一种蛋白酶及其在L-肌肽合成中的应用的制作方法

一种蛋白酶及其在l-肌肽合成中的应用
技术领域
1.本技术涉及肌肽技术领域，尤其涉及一种具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在l-肌肽合成中的应用。

背景技术：

2.l-肌肽，是一种由β-丙氨酸和l-组氨酸组成的二肽，是目前发现的最广泛的生物活性肽之一。l-肌肽在哺乳动物的大脑、肌肉和其他组织中广泛存在。
3.研究表明，l-肌肽具有抗氧化性、清除胞内自由基、抗衰老等多种生物活性，并且对高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡等都有效果。由于其较强的抗氧化活性、低毒副作用，并有多种生理活性，该活性肽在医药、保健、卫生、化妆品等领域都具有良好的应用前景。
4.目前所报道的l-肌肽的合成方法主要为化学合成和生物酶法催化两种，其中酶法由于具有环保、制备成本低、合成时间短的优点，使其应用更为广泛。然而，目前在使用酶法合成l-肌肽时，一般以β-丙氨酸甲酯盐酸盐和组氨酸为底物，还存在以下问题：一是β-丙氨酸甲酯盐酸盐制备方法复杂，价格昂贵；二是β-丙氨酸甲酯盐酸盐酸性极强，对不锈钢罐等金属制品有很强的腐蚀性；三是β-丙氨酸甲酯盐酸盐易受潮，受潮后不稳定。

技术实现要素：

5.针对上述技术问题，本技术提供了一种具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在l-肌肽合成中应用，所述蛋白酶可以β-丙氨酸甲酯盐酸盐和l-组氨酸或者β-丙氨酸和l-组氨酸为底物制备肌肽，并且所述的蛋白酶的酶学性质稳定，有利于工业化的进行。
6.本技术具体技术方案如下：
7.1.一种具有肌肽水解酶功能的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶包含如seq id no:6所示的氨基酸序列。
8.2.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
9.b1)编码项1所述蛋白酶的核酸分子；
10.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
11.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
12.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物。
13.3.根据项2所述的生物材料，其特征在于，所述的核酸分子包含如seq id no:2所示的核酸序列。
14.4.下述任一种材料在制备项1所述的蛋白酶、对微生物中项1所述的蛋白酶产量进行调控中的用途：
15.c1)对编码所述蛋白酶的基因表达进行调控的物质；
16.c2)调控所述蛋白酶的活性或含量的物质。
17.5.根据项4所述的用途，其特征在于，通过使用下述任一种或两种以上来实现：
18.d1)编码项1所述蛋白质酶的核酸分子；
19.d2)含有d1)所述核酸分子的表达盒；
20.d3)含有d1)所述核酸分子的重组载体、或含有d2)所述表达盒的重组载体；
21.d4)含有d1)所述核酸分子的重组微生物、或含有d2)所述表达盒的重组微生物、或含有d3)所述重组载体的重组微生物。
22.6.一种对微生物进行重组的方法，所述方法包括：
23.向所述微生物中导入用于表达项1所述蛋白酶的编码基因；
24.任选对用于表达项1所述蛋白酶的编码基因进行调控以提高所述蛋白酶的活性或产量。
25.7.根据项2或3所述的生物材料、项4所述的用途、项6所述的方法，其特征在于，所述微生物为如下任一种：大肠杆菌；枯草芽孢杆菌；酿酒酵母。
26.8.一种制备l-肌肽的方法，其特征在于，所述方法包括利用项1所述的蛋白酶或项2或3所述的生物材料或项6所述方法制备得到的重组微生物生产l-肌肽。
27.9.根据项8所述的方法，其中，所述底物为β-丙氨酸甲酯盐酸盐和l-组氨酸或β-丙氨酸和l-组氨酸。
28.发明的效果
29.本技术所述的蛋白酶既可利用β-丙氨酸甲酯盐酸盐和l-组氨酸为底物，也可利用β-丙氨酸和l-组氨酸为底物，即可降低成本，也可以利用由于β-丙氨酸甲酯盐酸盐不稳定而产生的β-丙氨酸。
30.本技术所述的蛋白酶酶学性质稳定，即转化条件宽泛，有利于工业化的进行。
31.本技术采用蛋白酶催化合成l-肌肽，避免了常规化学方法繁琐的过程，有效降低了生产成本，提高经济效益；同时，该合成工艺简单、绿、环保，符合洁净生产的要求，具有广泛的工业应用前景。
附图说明
32.图1为蛋白酶的琼脂糖核酸电泳图。
33.图2为蛋白酶的sds-page蛋白电泳图。
34.图3为蛋白酶的酶学性质-温度示意图图。
35.图4为蛋白酶的酶学性质-ph示意图。
36.图5为蛋白酶的酶的稳定性-温度示意图。
37.图6为蛋白酶的酶的稳定性-ph示意图。
具体实施方式
