一种人凝血酶蛋白的核酸适体AS2-3及其筛选方法和应用

一种人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3及其筛选方法和应用
技术领域
1.本发明具体涉及一种人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3及其筛选方法和应用，属分子生物学技术领域。

背景技术：

2.凝血酶是一种na
+
激活的变构丝氨酸蛋白酶，包含一个肝素结合位点和纤维蛋白结合位点，在凝血级联反应中起中心蛋白酶的作用，血管损伤后，凝血酶由失活的凝血酶原通过一系列酶的裂解迅速生成，活化的凝血酶将纤维蛋白原分解成纤维蛋白，并在血管损伤处形成凝块，以防止出血。凝血酶和失活的凝血酶原在生理和病理凝血中起关键作用，与多种疾病有关，如阿尔茨海默症和癌症。
3.适体是一种短的、单链的寡核苷酸(ssdna或rna)，通常由20～80个核苷酸组成，与目标配体有高的亲和力和特异性。适体通常由selex(通过指数富集的配体系统进化技术)方法筛选得到。从1990年适体被研究以来，至今发表的有关适体论文中，有20％涉及凝血酶及其适体的研究。由于凝血酶适体在较为早期就筛选得到，并且能在纳摩尔浓度下对凝血酶的促凝血功能显示出强大的抗凝血活性，因此，凝血酶与其适体的结合是证明基于适体亲和力分析的概念验证中最常用的模型系统。
4.大多数人凝血酶的检测涉及完整的α凝血酶(295个氨基酸)，人α-凝血酶可通过蛋白水解生成β-凝血酶和γ-凝血酶，现阶段已成熟运用的能够特异性结合凝血酶的适体分别有：可以和凝血酶的两个阴离子结合位点之一纤维蛋白原识别位点相互作用的15mer dna寡核苷酸(5
’‑
ggttggtgtggttgg-3’)，解离常数kd～100nm，以及与凝血酶的肝素结合外表面具有较高的亲和力的29mer dna寡核苷酸(5’agtccgtggtagggcaggtgggggtgact-3’)，解离常数kd～0.5nm。
5.随着合成生物学的快速发展以来，无数基因回路被设计和验证，其中用于信号感知和调节基因表达的分子工具对于在细胞和无细胞转录翻译系统中设计和构建合成基因回路是必不可少的。而现有的转录调控因子虽然应用较为成熟且稳健，但其数量种类是有限的，限制了其参与的合成基因回路的构建。所以有研究开始利用适体作为基因元件，利用类似于转录调控因子的方式在回路中对下游基因进行调控，并且可以通过selex的方式去筛选得到与任意目标配体有亲和力的适体序列，使得适体和配体的组合作为调控元件在未来的研究中有很大的发展空间。
6.实验表明上述两种凝血酶适体都不适用于直接在生物回路中作为基因元件响应体系中靶标配体的存在而影响转录过程，因此有必要以研究成熟的凝血酶为模型，筛选得到一种既能够在体外与凝血酶特异性结合的适体，又可以将其作为基因元件运用到生物回路中进行基因调控，从而解决天然调控因子匮乏所带来的局限性。
7.无细胞转录翻译系统(cell-free transcription-translation system:tx-tl)是利用细胞粗提物以代替完整细胞来进行转录和翻译过程的体外表达系统。由于细胞提取物中保留了天然的转录和翻译机制，因此可以通过在体外添加外源能量(包括氨基酸、核苷
酸等和次级能量底物)来实现转录和翻译。无细胞转录翻译系统在将原型设计转入到更复杂的体内环境之前，发挥了快速设计和测试原型回路的中间层的重要作用。

技术实现要素：

8.为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种可以在无细胞转录翻译系统的生物回路中响应人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3及其筛选方法和应用，以无细胞转录翻译系统为媒介，筛选得到能够在此系统的转录过程中响应体系中凝血酶蛋白的存在，对转录过程做出调控的适体序列。
9.本发明的技术方案如下：
10.本发明的目的之一在于提供一种人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3，所述核酸适体as2-3的序列如seq id no:1所示。
11.进一步的，所述核酸适体as2-3的5’端或3’端进行fitc、氨基、生物素或任一化学修饰。
12.本发明还提供核酸适体as2-3，为seq id no:1所示序列的突变体或截短序列或延长序列。
13.进一步的，所述核酸适体as2-3的突变体或截短序列或延长序列的5’端或3’端进行fitc、氨基、生物素或任一化学修饰。
