溶液谱图；
[0038]
图9是2,4,5-三溴苯胺检测限溶液谱图；
[0039]
图10是硝基苯、间溴硝基苯、2,6-二溴苯胺、2,4,6-三溴苯胺定量限溶液谱图；
[0040]
图11是2,4,5-三溴苯胺定量限溶液谱图；
[0041]
图12是硝基苯、间溴硝基苯、2,6-二溴苯胺、2,4,5-三溴苯胺、2,4,6-三溴苯胺加标供试品溶液谱图。
具体实施方式
[0042]
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0043]
本发明实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0044]
以下实施例中检测所用硝基苯由安耐吉公司提供，批号为e7ard9nr；间溴硝基苯由安耐吉公司提供，批号为gc200304；2,6-二溴苯胺由安耐吉公司提供，批号为ec240143；2,4,5-三溴苯胺由accela公司提供，批号为e530-1076-42e；2,4,6-三溴苯胺由damas-beta公司提供，批号为p1534173。
[0045]
实施例1、检测3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉中杂质硝基苯、间溴硝基苯、2,6-二溴苯胺、2,4,5-三溴苯胺、2,4,6-三溴苯胺的hplc方法
[0046]
仪器：高效液相谱仪配备紫外检测器(agilent 1260)
[0047]
谱柱：采用苯基己基键合硅胶填料谱柱(phenomenex luna 3μm phenyl hexyl 100a，4.6mm
×
150mm)
[0048]
流动相a：磷酸水溶液，磷酸体积是水体积的0.1％
[0049]
流动相b：乙腈
[0050]
流速：1.0ml/min
[0051]
梯度洗脱程序：
[0052]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0653513307027208027.16535376535
[0053]
检测器：uv
[0054]
检测波长：220nm
[0055]
柱温：35℃
[0056]
进样体积：10μl
[0057]
溶剂：四氢呋喃：水，体积比是80：20
[0058]
对照品溶液(也称系统适用性溶液)：精密称取硝基苯、间溴硝基苯、2,6-二溴苯胺、2,4,5-三溴苯胺、2,4,6-三溴苯胺各10mg，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0059]
供试品溶液：取3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉约150mg，置5ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0060]
分析程序：按照谱条件分别进样空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液。
[0061]
系统适用性要求：空白溶剂在目标峰的出峰位置处没有干扰；对照品溶液中，硝基苯、间溴硝基苯、2,6-二溴苯胺、2,4,5-三溴苯胺、2,4,6-三溴苯胺一次出峰，各峰之间的分离度应不小于1.5。
[0062]
杂质含量计算：按外标法计算杂质含量。计算方程如下所示：
[0063][0064]
其中：
[0065]cr
为对照品溶液中各杂质浓度；c
x
为供试品溶液浓度；
[0066]ar
为对照品溶液中各杂质峰面积；a
x
为供试品溶液中各杂质峰面积。
[0067]
(1)系统适用性、进样精密度和专属性
[0068]
硝基苯储备液(也称定位溶液)：精密称取硝基苯约10mg，置200ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0069]
间溴硝基苯储备液(也称定位溶液)：精密称取间溴硝基苯2mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0070]
2,6-二溴苯胺储备液(也称定位溶液)：精密称取2,6-二溴苯胺2mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0071]
2,4,5-三溴苯胺储备液(也称定位溶液)：精密称取2,4,5-三溴苯胺2mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0072]
2，4，6-三溴苯胺储备液(也称定位溶液)：精密称取2，4,6-三溴苯胺2mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0073]
精密量取上述各杂质储备液以及空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液，按照上述谱条件分别进样，记录谱图。系统适用性结果见下表。典型的系统适用性溶液(即对照品溶液)谱图见图1，供试品溶液谱图见图2，代表性定位溶液谱图见图3～7。