38.下面结合所描述的实施方式对本技术做以详细说明。虽然显示了本技术的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本技术，并且能够将本技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。
39.需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领
域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本技术的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本技术的范围。本技术的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
40.在本文中，术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸分子”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
41.在本文中，术语“载体”用于描述可以被工程化以含有可以在宿主细胞中扩增的克隆的一种多核苷酸或多种多核苷酸的核酸分子。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端，没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含dna，rna或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以插入额外dna片段的环状双链dna环，例如通过标准分子克隆技术。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
42.此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的那些基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”或“重组载体”。重组载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本技术的核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节元件，其可以基于用于表达的、可以与待表达的核酸序列可操作地连接的宿主细胞来选择。
43.在本文中，术语“重组微生物”包括微生物(例如细菌、酵母、藻、真菌等)或微生物菌株，其已经被遗传改变、修饰或工程化(例如遗传工程化)以便其与其来源的天然发生微生物或“亲本”微生物相比显示改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响了微生物的编码核酸序列时)。
44.术语“表达盒”是指能够在微生物中表达本技术的具有肌肽水解酶功能的蛋白酶的dna，该dna不仅包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
45.本技术提供了一种具有肌肽水解酶功能的蛋白酶，其包含如seq id no:6所示的氨基酸序列或者由如seq id no:6所示的氨基酸序列组成。
46.在本技术中，所述蛋白酶是将底物水解成肌肽的酶。
47.seq id no:6的氨基酸序列如下：
48.mtsqtptrkprardlglpftgvtgpynaitdvdgvgvgfqtiieneprpgrkrparsgvtailph
49.kqsetpvpvyagvhrfngngemtgthwiedggyflgpvvitnthgigmahhatvrwmvdryast
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54.本领域技术人员可以理解，与seq id no：6所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性，但是与seq id no：6所示的氨基酸序列具有相似活性的多肽也属于本技术蛋白酶的范围之内。
55.在seq id no：6所示的氨基酸序列的基础上经过修饰、和/或一个或几个氨基酸的取代、和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸并与seq id no：6所示氨基酸序列具有95％或96％或97％或98％或99％同一性、且具有相同功能的多肽也在本技术蛋白酶的保护范围内。
56.在seq id no：6所示的氨基酸序列的基础上经过修饰、和/或一个或几个氨基酸的取代、和/或缺失和/或添加一个或几个或数十个氨基酸且具有相同功能的多肽也在本技术蛋白酶的保护范围内。
57.进一步地，在seq id no:6所示的氨基酸序列的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白也在本技术蛋白酶的保护范围之内。