14.本发明的目的之二在于提供一种人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3的筛选方法，将基于核酸适体的体外selex筛选方式和无细胞转录过程筛选相结合。
15.进一步的，所述筛选方法，包括如下步骤：
16.(1)筛选文库的准备：准备以下序列所示的随机ssdna文库：
[0017]5’‑
cgcaaccaggtctctaagc-n40-tagggcaggtt-n10-aatgtgagaccggcctgtg-3’；
[0018]
(2)进行正向筛选：将ssdna文库与3’端带有生物素标记的单链dna capture oligo互补配对形成部分双链dna；
[0019]
(3)将经过步骤(2)所得的部分双链dna与链霉亲和素磁珠进行过夜孵育，使得ssdna文库以dna capture oligo为媒介固定在链霉亲和素磁珠上，洗去未能固定的ssdna序列；
[0020]
(4)将经过步骤(3)所得的磁珠-co-ssdna library复合物与靶标配体人凝血酶蛋白进行孵育，竞争结合与其有特异亲和力的ssdna适体序列；
[0021]
(5)磁性分离经步骤(4)后的孵育混合物，收集洗脱得到与人凝血酶蛋白特异性结合的ssdna适体序列，即ssdna富集文库，并且在后续筛选过程中不断减少靶标配体浓度，增加筛选压力；
[0022]
(6)pcr扩增：将经过步骤(5)所得到的ssdna富集文库进行pcr扩增，其中pcr扩增用引物为：
[0023]
引物p1：5
’‑
cgcaaccaggtctctaagc-3’；
[0024]
引物p2：5
’‑
cacaggccggtctcacatt-3’；
[0025]
(7)ssdna文库获得和纯化：将经过步骤(6)扩增得到的富集后的带有磷酸化标记的dsdna文库，利用lambda exonuclease在37℃水浴酶切30min得到ssdna文库，经乙醇沉淀后获得用于下一轮筛选的次级ssdna文库；
[0026]
(8)循环筛选：将经过步骤(7)所得的次级ssdna文库，作为下一轮筛选的次级文库，并重复(2)～(7)的筛选过程，完成正向筛选；
[0027]
(9)负向筛选：将完成最后一次正向筛选的ssdna文库作为负向筛选的初始文库，进行上述步骤(2)和(3)，在加入靶标配体孵育前先将磁珠-co-ssdna library复合物在无细胞转录翻译系统中孵育60min，磁性分离洗去与无细胞转录翻译系统结合的非特异性序列，后重复上述(4)～(7)的筛选步骤。
[0028]
进一步的，所述步骤(10)的无细胞转录过程筛选的步骤如下：
[0029]
101、完成正、负向筛选后，进行无细胞转录过程筛选：将上述正向和负向筛选完成后的ssdna文库经pcr扩增为dsdna文库，利用golden gate assembly方法将带有启动子、输出信号和终止子的载体与dsdna文库进行连接；
[0030]
102、将经过步骤101中插入有dsdna文库的连接产物进行转化、涂布、挑菌、colony pcr以及凝胶电泳验证，选择插入正确的条带，pcr产物回收其所对应的colony pcr后线性dna产物并进行编号；
[0031]
103、将所有回收得到的包含有启动子、适体序列、输出信号以及终止子的线性dna，在含有或不含有靶标配体人凝血酶蛋白的无细胞转录翻译系统中进行转录过程，观察其输出信号的变化，从而选择可以对靶标配体做出响应，影响下游基因转录的适体序列。
[0032]
本发明的目的之三在于将人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3应用在识别、分析和检测人凝血酶蛋白中。
[0033]
本发明的目的之四在于将人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3应用在凝血酶促凝血功能中的抗凝血活性中。
[0034]
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
[0035]
1、本发明提供的核酸适体as2-3无毒性，分子量小，易于合成与标记；
[0036]
2、本发明提供的核酸适体as2-3的合成成本较抗体制备的成本低，且周期短，重现性较好。
[0037]
3、本发明提供的核酸适体as2-3作为基因元件可以“即插即用”，插入启动子下游后对转录影响较小，且在复杂的无细胞转录翻译系统中可特异性识别其靶标配体凝血酶蛋白从而起到调控作用。、