[0074]
系统适用性及进样精密度试验结果
[0075]
[0076][0077]
结论：空白溶剂在目标峰出峰位置处无干扰；对照品溶液6针，各杂质峰峰面积rsd皆小于2.0％，保留时间rsd皆小于1.0％，各杂质分离度均不低于2.98。图2显示，主成分3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉及杂质峰均不干扰各杂质的检测。试验结果表明，该方法系统适用性良好，专属性良好。
[0078]
(2)检测限和定量限
[0079]
取各杂质储备液，分别稀释至不同的浓度，考察其检测限及定量限。
[0080]
按照上述谱条件分别进样，记录谱图，计算主峰的信噪比和峰面积的rsd，结果见下表。代表性检测限溶液图谱和定量限溶液图谱见图8～11。
[0081]
硝基苯定量限和检测限试验结果
[0082][0083]
间溴硝基苯定量限和检测限试验结果
[0084][0085]
2,6-二溴苯胺定量限和检测限试验结果
[0086]
[0087][0088]
2,4,5-三溴苯胺定量限和检测限试验结果
[0089][0090]
2,4,6-三溴苯胺定量限和检测限试验结果
[0091][0092]
结论：检测限溶液中，各峰信噪比皆大于3。定量限溶液中，各峰信噪比皆大于10，峰面积rsd皆小于12％。试验结果说明该方法具有较好的灵敏度。
[0093]
(3)准确度
[0094]
硝基苯储备液2：量取“系统适用性”项下硝基苯储备液2ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0095]
150％准确度储备液：精密量取“系统适用性”项下间溴硝基苯储备液、2,6-二溴苯胺储备液、2,4,5-三溴苯胺储备液、2,4,6-三溴苯胺各0.75ml及硝基苯储备液2 3ml，置200ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
[0096]
50％准确度储备液：精密量取150％准确度储备液10ml于30ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
[0097]
50％准确度溶液：精密称取3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉样品150mg，置于5ml量瓶中，加50％准确度储备液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为50％准确度溶液。平行配制三份。
[0098]
100％准确度溶液：精密称取3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉样品150mg，置于5ml量瓶中，加对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为100％准确度溶液。平行配制三份。
[0099]
150％准确度溶液：精密称取3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉样品150mg，置5ml量瓶中，加150％准确度储备液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为150％准确度溶液。平行配制三份。
[0100]
精密量取50％准确度溶液、100％准确度溶液、150％准确度溶液，按照上述谱条件分别进样，记录谱图，结果见下表。
[0101]
硝基苯准确度试验结果
[0102][0103]
间溴硝基苯准确度试验结果
[0104][0105]
2,6-二溴苯胺准确度试验结果
[0106][0107]
2,4,5-三溴苯胺准确度试验结果
[0108][0109]
2,4,6-三溴苯胺准确度试验结果
[0110][0111]
结论：9份准确度溶液硝基苯的回收率范围为86.5％～111.9％、间溴硝基苯的回收率范围为98.2％～114.2％、2,6-二溴苯胺的回收率范围为82.1％～97.9％、2,4,5-三溴苯胺的回收率范围为86.5％～112.0％，2,4,6三溴苯胺的回收率范围为70.7％～102.8％，9份样品的rsd分别为9.6％、5.6％、5.3％、9.0％、11.4％，说明本法测定硝基苯、间溴硝基苯、2,6-二溴苯胺、2,4,5-三溴苯胺和2,4,6-三溴苯胺有关物质具有较好的准确度。
[0112]
(4)重复性
[0113]
加标供试品溶液：同“准确度”项下100％准确度溶液的配制。平行配制6份。
[0114]
精密量取对照品溶液、加标供试品溶液，按照上述谱方法进样，记录谱图，计算含量，结果见下表，代表性图谱见加标供试品溶液谱图(图12)。
[0115]
重复性试验结果
[0116][0117]
结论：6份加标供试品溶液中，各峰含量rsd均小于7.0％，说明本法用于检测硝基苯、间溴硝基苯、2,6-二溴苯胺、2,4,5-三溴苯胺和2,4,6-三溴苯胺有关物质重复性良好。