58.本技术还提供一种生物材料，其中所述生物材料可以是下述任意一种：
59.b1)编码上述蛋白酶的核酸分子；
60.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
61.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
62.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物。
63.进一步的，所述核酸分子的核苷酸序列seq id no:2如下：
64.atgacttcacaaacgccaacaaggaaacccagagcccgtgacctgggcctgccgtttacgggagtaactggaccgtataacgcgatcaccgacgtggacggtgttggtgtgggtttccagacc atcatcgagaacgaaccgcgtccgggtcgcaagcgcccagcgcgttccggcgtcaccgcgatcctgccgcacaaacagtccgaaaccccggtcccagtctacgctggtgttcatcgttttaatggtaacggcgaaatgaccggcacgcattggatcgaggatggtggctatttcctgggtccggtcgttattaccaatacccacggcatcggtatggcacatcatgcaaccgttcgctggatggtggaccgctatgcaagcacctaccagaccgatgattttctgtggattatgccggtggttgctgaaacctacgatggcgcattgaatgacatcaacggcttcccggtgaccgaggccgatgttcgtaaagcgttggacaacgtggcttctggtcctgtgcaagagggcaactgcggtggcggtacgggcatgattacgtacggcttcaagggtggcaccggcactgcgtctcgcgttgtagagttcggcggtaggtcctttaccatcggtgctttggtgcaggcgaatcatggtcaacgtgactggctgaccattgcgggtgttccggtgggccaacacatgcgtgacggcaccccgcagtcgcaactccaagagcgtggtagcattatcgtggtgctggcgactgacttaccgctgatgccgcaccagctgaaacgtcttgcgcgccgtgcgagcattggcattggtcgtaatggtacgccgggtggcaacaacagcggtgatatttttatcgcgtttagcaccgcgaaccagcgtccgatgcagcaccgtagcgcaccgttcctcgacgtcgagatggttaatgatgaaccgctggacacggtttacctggcggctgttgacagcgtcgaggaagcagtggtgaacgccatgatcgctgcggaagatatgggtggcaccccattcgatcgcttgctggttcaggcgattgaccacgaacgcctgcgcgccgtgctgcgtcaatatggacgtttggcctaa
65.在本技术中，seq id no:2所示的核酸序列由seq id no:1的核酸序列进行密码子优化得到，优选的，在本技术中，对于密码子优化的方法，本技术不作任何限制，其可以是本领域常用的密码子优化的方法进行优化，例如在本技术中，密码子优化由金瑞斯公司完成。
66.在本技术中，seq id no:1所示的核酸序列是从可产l-肌肽的苍白杆菌中获得的，所述苍白杆菌(ochrobactrum sp.)于2022年08月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委
员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.25590，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
67.在本技术中，seq id no:1所述的核酸序列为：
68.atgacttcacaaacacctacacgtaaaccgcgcgctcgcgatcttgggcttcctttcactggtgtgaccggtccgtacaacgcgatcaccgatgtcgatggcgttggcgtcggctttcagaccattatcgagaacgagccgcgccccggccgcaagcgtccggcgcgtagcggcgtgaccgccattctgccgcataagcagtctgaaaccccggttccggtttatgcaggcgtccatcgcttcaacggcaatggtgagatgaccggaacgcactggatcgaagatggcggctacttcctgggccctgtcgttatcaccaacacgcacggtatcggcatggcacatcatgcgacagtgcgctggatggttgaccgctatgcctcgacctaccagaccgacgatttcctctggatcatgccggttgtcgcagaaacttatgacggtgcactcaacgacatcaacggctttcctgtgacggaagcggatgtgcgcaaggcgctcgacaatgttgcatccggcccggtgcaggaaggcaattgcggcggcggcaccggtatgatcacctatggcttcaagggcggtacaggcacggcatcgcgcgtcgtggagttcggcggtcgcagtttcaccatcggtgcgctggtgcaggccaatcacgggcagcgcgattggctgaccattgccggtgtgccggtggggcagcatatgcgggatggcacgccgcagagccagttgcaggagcgcggctcgatcatcgtcgtgctggcgaccgatctgccactgatgccgcaccagctgaagcgcctagcgcgtcgtgcaagcatcggcatcggccgtaacggaacgccgggcggtaacaattcgggcgatatttttatcgctttttccaccgccaaccagagacctatgcagcatcgttccgcgccctttctggacgtcgagatggtgaatgacgagccgcttgataccgtctatctggcggcggtcgatagtgtggaagaggcagtggttaatgcgatgatcgcggctgaggatatgggtggaacaccctttgaccggctgcttgttcaggccatagatcacgaacgtcttcgtgccgtgctgcgccaatatgggcgtcttgcctga
69.各种多核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组载体，该重组载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。重组载体可以是可以方便地经受重组dna程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。
70.载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染体外实体存在的载体，其复制独立于染体复制，例如质粒、染体外元件、微染体或人工染体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。
71.可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总dna，或可以使用转座子。载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。在一个具体的实施方式中，所述重组载体是包含seq id no：2所示的核苷酸序列的质粒。
72.本技术提供了一种载体，其包含上述所述的核酸分子。在一些实施方式中，所述载体为重组载体。在一些实施方式中，所述重组载体为pet载体，优选为pet28a(+)。
73.例如，将编码上述所述蛋白酶的一种或多种核酸克隆到合适的一种或多种重组载体中，重组载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿
主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
74.所述载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对待引入载体的宿主的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，酌情并考虑载体是基于dna还是基于rna。
75.在本技术中，将载体用限制性核酸内切酶进行酶切，并将包含seq id no:2所示的核酸分子通过连接酶与酶切后的载体进行连接得到包含上述核酸分子的载体。
76.本技术的生物材料还可以是包含任意一种上述的核酸分子、含有所述核酸分子的表达盒、含有所述核酸分子的重组载体、含有所述表达盒的重组载体、含有核酸分子的重组微生物、含有表达盒的重组微生物或含有重组载体的重组微生物。
77.将包含多核苷酸的构建体或载体引入微生物中，这样使得该构建体或载体作为染体整合体或作为自主复制的染体外载体维持。术语“微生物”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。微生物的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
