一种lncRNA-HRAT及其应用

一种lncrna-hrat及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种lncrna-hrat的应用。

背景技术：

2.对于急性心肌梗死的病人而言，最有效的挽救缺血心肌的方法是迅速恢复缺血心肌的血流供应，即再灌注。目前常釆用溶栓或经皮腔内冠状动脉成形术、冠状动脉旁路移植术、激光心肌血管重建术等有效的介入手段。然而再次恢复血供后，在随后的一段时间内组织或器官的损伤有可能未见减轻，反而进一步加重，表现为心律失常、心肌舒缩功能障碍、代谢异常及心肌超微结构的改变，即心肌缺血/再灌注(ischemia reperfusion，i/r)损伤。
3.目前关于心肌缺血再灌注损伤的发生机制主要有以下几种：氧自由基(reactive oxygen species,ros)损伤、钙超载、能量代谢障碍、炎症反应、细胞凋亡、细胞自噬等，但是心肌缺血再灌注损伤的机制尚未完全阐明，因此对心肌缺血再灌注损伤进行深入研究以寻到新的预防措施和靶点具有重要意义。
4.研究表明，人类转录组仅有不到2％的rna能编码蛋白质，其余的主要是非编码rna(noncoding rna，ncrna)，包括核糖体rna(ribosomal rna，rrna)、转运rna(transfer rna,trna)、微小rna(microrna，mirna)、长链非编码rna(long noncoding rna，lncrna)、环状rna(circular rna,circrna)，以及其他小rna。其中lncrna是一类转录本长度超过200nt(核苷酸单位)的功能性rna分子，它们缺乏编码蛋白的能力。lncrna通常较长，具有mrna样结构，经过剪接，具有polya尾巴和启动子结构，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式。但与大多数mrna相比，它们的外显子少而长，表达水平相对较低，初级序列保守性较差，且细胞和组织特异性高。研究证实，lncrna参与了许多重要的生物学现象，如x染体沉默、印记基因组位点、形成染体构象和调节变构酶活性。
5.lncrna的异常表达与多种疾病密切相关，如：心脑血管疾病、神经系统疾病、癌症等，因此，1ncrna可作为疾病的新靶点。最近的研究表明，lncrna是控制心血管发育的基因调控网络的关键组成部分，lncrna的异常表达与心脏疾病的发生和发展密切相关。有研究证实，在心肌缺血后早期再灌注的小鼠心脏组织中存在着一些异常表达的lncrna。之后的研究进一步证实，lncrna在心肌缺血再灌注损伤中具有重要作用。例如，lncrna-h19可通过抑制mir-877-3p-bcl-2介导的线粒体凋亡通路来减轻心肌细胞凋亡和心肌缺血再灌注损伤；抑制lncrna-tug1的表达可减轻其对mir-142-3p的吸附，进而下调mir-142-3p靶基因hmgb1和rac1的表达，最终改善缺血/再灌注引起的心肌损伤；抑制lncrna-xist的表达可通过调控mir-133a/socs2轴和抑制自噬来改善缺血/再灌注引起的心肌损伤。然而，这些lncrna分子的干预部分改善了心肌缺血再灌注损伤，但是否存在其他调节心肌缺血再灌注损伤的lncrna仍有待进一步研究。
6.因此，本发明拟通过rna测序筛选出心肌细胞缺氧/复氧损伤过程中异常表达的新lncrna，并探讨其在心肌缺血再灌注损伤中的作用，为心肌缺血再灌注损伤的提供新
的靶点和理论依据。