技术特征：

1.一种检测3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉中杂质的hplc方法，其中采用苯基己基键合硅胶填料谱柱，采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，用紫外检测器进行检测，所述流动相a为磷酸水溶液，所述流动相b为乙腈。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磷酸水溶液中磷酸的体积是水体积的0.02～0.5％，优选为0.05～0.3％，更优选为0.1～0.2％。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述梯度洗脱设置如下：0到13分钟：流动相a由85-60％线性减少至40-25％，流动相b由15-40％线性增加至60-75％；13到27分钟，流动相a由40-25％线性减少至30-15％，流动相b由60-75％线性增加至70-85％；27到27.1分钟：流动相a由30-15％线性增加至85-60％，流动相b由70-85％线性减少至40-25％；27.1分钟到37分钟，流动相a是85-60％，流动相b是40-25％；优选地，所述梯度洗脱设置如下：0到13分钟：流动相a由65％线性减少至30％，流动相b由35％线性增加至70％；13到27分钟，流动相a由30％线性减少至20％，流动相b由70％线性增加至80％；27到27.1分钟：流动相a由20％线性增加至65％，流动相b由80％线性减少至35％；27.1分钟到37分钟，流动相a是65％，流动相b是35％。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法中的柱温为25～40℃，优选为30～35℃；流速为0.5～2ml/min，优选为1～1.5ml/min；检测波长为200～250nm，优选为220-250nm。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述苯基己基键合硅胶填料谱柱是phenomenex luna 3μm phenyl hexyl 100a(4.6mm
×
150mm)、kinetex phenyl(4.6mm
×
1250mm，5μm)或xbridge phenyl(4.6mm
×
150mm,3.5μm)，优选为phenomenex luna 3μm phenyl hexyl 100a(4.6mm
×
150mm)。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法具体包括以下步骤：1)配制供试品溶液：取供试样品溶于溶剂，得供试品溶液；2)配制对照品溶液：分别取杂质的对照品，用溶剂溶解稀释制成对照品溶液；3)分别取空白溶剂、步骤1)所述供试品溶液和步骤2)中的对照品溶液进样，进行高效液相谱分析，记录谱图。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述空白溶剂、步骤1)和步骤2)中的溶剂为四氢呋喃水溶液，所述四氢呋喃水溶液中四氢呋喃和水的体积比是1～10:1，优选2～8:1，更优选4～6:1。8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述供试品溶液的浓度是10～50mg/ml，优选20～40mg/ml，更优选25～30mg/ml；所述对照品溶液的浓度是0.01～1μg/ml，优选0.03～0.5μg/ml，更优选0.05～0.1μg/ml；进样体积是5～60μl，优选10～50μl。9.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤3)还包括在记录谱图后，确定杂质的保留时间，按外标法以峰面积计算供试样品溶液中杂质的含量，计算方程如下所示：其中：c
r
为对照品溶液中各杂质浓度；c
x
为供试品溶液浓度；a
r
为对照品溶液中各杂质峰面积；a
x
为供试品溶液中各杂质峰面积。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的杂质选自硝基苯、间溴硝基苯、2，6-二溴
苯胺、2，4，5-三溴苯胺或2，4，6-三溴苯胺。

技术总结

本发明公开了一种检测3-苄基-6-溴-2-甲氧基喹啉中杂质的HPLC方法，采用苯基己基键合硅胶填料谱柱，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，用紫外检测器进行检测，所述流动相A为磷酸水溶液，所述流动相B为乙腈。本发明提供的方法灵敏度高，分离度好，操作简单，成本低。成本低。

技术研发人员：

吴婷华 雷晓雪 李薇 何诗璇 任晋生

受保护的技术使用者：

江苏先声药业有限公司

技术研发日：

2021.09.27

技术公布日：

2023/3/27