[0038]
4、本发明结合了selex筛选方式和无细胞转录过程筛选，得到的人凝血酶蛋白核酸适体as2-3既保证了与靶标配体的特异性结合，又适用于无细胞转录翻译系统中在基因回路转录水平的调控，为筛选其他用于基因回路调控的目标适体和配体组合提供了一种新的方法和思路，在核酸适体作为基因元件等领域方面具有广阔的应用前景和重要的科学、社会、经济价值。
附图说明
[0039]
图1为本发明的核酸适体as2-3空间结构的生物信息学模拟图；
[0040]
图2为本发明的核酸适体as2-3筛选流程示意图；
[0041]
图3为本发明的核酸适体as2-3作为基因元件插入pj23151启动子下游，3wjdb作为报告基因时，所得到的线性dna响应无细胞系统中不同浓度人凝血酶蛋白的荧光报告输出结果：其中图(a)为加入不同浓度人凝血酶前后的荧光峰值变化，图(b)为实时荧光变化，图
capture oligo(co)浓度，每轮筛选使用200μl链霉亲和素磁珠(1mg磁珠可以结合》400pmol生物素标记capture oligo dna)大约可以结合320pmol co，将ssdna文库与co按等摩尔比在洗涤缓冲液(washing buffer：5mm tris-hcl，1m nacl，0.5mm edta)体系中进行退火；退火程序：变性95℃，10min，每秒-0.1℃，
×
350次，直到60℃，5min，4℃放置；
[0059]
(3)取200μl磁珠在磁力架上吸附去除上清，用200μl washing buffer重复清洗三次磁珠，将退火后的ssdna library-co复合物与磁珠在旋转仪上35rpm/min进行过夜旋转孵育，使得ssdna library-co复合物与磁珠通过生物素标记结合；
[0060]
(4)将经过步骤(3)孵育过夜的混合物在磁力架上吸附收集上清，用200μl washing buffer重复清洗4次磁珠混合物，每次收集上清并编号；
[0061]
(5)将100μl含1μm human thrombin目标配体的binding buffer(0mm tris-hcl，100mm nacl，1mm mgcl2)加入清洗后的ssdnalibrary-co-磁珠复合物中，混匀置于旋转仪上35r/min，4℃孵育60min，靶标配体竞争性结合与其具有亲和力的适体序列，使其从co-磁珠上脱落后置于磁力架上吸附，收集上清，再用上述等体积binding buffer含有同样浓度的配体进行洗脱保留上清，重复2次，分别编号洗脱1/2/3(在正向筛选过程中不断减小体系中靶标配体浓度至0.25μm，增大筛选压力)；
[0062]
(6)用100μl ssc buffer(20mm tris
–
hcl，2mm mgcl2，5mm kcl，1mm cacl2，100mm nacl)洗涤磁珠，95℃孵育10min，高温下解开co与未和靶标配体结合的ssdnalibrary之间的碱基互补配对，重复3次，每次收集上清编号hot1/2/3；
[0063]
(7)rt-qpcr绝对定量计算洗脱率监测筛选进程，将本轮筛选所用ssdna library稀释到2ng/μl后作为制定标准曲线的扩增模板，进行梯度稀释10-1
～10-7
，同时将上述编号洗脱1/2/3、hot1/2/3和最终磁珠稀释到合适浓度同时进行rt-qpcr扩增；根据制定的标准曲线计算r2值以及扩增效率，计算洗脱1/2/3、hot1/2/3和最终磁珠的拷贝数，后带入公式：{(洗脱1+洗脱2+洗脱3)拷贝数/(hot1+hot2+hot3+最终磁珠)拷贝数}
×
100％计算洗脱率；20μl扩增体系：10μl 2
×
sybr qpcr supermix，引物p1和p2各2μl，dna模板1μl，用depc水补足至20μl；扩增程序：95℃预变性1min，95℃变性20s，58℃退火30s，读取数据，72℃延伸30s，运行39个循环；熔解曲线程序：95℃10s，65℃
→
95℃0.5℃/0.5s，读取数据；
[0064]
其中，rt-qpcr扩增引物为：
[0065]
引物p1：5
’‑
cgcaaccaggtctctaagc-3’；
[0066]
引物p2：5
’‑
cacaggccggtctcacatt-3’；
[0067]