技术实现要素：

7.为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种lncrna-hrat，可用作心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤等疾病的生物标志物，或用于制备预防//诊断心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤等疾病的药物。
8.本发明的技术方案如下。
9.在第一个方面，本发明提供一种lncrna-hrat，包含seq id no:1或seq id no:2所示的核苷酸序列。
10.在第二个方面，本发明还提供编码上述lncrna-hrat的核酸分子及包含上述核酸分子的载体。
11.在第三个方面，本发明还提供包含上述lncrna-hrat，或上述lncrna-hrat的核酸分子，或包含上述载体的细胞。
12.在第四个方面，本发明还提供上述lncrna-hrat在作为心肌梗死或心肌缺血再灌注损伤疾病的生物标志物中的应用，或在筛选防治心肌梗死或心肌缺血再灌注损伤疾病药物中的应用。
13.在第五个方面，本发明还提供一种用于检测上述lncrna-hrat的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物：5'-gggtttcatcgtcacgcaag-3'(seq id no:3)，下游引物：5'-ggaccgtctaccccacacta-3'(seq id no:4)；或，上游引物：5'-gttatctttgtgggttctttagcc-3'(seq id no:5)；下游引物：5'-gttgatctgtagcctctctgcc-3'(seq id no:6)。
14.在第六个方面，本发明还提供一种诊断试剂盒，所述试剂盒包含上述lncrna-hrat，或上述lncrna-hrat的核酸分子，或上述载体，或上述的引物。
15.在第七个方面，本发明还提供一种非疾病诊断或为目的的、检测上述lncrna的方法，其特征在于，包括以下步骤：
16.(1)提取待测h/r处理后心肌细胞的总rna，逆转录合成cdna；
17.(2)以cdna为模板，利用上述引物对进行实时荧光定量pcr检测；
18.(3)采用相对定量法计算所述lncrna-hrat的表达量。
19.进一步地，所述实时荧光定量pcr检测的反应体系为20μl pcr反应体系为：2
×
聚合酶链反应预混液11μl，cdna模板1μl，10μm上游引物1μl，10μm下游引物1μl，无rna酶水7μl，其中，2
×
聚合酶链反应预混液包括2.5u taq dna聚合酶，1.5mmol/l mgcl2，100μmol/l dntps和2.0mmol/l sybr green i。
20.进一步地，所述pcr反应条件为：先95℃预变性30秒；然后95℃变性5秒，60℃退火和延伸34秒，共40个循环。
21.本发明具有如下优点：
22.本发明筛选得到一个新的lncrna-hrat，并通过体内体外实验验证其在心肌缺血再灌注损伤中的作用。结果表明，在h/r处理的心肌细胞，过表达lncrna-hrat能够使凋亡效应蛋白caspase-3的表达明显升高，促进h/r诱导的心肌细胞凋亡。在i/r处理的小鼠，敲除lncrna-hrat可减少缺血/再灌注后血清中ck的释放，降低心肌梗死面积，改善心脏功能，表明lncrna-hrat表达的上调可加重缺血/再灌注引起的心肌损伤。因此，lncrna-hrat可能成
为心肌缺血再灌注损伤的潜在靶点。
附图说明
23.图1：h/r处理后lncrna的表达变化，其中，a.rna-seq得出的lncrna差异表达热图；b.从测序结果中挑出的候选的lncrna；c.qrt-pcr检测候选的lncrna的表达情况。*p《0.05，**p《0.01，ns为没有显著性差异，(n＝5)。
24.图2：potential calculator online软件计算lncrna-hrat的编码能力。
25.图3：lncrna-hrat在心肌细胞中的亚细胞定位(标尺：10μm)。
26.图4：过表达lncrna-hrat对caspase-3表达的影响，其中，a.qrt-pcr检测心肌细胞中lncrna-hrat的表达水平；b.western blot检测心肌细胞中caspase-3的表达水平。*p《0.05，**p《0.01，(n＝3)。
27.图5：过表达lncrna-hrat对h/r诱导的细胞凋亡的影响，其中，a.流式结果图；b.流式结果的统计分析。*p《0.05，**p《0.01，(n＝3)。
28.图6：i/r处理对小鼠血清中ck水平和心脏梗死面积的影响，其中，a.ck试剂盒检测血清中ck的活性；b.ttc染检测小鼠心脏梗死面积，正常心肌组织呈红，梗死心肌组织呈白及小鼠心肌梗死面积的统计分析。**p《0.01，(n＝5)。
29.图7：i/r处理对心脏组织中lncrna-hrat表达的影响。**p《0.01,(n＝5)。
30.图8：hrat-cko小鼠的构建过程，其中，a.hrat-cko小鼠的基因构建策略；b.hrat-cko小鼠的建系流程。
31.图9：hrat-cko小鼠的基因型鉴定结果，其中，a.flox等位基因的鉴定:flox纯合子为281bp,野生型为211bp,flox杂合子281bp和211bp都有条带；b.cre等位基因的鉴定：cre为304bp,野生型无条带；0为空白对照组，1-7为不同hrat-cko小鼠dna样品组。
32.图10：hrat-cko小鼠心脏组织中lncrna-hrat的表达水平。**p《0.01，(n＝5)。
