一种利用芽孢杆菌Bacillus.spHZ3制备生物纳米银的方法

一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法
技术领域
1.本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法。

背景技术：

2.作为一种稀有的贵金属元素金属，银具有独特的贵金属和工业金属用途组合，在货币、医药、艺术和珠宝中、电器设备中均有使用，也是地球上用途最广泛的金属之一。银早在古代就被人们认识到具有抗菌和杀菌作用。古代的中西方典籍中，均有较多含银物质药用的记载。中医历代文献资料中早就有银“止狂热惊悸”的描述，西方文献也有“银用于心跳过速、呼吸急促”的记载。近年来，随着纳米技术的飞速发展，纳米级银单质(纳米银)因其独特的物理化学性质及生物学性质，已被广泛地应用于多个领域，成为最具发展潜力的纳米材料之一。根据欧洲消费者组织(beuc)2016年的调查结果，市场上大约有2000种消费品含有纳米材料，其中大约25％中含有纳米银。
3.与常规银制品相比，纳米银(silver nanoparticles,简称agnps)具有广谱的抗菌性能、高效的抗菌活性、低毒和不易使微生物产生抗药性等优点，在化妆品、纺织品、食品储藏保鲜、膳食补充剂、食品和医药包装等领域得到广泛的应用。常规纳米银合成方法包括化学还原法、真空气体冷凝法、高压磁控溅射法、激光烧蚀法和机械研磨法等。这些方法要么需要专门的仪器设备，且耗能高，要么涉及有毒化学还原剂、稳定剂及分散剂的添加，限制了纳米银在生物医学领域的应用范围。更重要的是，传统方法制备的纳米银在粒径较小或浓度很高时，很容易发生“团聚”，影响后续毒理实验操作准确性，更限制了其抗菌性能的发挥。目前新兴的、符合可持续发展的生物法逐渐成为制备纳米银的研究热点
4.生物法合成纳米银，反应条件温和，成本低廉，对环境友好。同时，生物体中含有许多具有还原性和稳定性的活性成分，在还原ag+合成纳米银的同时，还能对制备的纳米银粒子形成覆盖隔离的效果，以减少粒子间的团聚，使得合成的纳米银比常规方法合成的纳米银稳定性更强，因此成为目前纳米银合成的研究热点。生物法合成纳米银主要通过细菌，真菌和植物提取物等完成。其中，细菌因其繁殖迅速，便于通过遗传工程操作改造，在制备纳米银方面有很大的优势。目前已报道多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa，芽孢杆菌bacillus sp.，不动鞘氨醇单胞菌sphingomonas paucimobilis等菌株可以合成纳米银。然而，由于ag+具有较强的杀菌作用，只有少数对ag+有较强抗性的菌株才能采用菌液胞内合成的方法。而目前分离得到的细菌对银离子ag+的耐受性普遍不高，因此这些细菌还原制备纳米银多采用细菌的培养上清液和菌体内含物进行，都属于胞外间歇式生产纳米银，无法做到在菌体生长过程中连续合成，这也在一定程度上限制了纳米银的产量。
5.公布号为cn110026569a的中国专利，公开了一种纳米银颗粒的制备方法，包括以下步骤：混合含有乙基纤维素作为分散剂的分散剂溶液以及含银离子的溶液，调节溶液的ph值，在超声搅拌的条件下控制反应温度滴入还原剂来还原并沉淀出纳米银颗粒，然后使所述纳米银经过固液分离、洗涤、然后冷冻干燥。该方法使用少量乙基纤维素作为分散剂包
覆在银颗粒表面，乙基纤维素本身在电子浆料、导电墨水的应用中作为粘合剂和成膜剂使用，既保证了纳米银的分散和稳定性，又解决了现有技术中(如微乳液法)中溶剂和银粉破乳、分离困难的问题，简化了工艺，降低了成本，提升了银粉的性能。但该方法合成过程中需要超声处理，还需要精确控制反应温度，因此依然存在操作步骤复杂，效率低的问题，还需要进一步改进。

技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于如何解决现有的利用传统物理、化学方法制备纳米银容易对环境造成危害、操作复杂、效率低的问题。
7.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
8.菌株说明：本发明所使用的芽孢杆菌bacillus.sphz3，保藏编号：cctcc no：m20221472，保藏日期：2022年9月21日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
9.本发明提供一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，包括以下步骤：