(8)将每一轮筛选过程中靶标竞争结合得到的洗脱1/2/3全部混合均匀到1.5ml离心管中，加入混合后液体体积1/10的3m醋酸钠溶液(ph＝5.2)，再加入混合液体体积2.5倍的无水乙醇，全部混合均匀，置于-20℃冰箱60min，后在冷冻离心机12000rpm，4℃冷冻离心30min沉淀dna，小心取出将上清液体用移液全部吸出，待乙醇挥发完全在离心管中加入19μl depc水，进行振荡将沉淀得到的dna完全溶解在水中，利用高保真extaq酶进行扩增；
[0068]
其中，扩增引物为：se-xp3-f：5
’‑
cgcaaccaggtctctaagc-3’和se-xp4-5’p：5
’‑
cacaggccggtctcacatt-3’；
[0069]
50μl扩增体系为：19μl depc水+ssdna模板，1μl dntp mixture，25μl2
×
buffer mix，引物se-xp3-f和se-xp4-5’p各2μl，1μl high-fidelity dna polymerase；扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸10s，运行8～10个循环，72℃终延
t500，将转录用质粒dna加入到tx-tl反应体系中，终浓度为30nm，人凝血酶蛋白浓度分别为0、0.5、1μm，在29℃下反应6h，用多功能酶标仪实时监测激发光472nm和发射光507nm下的荧光表征转录效率；
[0081]
如图4所示结果核酸适体as2-3所在的实验组体系中人凝血酶蛋白存在时转录效率表现出不同程度的降低，而对未在启动子下游插入适体序列的对照组的荧光没有较大影响，进一步表明人凝血酶蛋白可以特异性识别转录用质粒dna中的适体序列从而对下游基因转录效率做出调控，并且这种抑制影响随着体系中配体浓度的增加而显著。
[0082]
实施例4
[0083]
分别进行核酸适体as2-3与靶标配体人凝血酶蛋白的圆二谱表征以及核酸适体as2-3与靶标配体人凝血酶蛋白的亲和力表征；
[0084]
核酸适体as2-3与靶标配体人凝血酶蛋白的圆二谱表征的具体操作如下：
[0085]
(1)用1
×
binding buffer分别配置含有0.5μm human thrombin，5μm核酸适体as2-3 ssdna以及含有相同浓度的两者混合物，总体积为200μl，分别将含有ssdna的组别在未加入配体前，在95℃下孵育10min后立即置于冰上，使得ssdna变性减少自身二级结构，加入目标配体孵育1h后进行扫描；圆二谱仪参数设定：氮气流速4～5l/min，扫描波长220nm～320nm，扫描速度50nm/min，带宽1nm，累计3次扫描数据取平均；
[0086]
(2)对核酸适体as2-3进行截短，分别保留n40部分的40mer，保留n40和ds序列部分的51mer以及全长适体序列61mer；如图5所示，cd图谱显示核酸适体as2-3在大约260-270nm处出现最大峰值，在大约245nm处出现最小峰值，而现有的29mer tba的cd图谱显示出典型的g-四聚体结构，在260/295nm处有两个最大峰，在245nm处有最小峰，其在220-240nm处在加入0.5μm人凝血酶蛋白后信号有所变化(图5d)，表明现有的29mer tba可以与配体结合；
[0087]
(3)筛选得到核酸适体as2-3在保留n40部分时，加入配体后信号均无明显差异(图5a)，保留全长61mer的核酸适体as2-3在加入0.5μm人凝血酶蛋白后，信号在220-240nm处和245nm峰值处有明显变化(图5c)，说明61mer as2-3适体序列可与配体结合，同时表明其主要结合位点位于序列3’端附近位置；
[0088]
因此，圆二谱数据再次表明研究所筛选的到的候选适体不仅可与特异性配体结合，也可在转录过程中发挥调控作用
[0089]
此外，核酸适体as2-3与靶标配体人凝血酶蛋白的亲和力表征，具体操作如下：使用waters公司的nano itc等温滴定量热仪进行人凝血酶结合核酸适体的itc实验，在25℃下，每组实验中将1500μl的1μm的核酸适体候选物于1
×
binding buffer中95℃加热10min后立即置于冰上冷却，在注射器中装入100μl含10μm的人凝血酶的1
×
binding buffer；每次以2μl的体积进行注射滴定，25次连续注射，间隔300s，转速为300rpm；利用launch nanoanalyze软件分析itc实验中收集到的数据，应用independent模型进行数据拟合如图6所示，得到其kd＝3.356μm。
[0090]
本发明的目的之四在于将人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3应用在凝血酶促凝血功能中的抗凝血活性中。