33.图11：心肌特异性敲除lncrna-hrat对小鼠血清中ck水平的影响。*p《0.05，**p《0.01，ns为没有显著性差异，(n＝5)。
34.图12：心肌特异性敲除lncrna-hrat对小鼠心脏梗死面积的影响，其中，a.ttc染检测小鼠心脏梗死面积，正常心肌组织呈红，梗死心肌组织呈白；b.小鼠心肌梗死面积的统计分析。*p《0.05，(n＝5)。
35.图13：心肌特异性敲除lncrna-hrat对小鼠心脏功能的影响，其中，a.超声影像系统检测小鼠心脏功能；b.左室射血分数(lvef)的定量分析；c.左室缩短分数(lvfs)的定量分析。*p《0.05，**p《0.01，ns为没有显著性差异，(n＝5)。
具体实施方式
36.下述实施例仅作为示例，是为了更好地进一步理解本发明，并不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
37.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
38.实施例1lncrna-hrat的筛选
39.为寻可能在心肌缺血再灌注损伤中发挥作用的lncrna，用缺氧/复氧(h/r)模型模拟体内的缺血/再灌注过程，随后收集2对经过h/r处理及相应对照组的细胞样本，送广州锐博生物科技有限公司进行rna-seq测序分析。
40.以h/r组与对照组差异倍数》2(p《0.05)作为筛选标准共筛选出1029个差异表达的lncrna，其中，222个表达上调，807个表达下调(图1a)。根据以下标准：(1)h/r组与对照组差异倍数》4.5的lncrna；(2)在ucsc和ensemble数据库中未见报道，我们挑选出7个lncrna(图1b)。使用qrt-pcr检测这些lncrna在h9c2心肌细胞中的表达水平，进一步验证测序结果。结果表明，与对照组相比，经h/r处理后tcons_00029632和tcons_00078211这2个lncrna的变化趋势与rna测序结果一致(图1c)。其中lncrna tcons_00029632在h/r处理后变化的倍数最为显著。
41.因此，lncrna tcons_00029632可能在心肌缺血再灌注损伤中发挥作用，故选择其作为后续的研究对象。现有技术中无lncrna tcons_00029632相关命名和报道，据其可能的功能，我们将其命名为lncrna-hrat(hypoxia/reoxygenation associated transprict，hrat，缺氧/复氧相关转录本)，核苷酸序列如seq id no:1或seq id no.2所示，其中seq id no:1来源于大鼠(rattus norvegicus)，seq id no:2来源于小鼠(mus musculus)。
42.实施例2lncrna-hrat的鉴定
43.2.1lncrna-hrat编码能力计算
44.为验证lncrna-hrat是否具有编码能力，我们利用文献报道的potential calculator online在线软件，输入lncrna序列进行计算。结果显示(图2)：阳性对照的β-actin mrna和tp53 mrna的编码能力值分别为3.70和8.25，而lncrna-hrat编码能力值仅为-1.03303，提示其几乎不具有编码能力，属于非编码rna。
45.2.2lncrna-hrat在细胞核和细胞质中均有分布
46.lncrna在细胞中分布位置的不同决定其作用方式，因此确定lncrna-hrat在心肌细胞中的亚细胞定位对于后续的机制研究非常必要。我们采用了rna荧光原位杂交实验检测lncrna-hrat在心肌细胞中的定位，结果显示：内参基因18s作为阳性对照rna主要存在于细胞质中，lncrna-hrat在细胞核和细胞质中均有分布(图3)。
47.实施例3lncrna-hrat体外促进缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤
48.心肌细胞经过缺氧/复氧处理后能够发生凋亡，因此我们把心肌细胞凋亡作为心肌细胞发生损伤的标志。为验证lncrna-hart在心肌缺血再灌注损伤中的作用，我们首先在体外将含有lncrna-hrat的慢病毒转入h9c2细胞，提高h9c2细胞中lncrna-hrat的表达，再将h9c2细胞进行h/r处理，western blot检测凋亡效应蛋白caspase-3的表达情况。结果显示：与阴性对照组相比，h9c2细胞感染慢病毒后lncrna-hrat表达水平明显升高(图4a)。与正常对照组相比，h9c2细胞经过h/r处理后，caspase-3的表达水平明显升高，表明h/r模型制备成功；与阴性对照组相比，过表达lncrna-hrat使caspase-3的表达水平明显升高(图4b)，表明lncrna-hrat可促进h/r诱导的心肌细胞凋亡。
49.为验证lncrna-hrat对心肌细胞凋亡的调控作用，我们采用流式细胞仪检测lncrna-hrat过表达后细胞凋亡率的变化。结果显示(图5)：与正常对照组相比，h9c2细胞经过h/r处理后，细胞凋亡率明显升高；与阴性对照组相比，过表达lncrna-hrat后细胞凋亡率
明显增加，进一步证实lncrna-hrat可促进h/r诱导的心肌细胞凋亡，提示lncrna-hrat可促进h/r诱导的心肌细胞损伤。
50.实施例4lncrna-hrat在体内小鼠心肌缺血/再灌注损伤模型中的表达情况
51.4.1小鼠心肌缺血再灌注损伤模型制备