10.(1)制备菌种培养液：挑取bacillus.sp hz3单菌落，加入至yep培养基中培养，获得菌种培养液；
11.(2)发酵培养：将步骤(1)获得的菌种培养液加入到发酵培养基中，培养至培养液中bacillus.sp hz3菌数量达到107cfu/ml；
12.(3)添加诱导剂：向步骤(2)获得的培养液中，加入诱导剂，继续培养至培养液中bacillus.sp hz3菌数量达到108cfu/ml；
13.(4)添加agno3：向步骤(3)获得的培养液中，加入agno3溶液；
14.(5)诱导合成生物纳米银：添加agno3后，先采用常温培养，再转入低温培养，随后再次转入常温培养，培养至培养液颜由浅黄变为褐，且颜不再变深时，纳米银完全生成；
15.(6)分离提取生物纳米银：将步骤(5)获得的培养液置于离心管中，进行初步离心操作，弃去菌体沉淀，收集上清液；再将上清液置于干净的离心管中，进行二次离心操作，获得的沉淀重悬于双蒸水中，即为制得的纳米银。
16.有益效果：本发明通过采用特殊的菌株芽孢杆菌bacillus.sp hz3，生物法合成纳米材料，反应条件温和，成本低廉，操作简便，提高了制备纳米银的效率。
17.优选的，所述步骤(1)中的yep液体培养基由蛋白胨5-10g，牛肉粉3-5g，酵母粉5-10g，维生素b
2 1-3mg，纯水1000ml制成。
18.优选的，所述步骤(2)中，将步骤(1)获得的菌种培养液按照1-3％(v/v)加入到发酵培养基中。
19.优选的，所述步骤(2)中发酵培养基由蛋白胨5-10g，牛肉粉3-5g，酵母粉5-10g，氯化钠1-3g，无水硫酸镁0.1-0.5g，维生素b
2 1-3mg，纯水1000ml制成。
20.优选的，所述步骤(3)中诱导剂为谷胱甘肽(gsh)，硝酸钠，冰乙酸，多聚赖氨酸中的一种或者多种。
21.优选的，所述步骤(3)中诱导剂的浓度为1-15mg/l。
22.优选的，所述步骤(4)中agno3溶液的浓度为80-120mol/l，所述agno3溶液与培养液的体积比为(1-2)：20。
23.优选的，所述步骤(5)中常温均指30-37℃，低温是指15-20℃。
24.优选的，所述步骤(5)中，先采用30-37℃、150-200rpm振荡培养8-14h，随后转入低温培养，15-20℃、150-200rpm继续振荡培养8-14h，随后再次转入30-37℃、150-200rpm振荡培养。
25.优选的，所述步骤(6)中初步离心的转速为6000-10000r/min，时间3-8min。
26.优选的，所述步骤(6)中二次离心的转速为20000-30000r/min，时间10-20min。
27.优选的，所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中培养的条件均为28-37℃、150-200rpm振荡培养。
28.优选的，所述步骤(1)中培养的时间为12-14h；步骤(2)中培养的时间为6-8h；步骤(3)中培养的时间为4-6h。
29.实验结果：所得到的纳米银颗粒，利用纳米激光粒度仪测量，粒径范围为10-30nm。采用扫描电子显微镜及能谱仪(sem-edx)，观察到粒径为10-50nm的纳米颗粒，edx能谱显示出ag的特征峰，表明制备的纳米颗粒为纳米银颗粒。
30.本发明的优点在于：
31.(1)本发明通过采用特殊的菌株芽孢杆菌bacillus.sp hz3，生物法合成纳米材料，反应条件温和，成本低廉，操作简便，提高了制备纳米银的效率。
32.(2)本发明采用的纳米银合成菌株芽孢杆菌bacillus.sphz3，对重金属(cu，pb，ag等)均具有非常强的耐受性和还原能力。该菌株可以耐受10mm的硝酸银，且可以在生长的过程中，持续不断合成纳米银，从而大大降低纳米银的生产成本。
33.(3)本发明针对bacillus.sphz3合成纳米银的特点，在合成过程中添加了专用诱导剂，并采用了高温培养-低温培养-高温培养相结合的方法，从而更进一步提高了纳米银的合成效率，使得芽孢杆菌bacillus.sphz3在24h内即可将硝酸银全部转化为纳米银，大大提高了纳米银的合成效率。
附图说明
34.图1为芽孢杆菌bacillus.sphz3培养过程中添加ag+和不添加ag+的生长状况对比图；
35.图2为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米银的透射电镜图；