78.本技术的微生物可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、酵母菌、霉菌、变形虫、以及更普遍的单细胞生物体，其可以在实验室中进行操控和操作。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。酵母菌包括但不限于：假丝酵母(candida)、隐球菌(cryptococcus)、酿酒酵母(saccharomyces)和毛孢子菌(trichosporo)。霉菌包括但不限于：曲霉菌(aspergillus)、青霉菌(penicillium)、分枝孢子菌(cladosporium)。
79.在一些实施方式中，所述微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酿酒酵母。
80.本技术提供了一种宿主细胞，其包含上述所述的核酸分子或者上述所述的重组表达载体，其中，所述宿主细胞表达上述所述的蛋白酶。
81.为了产生蛋白酶，可以将编码蛋白酶的核酸分子分离，并且将其插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆/或表达。可以使用常规技术(例如，通过使用能够与编码蛋白酶的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这种核酸。
82.所述宿主细胞是指已引入外源核酸的宿主细胞，包括此类宿主细胞的后代。
83.对于载体导入宿主细胞中的方法是公知的，例如以热击的方法将载体导入到宿主细胞中。
84.在一些实施方式中，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞，优选为原核细胞。在一些实施方式中，所述原核细胞为大肠杆菌。
85.作为大肠杆菌，可举出例如w3110株(atcc 27325)和mg1655株(atcc 47076)等大肠杆菌k-12株，大肠杆菌k5株(atcc 23506)，bl21(de3)株等大肠杆菌b株，以及它们的衍生株。
86.本技术提供了一种表达上述所述蛋白酶的方法，包括将上述所述的宿主细胞表达，并进行分离纯化得到。
87.所述将宿主细胞表达指的是将宿主细胞进行培养，培养基和培养条件对于本领域技术人员来说是公知的，例如使用lb、ypd、ynb等培养基进行培养。
88.对于表达方式，本发明不作任何限制，其可以根据需要进行确认，例如表达为组成表达或诱导表达或者二者的结合，对于诱导表达，其诱导剂可以为iptg、β-半乳糖苷、甲醇、乙醇等。
89.在本技术中，对于分离纯化的方法，本技术不作任何限制，其可以按照本领域常规的方法进行分离纯化，例如，将细胞进行表达后，进行破壁离心得到。
90.本技术还提供下述任一种材料在制备上述蛋白酶、对微生物中上述蛋白酶产量进行调控中的用途：
91.c1)对编码所述蛋白酶的基因表达进行调控的物质；
92.c2)调控所述蛋白酶的活性或含量的物质。
93.其中，对编码所述蛋白酶的基因表达进行调控的物质是指可以调节和控制编码本技术的具有肌肽水解酶功能的蛋白酶的基因表达的物质，包括启动子、增强子、终止子、增加基因拷贝数、诱导表达、突变序列、融合蛋白表达等。
94.在本文中，术语“启动子”是rna聚合酶识别、结合和开始转录的一段dna序列，它含有rna聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。但有一些启动子(如trna启动子)位于转录起始点的下游,这些dna序列可以被转录。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于转录起始位点的上游。
95.术语“增强子”是dna上一小段可与蛋白质结合的区域，与蛋白质结合之后，基因的转录作用将会加强。增强子可能位于基因上游，也可能位于下游。且不一定接近所要作用的基因，这是因为染质的缠绕结构，使序列上相隔很远的位置也有机会相互接触。
96.术语“终止子(terminator t)”是给予rna聚合酶转录终止信号的dna序列。在一个操纵元中至少在结构基因最后一个基因的后面有一个终止子。术语“多拷贝基因”是特定基因自然状态下或者通过人工手段使特定基因发生大量重复。
97.术语“诱导表达”是指基因在诱导物(如代谢产物)的作用下，该基因的表达被启动或增强。
98.术语“突变”是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。
99.调控所述蛋白酶的活性或含量的物质是指可以调节和控制编码本技术的具有肌肽水解酶功能的蛋白酶的活性或者含量的物质，包括启动子、增强子、终止子、增加基因拷贝数、诱导表达、突变序列、融合蛋白表达等。
100.上文中，所述调控可为上调或增强或提高，或下调或减弱或降低。
101.其中，上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因的表达或所述蛋白质的活性或含量能够上调或增强或提高微生物具有肌肽水解酶功能的蛋白酶产量。
102.下调或减弱或降低所述蛋白质的编码基因的表达或所述蛋白质的活性或含量能够下调或减弱或降低微生物具有肌肽水解酶功能的蛋白酶产量。