52.野生型c57bl/6小鼠行缺血45min，再灌注3h后，取造模后的小鼠血清，用全自动生化分析仪检测血清中ck的活性；取造模后的小鼠心脏，用ttc染检测心脏的梗死面积。结果显示：与假手术(sham)组相比，经过i/r处理后，小鼠血清中ck的活力明显升高(图6a)；ttc染的结果显示，i/r组的梗死面积明显大于sham组(图6b)。以上结果提示小鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立成功。
53.4.2lncrna-hrat在心肌缺血/再灌注损伤模型中表达上调
54.实施例3的体外实验结果表明，lncrna-hrat能够促进h/r诱导的心肌细胞损伤。为探究lncrna-hrat在体内心肌缺血/再灌注(i/r)损伤中的作用，我们采用qrt-pcr检测i/r处理后心脏组织中lncrna-hrat的表达情况。结果显示：与sham组相比，经过i/r处理后，lncrna-hrat的表达明显上调(图7)，提示lncrna-hart可能在体内i/r损伤中发挥作用。
55.实施例5lncrna-hrat心肌特异性敲除(hrat-cko)小鼠的构建
56.5.1hrat-cko小鼠基因型鉴定
57.条件性基因敲除的原理是通过把两个loxp位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出含有两个flox位点的小鼠。该flox小鼠在与表达cre重组酶小鼠杂交之前，该基因表达正常；当flox小鼠与组织特异性表达cre酶的小鼠进行杂交后，可实现在特定的组织或细胞中敲除该基因，而在其它组织或细胞中该基因表达正常，因此我们可以通过鉴定小鼠的基因型是不是flox纯合且带cre酶来确定小鼠是否特异性敲除。
58.hrat-flox纯合子(hratf/f)小鼠和心肌特异性表达cre酶(αmyhc-cre)的小鼠由赛业(广州)生物科技有限公司提供，我们通过将二者进行交配以繁育lncrna-hrat心肌特异性敲除(hrat-cko)小鼠，hrat-cko小鼠的具体构建过程如图8所示。我们随后收集小鼠的鼠尾进行dna提取和扩增，并采用琼脂糖凝胶电泳对小鼠的基因型进行检测。结果显示hrat-cko小鼠flox基因型为纯合子且带cre酶(图9)，提示我们构建的敲除鼠为hrat-cko小鼠。
59.5.2hrat-cko小鼠心脏中lncrna-hrat的表达情况
60.为进一步验证lncrna-hrat在心脏中的敲除效果，我们收集小鼠心脏，提取rna，采用qrt-pcr验证lncrna-hrat的表达情况。结果显示：与hratf/f组小鼠相比，cko小鼠心脏中lncrna-hrat的表达显著降低(图10)，提示lncrna-hrat心脏特异性敲除小鼠构建成功。
61.实施例6心肌特异性敲除lncrna-hrat可减轻心肌缺血再灌注损伤
62.6.1敲除lncrna-hrat可降低缺血/再灌注小鼠血清中ck的水平
63.为探究lncrna-hrat在体内心肌缺血再灌注损伤中的作用，hratf/f和hrat cko小鼠行缺血45min再灌3h后，然后采用ck试剂盒检测血清中ck的释放量来反映心脏损伤程度。结果显示(图11)：与sham+hratf/f组相比，i/r+hratf/f组血清中ck的水平明显上升；与i/r+hratf/f组小鼠相比，i/r+hrat cko组血清中ck的水平明显降低，提示心肌特异性敲除lncrna-hrat可以减轻缺血/再灌注引起的心肌损伤。
64.6.2敲除lncrna-hrat可降低缺血/再灌注小鼠的心肌梗死面积
65.为验证lncrna-hrat在体内心肌缺血再灌注损伤中的作用，hratf/f和hrat cko小鼠行缺血45min再灌24h后，我们采用ttc染检测心肌的梗死面积来反映心脏的损伤程度。结果显示(图12)：与hratf/f组小鼠相比(43.57
±
5.29％)，敲除lncrna-hrat后，小鼠心肌的梗死面积明显降低(31.00
±
0.93％，p《0.05)，提示敲除lncrna-hrat能够降低心肌缺血/再灌注引起的心肌梗死，进一步证实心肌特异性敲除lncrna-hrat可以减轻缺血/再灌注引起的心肌损伤。
66.6.3敲除lncrna-hrat可改善缺血/再灌注小鼠的心脏功能
67.为进一步验证lncrna-hrat在体内心肌缺血再灌注损伤中的作用，hratf/f和hrat cko小鼠行缺血再灌注实验7天后，我们采用小动物超声影像系统检测左室收缩末期直径(lveds)和左室舒张末期直径(lvedd)，然后计算左室射血分数(lvef)和左室缩短分数(lvfs)以评估小鼠的心脏功能。结果显示(图13)：与sham+hratf/f组相比，i/r+hratf/f组lvef和lvfs明显下降；与i/r+hratf/f组小鼠相比，i/r+hrat cko组lvef和lvfs明显升高，提示，敲除lncrna-hrat能够改善心肌缺血/再灌注引起心功能异常。以上的结果证实，心肌特异性敲除lncrna-hrat可以减轻缺血/再灌注引起的心肌损伤。
68.以上结果表明，本发明提供的lncrna-hrat能够促进h/r诱导的心肌细胞凋亡/损失，在心肌缺血/再灌注损伤模型中表达上调，心肌特异性敲除lncrna-hrat可减轻心肌缺血再灌注损伤。因此，lncrna-hrat可用作心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤等疾病的生物标志物，或用于制备预防//诊断心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤等疾病的药物。
69.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以列举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