36.图3为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米银颗粒的元素组成的eds分析图；
37.图4为不同培养条件下芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米银的扫描电镜图；
38.图5为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米银uv/vis波长扫描结果图；
39.图6为添加诱导剂与不添加诱导剂对芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米银的影响图。
具体实施方式
40.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.实施例1：
42.一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，包括以下步骤：
43.(1)制备菌种培养液：挑取bacillus.sp hz3单菌落，加入至yep培养基中，28℃、150rpm振荡培养14h，获得菌种培养液；yep液体培养基由蛋白胨5g，牛肉粉3g，酵母粉5g，维生素b
2 1mg，纯水1000ml制成；
44.(2)发酵培养：将步骤(1)获得的菌种培养液按照1％(v/v)加入到发酵培养基中，28℃、150rpm振荡培养8h，至培养液中bacillus.sp hz3菌数量达到107cfu/ml；发酵培养基由蛋白胨10g，牛肉粉5g，酵母粉10g，氯化钠3g，无水硫酸镁0.5g，维生素b
2 3mg，纯水1000ml制成；
45.(3)添加诱导剂：向步骤(2)获得的培养液中，加入诱导剂(谷胱甘肽gsh，硝酸钠，质量比1:2)，使得诱导剂终浓度为1mg/l，继续28℃、150rpm振荡培养6h，至培养液中bacillus.sp hz3菌数量达到108cfu/ml；
46.(4)添加agno3：向步骤(3)获得的培养液中，加入10mlagno3溶液的浓度为80mol/l，
47.(5)诱导合成生物纳米银：添加agno3后，先采用30℃、150rpm振荡培养14h，随后转入低温培养，15℃、150rpm继续振荡培养14h，随后再次转入30℃、150rpm振荡培养，培养至培养液颜由浅黄变为褐，且颜不再变深时，纳米银完全生成；
48.(6)分离提取生物纳米银：将步骤(5)获得的培养液置于离心管中，进行初步离心6000r/min，时间8min，弃去菌体沉淀，收集上清液；再将上清液置于干净的离心管中，进行二次离心20000r/min，时间20min，获得的沉淀重悬于双蒸水中，即为制得的纳米银。
49.将本实施例制得的纳米银，利用纳米激光粒度仪测量，结果显示粒径范围为15-50nm，采用扫描电子显微镜及能谱仪(sem-edx)，观察到粒径为30-40nm的纳米颗粒，edx能谱显示出ag的特征峰，表明制备的纳米颗粒为纳米银颗粒。
50.icp-aes测定结果表明，加入的硝酸银(agno3)有78.7％被转化成纳米银。
51.实施例2：
52.一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，包括以下步骤：
53.(1)制备菌种培养液：挑取bacillus.sp hz3单菌落，加入至yep培养基中，32℃、180rpm振荡培养13h，获得菌种培养液；yep液体培养基由蛋白胨8g，牛肉粉4g，酵母粉8g，维生素b
2 2
mg，纯水1000ml制成；
54.(2)发酵培养：将步骤(1)获得的菌种培养液按照2％(v/v)加入到发酵培养基中，32℃、180rpm振荡培养7h，至培养液中bacillus.sp hz3菌数量达到107cfu/ml；发酵培养基由蛋白胨8g，牛肉粉4g，酵母粉8g，氯化钠2g，无水硫酸镁0.3g，维生素b
2 2mg，纯水1000ml制成；
55.(3)添加诱导剂：向步骤(2)获得的培养液中，加入诱导剂(硝酸钠，冰乙酸，多聚赖氨酸，质量比1:2:3)，使得诱导剂终浓度为12mg/l，继续32℃、180rpm振荡培养5h，至培养液
中bacillus.sp hz3菌数量达到108cfu/ml；
56.(4)添加agno3：向步骤(3)获得的培养液中，加入8mlagno3溶液的浓度为100mol/l；
57.(5)诱导合成生物纳米银：添加agno3后，先采用32℃、180rpm振荡培养12h，随后转入低温培养，18℃、180rpm继续振荡培养12h，随后再次转入32℃、180rpm振荡培养，培养至培养液颜由浅黄变为褐，且颜不再变深时，纳米银完全生成；