103.上文中，调控所述蛋白质的编码基因(简称基因)的表达可为进行如下6种调控中的至少一种调控：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也
就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
104.在一个具体的实施方式中，上述用途可以通过本技术的上述任意一种或两种以上的生物材料实现。
105.本技术还提供一种对微生物进行重组的方法，所述方法包括：
106.向微生物中导入用于表达本技术蛋白酶的编码基因。
107.进一步地，在将用于表达本技术蛋白酶的编码基因导入微生物时，可以对编码基因进行调控以提高所述蛋白酶的活性或产量。
108.本技术提供了上述所述的蛋白酶在制备肌肽中的应用。在一些实施方式中，底物为β-丙氨酸甲酯盐酸盐和l-组氨酸或者为β-丙氨酸和l-组氨酸。
109.本技术所述的蛋白酶既可以以β-丙氨酸甲酯盐酸盐和l-组氨酸为底物，也可以以β-丙氨酸和l-组氨酸为底物，降低了成本。
110.本技术提供了一种制备肌肽的方法，包括：
111.使用上述所述的蛋白酶催化底物进行反应得到肌肽。在一些实施方式中，所述底物为β-丙氨酸甲酯盐酸盐和l-组氨酸或者为β-丙氨酸和l-组氨酸。
112.在本技术中，反应的温度为20-60℃，优选为50-60℃。
113.例如，反应的温度可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等。
114.在本技术中，反应的ph值为7.0-11.0，优选为7.0-8.0。
115.例如，反应的ph值为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0等。
116.本技术所述的蛋白酶的酶学性质稳定，并且使用所述的蛋白酶酶解底物所得到的肌肽产量高。
117.本技术提供了上述所述的蛋白酶在制备含肌肽的药品或化妆品中的应用。
118.实施例
119.本技术对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
120.实施例1蛋白酶工程菌构建
121.1、质粒构建：
122.经大量的菌株筛选工作从鱼肠道中获得的一株可产l-肌肽的菌株，其16srna序列如seq id no:8所示，经鉴定该菌株为苍白杆菌(ochrobactrum sp.)，其于2022年08月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏编号：cgmcc no.25590，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，选定ncbi中蛋白酶的保守序列(如seq id no:7所示)为模板设计引物(如seq id no:3、seq id no:4所示)，将苍白杆菌中的蛋白酶核酸序列扩增出来，得到如seq id no:1所示的核酸序列，蛋白酶核酸序列扩增条件如下：98℃，1s；98℃，10s；53℃，15s；72℃，15s)循环30次；72℃，5min；4℃保温。
123.根据大肠杆菌密码子偏好性对seq id no:1所示的核酸序列进行优化，密码子优化由金瑞斯公司完成，获得如seq id no:2所示的核苷酸序列。优化后的核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq id no:6所示，其与野生型核苷酸序列编码的氨基酸序列一致。密码子优化的肌肽水解酶序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成。
124.将质粒pet28a(+)用限制性核酸内切酶bamhⅰ和smiⅰ酶切，然后将如seq id no:2所述的核苷酸序列通过t4dna连接酶与之连接，即得重组载体pet28a(+)-jt。
125.2、重组酶工程菌构建：
126.(1)将重组载体pet28a(+)-jt水溶液，与大肠杆菌bl21感受态温和混匀，冰浴30min。
127.(2)42℃水浴热激90s，并迅速冰浴3min。
128.(3)加入500μl新鲜的lb液体培养基，37℃复苏1h。
129.(4)复苏后的菌悬液涂布带抗生素的lb筛选平板。
130.(5)lb筛选平板于37℃倒置培养过夜。
131.3、验证：
132.(1)挑取单菌落，重新划平板，将lb筛选平板于37℃倒置培养过夜。
133.(2)挑取2～5mm菌苔，接种到新鲜的含50mg/ml卡纳霉素的lb液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜。
134.(3)收集菌体，根据质粒提取说明书(上海生工)提取质粒。
135.(4)配制1％琼脂糖凝胶，电泳检测质粒大小，其结果如图1所示。
136.从图1可以看出，质粒长度符合预期。
137.实施例2摇瓶发酵产蛋白酶