技术特征：

1.一种lncrna-hrat，其特征在于，包含seq id no:1或seq id no:2所示的核苷酸序列。2.编码权利要求1所述lncrna-hrat的核酸分子。3.包含权利要求2所述核酸分子的载体。4.包含权利要求1所述lncrna-hrat，或权利要求2所述lncrna-hrat的核酸分子，或包含权利要求3所述载体的细胞。5.权利要求1所述lncrna-hrat在作为心肌梗死或心肌缺血再灌注损伤疾病的生物标志物中的应用，或在筛选防治心肌梗死或心肌缺血再灌注损伤疾病药物中的应用。6.一种用于检测权利要求1所述lncrna-hrat的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物：5'-gggtttcatcgtcacgcaag-3'，下游引物：5'-ggaccgtctaccccacacta-3'；或，上游引物：5'-gttatctttgtgggttctttagcc-3'；下游引物：5'-gttgatctgtagcctctctgcc-3'。7.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述lncrna-hrat，或权利要求2所述lncrna-hrat的核酸分子，或权利要求3所述载体，或权利要求6所述的引物。8.一种非疾病诊断或为目的的、检测权利要求1所述lncrna的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测h/r处理后心肌细胞的总rna，逆转录合成cdna；(2)以cdna为模板，利用权利要求7所述引物对进行实时荧光定量pcr检测；(3)采用相对定量法计算所述lncrna-hrat的表达量。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量pcr检测的反应体系为20μl pcr反应体系为：2
×
聚合酶链反应预混液11μl，cdna模板1μl，10μm上游引物1μl，10μm下游引物1μl，无rna酶水7μl，其中，2
×
聚合酶链反应预混液包括2.5u taq dna聚合酶，1.5mmol/l mgcl2，100μmol/l dntps和2.0mmol/lsybr green i。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述pcr反应条件为：先95℃预变性30秒；然后95℃变性5秒，60℃退火和延伸34秒，共40个循环。

技术总结

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种lncRNA-HRAT及其应用。本发明通过缺氧/复氧(H/R)模型模拟体内的缺血/再灌注过程，再通过高通量测序技术筛选H/R处理前后表达水平差异大的lncRNA，最后筛选到了所述lncRNA-HRAT。本发明提供的lncRNA-HRAT可用作心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤等疾病的生物标志物，敏感性高，能检测出心肌梗死及心肌缺血再灌注损伤疾病且诊断效率高，可靠性好，为诊断心肌梗死及心肌缺血再灌注损伤疾病提供了新的检测手段，检测方法简单易操作，具有良好的转化医学前景潜力。潜力。潜力。