58.(6)分离提取生物纳米银：将步骤(5)获得的培养液置于离心管中，进行初步离心8000r/min，时间5min，弃去菌体沉淀，收集上清液；再将上清液置于干净的离心管中，进行二次离心25000r/min，时间15min，获得的沉淀重悬于双蒸水中，即为制得的纳米银。
59.将本实施例制得的纳米银，利用纳米激光粒度仪测量，结果显示粒径范围为15-50nm，采用扫描电子显微镜及能谱仪(sem-edx)，观察到粒径为20-40nm的纳米颗粒，edx能谱显示出ag的特征峰，表明制备的纳米颗粒为纳米银颗粒。
60.icp-aes测定结果表明，加入的硝酸银(agno3)100％被转化成纳米银。
61.实施例3：
62.一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，包括以下步骤：
63.(1)制备菌种培养液：挑取bacillus.sp hz3单菌落，加入至yep培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h，获得菌种培养液；yep液体培养基由蛋白胨10g，牛肉粉5g，酵母粉10g，维生素b
2 3mg，纯水1000ml制成；
64.(2)发酵培养：将步骤(1)获得的菌种培养液按照3％(v/v)加入到发酵培养基中，37℃、200rpm振荡培养6h，至培养液中bacillus.sp hz3菌数量达到107cfu/ml；发酵培养基由蛋白胨5g，牛肉粉3g，酵母粉5g，氯化钠1g，无水硫酸镁0.1g，维生素b
2 1mg，纯水1000ml制成；
65.(3)添加诱导剂：向步骤(2)获得的培养液中，加入诱导剂(谷胱甘肽gsh，硝酸钠，冰乙酸，质量比1:2:2)，使得诱导剂终浓度为15mg/l，继续37℃、200rpm振荡培养4h，至培养液中bacillus.sp hz3菌数量达到108cfu/ml；
66.(4)添加agno3：向步骤(3)获得的培养液中，加入5mlagno3溶液的浓度为120mol/l；
67.(5)诱导合成生物纳米银：添加agno3后，先采用37℃、200rpm振荡培养8h，随后转入低温培养，20℃、200rpm继续振荡培养8h，随后再次转入37℃、200rpm振荡培养，培养至培养液颜由浅黄变为褐，且颜不再变深时，纳米银完全生成；
68.(6)分离提取生物纳米银：将步骤(5)获得的培养液置于离心管中，进行初步离心10000r/min，时间3min，弃去菌体沉淀，收集上清液；再将上清液置于干净的离心管中，进行二次离心30000r/min，时间10min，获得的沉淀重悬于双蒸水中，即为制得的纳米银。
69.将本实施例制得的纳米银，利用纳米激光粒度仪测量，结果显示粒径范围为20-50nm，采用扫描电子显微镜及能谱仪(sem-edx)，观察到粒径为30-40nm的纳米颗粒，edx能谱显示出ag的特征峰，表明制备的纳米颗粒为纳米银颗粒。
70.icp-aes测定结果表明，加入的硝酸银(agno3)有87.4％被转化成纳米银。
71.图1为芽孢杆菌bacillus.sphz3培养过程中添加ag+和不添加ag+的生长状况对比图；从图中可以看出，添加ag+后生成的纳米银使得培养液的颜更深(呈褐)；
72.图2为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米银的透射电镜图；
73.图3为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米银颗粒的元素组成的
eds分析图；从图中可以看出，合成的纳米颗粒明显具有ag的特征峰；
74.图4为不同培养条件下芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米银的扫描电镜照片(a：实施例2中制备的纳米银；b：实施例3中制备的纳米银)；
75.图5为本发明实施例2芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米银uv/vis波长扫描结果图；从图中可以看出，合成的纳米银在440nm处有特征峰；
76.图6为添加诱导剂与不添加诱导剂对芽孢杆菌bacillus.sphz3合成的纳米银的影响图，从图中可以看出，添加诱导剂合成的纳米银效率高于不添加诱导剂。
77.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：