138.(1)制备种子：挑取2-5mm实施例1制备得到的菌苔(由菌落连成片形成)，接种到新鲜的含50mg/ml卡纳霉素的lb液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜。
139.(2)摇瓶发酵：按1％的接种量，将实施例1所述的蛋白酶工程菌接入含50mg/ml卡纳霉素的lb液体培养基中，初始培养温度为30-40℃，培养至od
600
＝0.5-0.8时加入终浓度为0.1-0.8mm的iptg作为诱导剂，诱导温度为15-30℃，在转速为200-300rpm的条件下诱导培养10-24h，得到发酵液。
140.(3)破壁：发酵液通过8000-15000rpm离心5-20min收集菌体，向菌体中加入发酵液体积20-80％的纯化水重悬菌体，并用超声破碎仪进行破壁，30hz频率下处理5-20min，获得细胞破壁液。
141.(4)粗提：将细胞破壁液在8000-15000rpm条件下离心5-20min，收集上清液，即为蛋白酶酶液，其中蛋白酶的氨基酸序列如seq id no：6所示。
142.将蛋白酶液进行sds-pega电泳检测，检测结果如图2所示。
143.从图2可以看出，酶液中蛋白条带大小符合预期。
144.实施例3蛋白酶的酶活测定
145.1、酶活测定反应过程
146.按下表1加入反应底物，加入200μl实施例2所得酶液，然后将体系用纯化水定容至10ml。将反应体系置于25℃恒温混匀仪反应30min，向反应液中加入约180μl浓盐酸，将ph调至3～4，从而使酶失活。计算酶活：每分钟生成1μmol产物定义为1个酶活单位。
147.表1 酶活反应体系(10ml)
148.试剂添加量(ml)0.2m l-组氨酸50.5mβ-丙氨酸甲酯盐酸盐/0.5mβ-丙氨酸1
碳酸钠缓冲液2
149.2、样品检测-衍生化
150.按表2加入反应试剂，
151.表2 衍生反应体系(50ml，容量瓶)
152.组分体积/ml样品5碳酸氢钠溶液52，4-二硝基氟苯乙腈溶液2.5
153.加入上述组分后混匀，60℃水浴1h，待反应结束后，冷却至室温，用0.01m磷酸二氢钾溶液定容至50ml。
154.3、样品检测-液相检测
155.将各样品用0.22μm的滤膜过滤上样，液相条件：c18plus谱柱，流动相为乙腈：0.05m乙酸钠(1l添加100μl冰醋酸)＝3：7，流速0.8ml/min，进样量20μl，柱温35℃，紫外检测器360nm。记录样品中肌肽的峰面积，并用外标法计算肌肽含量，从而计算出酶活。酶活为每毫升酶液每分钟产生的产物的微摩尔量。
156.肌肽生成量公式如下：
157.肌肽含量：
158.c：样品中肌肽浓度，mg/ml
159.cr：肌肽标准品浓度，mg/ml
160.a：样品中肌肽峰面积
161.ar：标准品肌肽峰面积
162.d：样品稀释倍数
163.其中，以β-丙氨酸甲酯盐酸盐和l-组氨酸为底物，肌肽水解酶为催化剂，催化合成l-肌肽，肌肽水解酶的酶活为0.4u/ml；以β-丙氨酸和l-组氨酸为底物，蛋白酶为催化剂，催化合成l-肌肽，蛋白酶的酶活为12.3u/ml。
164.实施例4蛋白酶的酶学性质鉴定
165.1、蛋白酶工程菌所产的蛋白酶的有效温度和最适温度
166.设置10个温度梯度：20、25、30、35、40、45、50、60、80、100℃，按表1加入反应底物，加入200μl实施例2所得酶液，然后将体系用纯化水定容至10ml。将反应体系置于恒温混匀仪反应30min，向反应液中加入约180μl浓盐酸，将ph调至3～4，从而使酶失活。计算酶活：每分钟生成1μmol产物定义为1个酶活单位，按照与实施例3相同的方法测定酶活，其结果如图3所示。
167.从图3可以看出，该蛋白酶的有效温度范围为20-60℃，最适温度为60℃。
168.2、蛋白酶工程菌所产的蛋白酶的有效ph和最适ph
169.设置14个ph梯度：4、5、6、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13，按表1加入反应底物，加适量naoh或盐酸调节ph到指定值，加入200μl实施例2所得酶液，然后将体系用纯化水定容至10ml。将反应体系置于恒温混匀仪，25℃反应30min，向反应液中加入适量浓盐酸，将ph调至3～4，从而使酶失活，按照与实施例3相同的方法测定酶活，其结果如图4所示。
170.从图4可以看出，该蛋白酶的有效ph范围为7-11，最适ph为7.5。
171.3、蛋白酶工程菌所产的蛋白酶的温度稳定性
172.设置7个温度梯度：25、40、45、50、60、80、100℃，将酶液分别取1ml于不同温度金属浴中温育1h后，按表1加入反应底物，将ph调至9.0，加入200μl实施例2所得酶液，然后将体系用纯化水定容至10ml。将反应体系置于摇床中25℃反应30min，向反应液中加入约180μl浓盐酸，将ph调至3～4，从而使酶失活，按照与实施例3相同的方法测定酶活，其结果如图5所示。
173.从图5可以看出，在温度为25-50℃时，蛋白酶的酶活相对稳定。
174.4、蛋白酶工程菌所产的肌肽水解酶的ph稳定性
175.设置5个ph梯度：7、7.5、8、8.5、9，将酶液分别取1ml于试管中，加适量naoh或盐酸调节ph到不同ph值下维持1h后，按表1加入反应底物，将ph调至9.0，加入200μl实施例2所得酶液，然后将体系用纯化水定容至10ml。将反应体系置于摇床中25℃反应30min，向反应液中加入约180μl浓盐酸，将ph调至3～4，从而使酶失活，按照与实施例3相同的方法测定酶活，其结果如图6所示。
176.从图6可以看出，在ph为7-9时，蛋白酶的酶活相对稳定。
177.实施例5肌肽产量验证
178.按表3加入反应底物和实施例2所得酶液，在下述ph和温度条件下转化24h。转化结束后加入适量浓盐酸，使酶灭活，按照实施例3的方法测定肌肽的含量，测得肌肽产量为1.36g/l，是苍白杆菌菌株的68倍。
179.表3 转化条件
180.ph温度l-组氨酸β-丙氨酸实施例2所得酶液转化体系8.030℃0.465g(15.5g/l)1.335g(44.5g/l)10ml30ml
181.实施例6肌肽产量验证
182.按表4加入反应底物和实施例2所得酶液，在下述ph和温度条件下转化24h。转化结束后加入适量浓盐酸，使酶灭活，按照实施例3的方法测定肌肽的含量，测得肌肽产量为15.80g/l。
183.表4 转化条件
184.ph温度l-组氨酸β-丙氨酸甲酯盐酸盐实施例2所得酶液转化体系8.030℃0.465g(15.5g/l)2.094g(69.8g/l)10ml30ml
185.序列表
186.187.[0188][0189]
以上所述，仅是本技术的较佳实施例而已，并非是对本技术作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本技术技术方案内容，依据本技术的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本技术技术方案的保护范围。

技术特征：

1.一种具有肌肽水解酶功能的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶包含如seq id no:6所示的氨基酸序列。2.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：b1)编码权利要求1所述蛋白酶的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物。3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述的核酸分子包含如seq id no:2所示的核酸序列。4.下述任一种材料在制备权利要求1所述的蛋白酶、对微生物中权利要求1所述的蛋白酶产量进行调控中的用途：c1)对编码所述蛋白酶的基因表达进行调控的物质；c2)调控所述蛋白酶的活性或含量的物质。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，通过使用下述任一种或两种以上来实现：d1)编码权利要求1所述蛋白质酶的核酸分子；d2)含有d1)所述核酸分子的表达盒；d3)含有d1)所述核酸分子的重组载体、或含有d2)所述表达盒的重组载体；d4)含有d1)所述核酸分子的重组微生物、或含有d2)所述表达盒的重组微生物、或含有d3)所述重组载体的重组微生物。6.一种对微生物进行重组的方法，所述方法包括：向所述微生物中导入用于表达权利要求1所述蛋白酶的编码基因；任选对用于表达权利要求1所述蛋白酶的编码基因进行调控以提高所述蛋白酶的活性或产量。7.根据权利要求2或3所述的生物材料、权利要求4所述的用途、权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微生物为如下任一种：大肠杆菌；枯草芽孢杆菌；酿酒酵母。8.一种制备l-肌肽的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的蛋白酶或权利要求2或3所述的生物材料或权利要求6所述方法制备得到的重组微生物生产l-肌肽。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述底物为β-丙氨酸甲酯盐酸盐和l-组氨酸或β-丙氨酸和l-组氨酸。

技术总结

本申请公开了一种具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在L-肌肽合成中应用，所述的蛋白酶包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。本申请所述的蛋白酶既可利用β-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-组氨酸为底物，也可利用β-丙氨酸和L-组氨酸为底物，即可降低成本，也可以利用由于β-丙氨酸甲酯盐酸盐不稳定而产生的β-丙氨酸。丙氨酸。