1.一种利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备菌种培养液：挑取bacillus.sp hz3单菌落，加入至yep培养基中培养，获得菌种培养液；(2)发酵培养：将步骤(1)获得的菌种培养液加入到发酵培养基中，培养至培养液中bacillus.sp hz3菌数量达到107cfu/ml；(3)添加诱导剂：向步骤(2)获得的培养液中，加入诱导剂，继续培养至培养液中bacillus.sp hz3菌数量达到108cfu/ml；(4)添加agno3：向步骤(3)获得的培养液中，加入agno3溶液；(5)诱导合成生物纳米银：添加agno3后，先采用常温培养，再转入低温培养，随后再次转入常温培养，培养至培养液颜由浅黄变为褐，且颜不再变深时，纳米银完全生成；(6)分离提取生物纳米银：将步骤(5)获得的培养液置于离心管中，进行初步离心操作，弃去菌体沉淀，收集上清液；再将上清液置于干净的离心管中，进行二次离心操作，获得的沉淀重悬于双蒸水中，即为制得的纳米银。2.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的yep液体培养基由蛋白胨5-10g，牛肉粉3-5g，酵母粉5-10g，维生素b
2 1-3mg，纯水1000ml制成。3.根据权利要求1或2所述的利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将步骤(1)获得的菌种培养液按照1-3％(v/v)加入到发酵培养基中。4.根据权利要求3所述的利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵培养基由蛋白胨5-10g，牛肉粉3-5g，酵母粉5-10g，氯化钠1-3g，无水硫酸镁0.1-0.5g，维生素b
2 1-3mg，纯水1000ml制成。5.根据权利要求4所述的利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，其特征在于，所述步骤(3)中诱导剂为谷胱甘肽(gsh)，硝酸钠，冰乙酸，多聚赖氨酸中的一种或者多种；所述诱导剂的浓度为1-15mg/l。6.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，其特征在于，所述步骤(4)中agno3溶液的浓度为80-120mol/l，所述agno3溶液与培养液的体积比为(1-2)：20。7.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，其特征在于，所述步骤(5)中常温均指30-37℃，低温是指15-20℃。8.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，其特征在于，所述步骤(6)中初步离心的转速为6000-10000r/min，时间3-8min，二次离心的转速为20000-30000r/min，时间10-20min。9.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，其特征在于，所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中培养的条件均为28-37℃、150-200rpm振荡培养。10.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌bacillus.sp hz3制备生物纳米银的方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养的时间为12-14h；步骤(2)中培养的时间为6-8h；步骤(3)中培养的时间为4-6h。

技术总结

本发明公开了一种利用芽孢杆菌Bacillus.sp HZ3制备生物纳米银的方法，具体涉及微生物应用技术领域。本发明选育的芽孢杆菌Bacillus.spHZ3可以高效还原硝酸银，生产纳米银AgNPs。制备方法包括以下步骤：(1)制备菌种培养液；(2)发酵培养；(3)添加诱导剂；(4)添加AgNO3；(5)诱导合成生物纳米银；(6)分离提取生物纳米银。有益效果：本发明根据芽孢杆菌Bacillus.spHZ3还原硝酸银的特点，在培养过程中添加有助于增强纳米银合成效果的诱导剂，并通过高温培养-低温诱导培养-高温培养相结合的方法，最大程度提高纳米银的合成效率。最大程度提高纳米银的合成效率。最大程度提高纳米银的合成效率。