[0091]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：

1.一种人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3，其特征在于，所述核酸适体as2-3的序列如seq id no:1所示。2.如权利要求1所述的一种人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3，其特征在于，所述核酸适体as2-3的5’端或3’端进行fitc、氨基、生物素或任一化学修饰。3.一种人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3，其特征在于，为权利要求1中所述的seq id no:1所示序列的突变体或截短序列或延长序列。4.如权利要求3所述的一种人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3，其特征在于，所述核酸适体as2-3的突变体或截短序列或延长序列的5’端或3’端进行fitc、氨基、生物素或任一化学修饰。5.一种如权利要求1或3所述的人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3的筛选方法，其特征在于，将基于核酸适体的体外selex筛选方式和无细胞转录过程筛选相结合。6.如权利要求5所述的一种人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)筛选文库的准备：准备以下序列所示的随机ssdna文库：5
’‑
cgcaaccaggtctctaagc-n40-tagggcaggtt-n10-aatgtgagaccggcctgtg-3’(2)进行正向筛选：将ssdna文库与3’端带有生物素标记的单链dna capture oligo互补配对形成部分双链dna；(3)将经过步骤(2)所得的部分双链dna与链霉亲和素磁珠进行过夜孵育，使得ssdna文库以dna capture oligo为媒介固定在链霉亲和素磁珠上，洗去未能固定的ssdna序列；(4)将经过步骤(3)所得的磁珠-co-ssdna library复合物与靶标配体人凝血酶蛋白进行孵育，竞争结合与其有特异亲和力的ssdna适体序列；(5)磁性分离经步骤(4)后的孵育混合物，收集洗脱得到与人凝血酶蛋白特异性结合的ssdna适体序列，即ssdna富集文库，并且在后续筛选过程中不断减少靶标配体浓度，增加筛选压力；(6)pcr扩增：将经过步骤(5)所得到的ssdna富集文库进行pcr扩增，其中pcr扩增用引物为：引物p1：5
’‑
cgcaaccaggtctctaagc-3’；引物p2：5
’‑
cacaggccggtctcacatt-3’；(7)ssdna文库获得和纯化：将经过步骤(6)扩增得到的富集后的带有磷酸化标记的dsdna文库，利用lambda exonuclease在37℃水浴酶切30min得到ssdna文库，经乙醇沉淀后获得用于下一轮筛选的次级ssdna文库；(8)循环筛选：将经过步骤(7)所得的次级ssdna文库，作为下一轮筛选的次级文库，并重复(2)～(7)的筛选过程，完成正向筛选；(9)负向筛选：将完成最后一次正向筛选的ssdna文库作为负向筛选的初始文库，进行上述步骤(2)和(3)，在加入靶标配体孵育前先将磁珠-co-ssdna library复合物在无细胞转录翻译系统中孵育60min，磁性分离洗去与无细胞转录翻译系统结合的非特异性序列，后重复上述(4)～(7)的筛选步骤；(10)完成正、负向筛选后，进行无细胞转录过程筛选。7.如权利要求6所述的一种人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3的筛选方法，其特征在于，
所述步骤(10)的无细胞转录过程筛选的步骤如下：101、将上述正向和负向筛选完成后的ssdna文库经pcr扩增为dsdna文库，利用golden gate assembly方法将带有启动子、输出信号和终止子的载体与dsdna文库进行连接；102、将经过步骤10-1中插入有dsdna文库的连接产物进行转化、涂布、挑菌、colony pcr以及凝胶电泳验证，选择插入正确的条带，pcr产物回收其所对应的colony pcr后线性dna产物并进行编号；103、将所有回收得到的包含有启动子、适体序列、输出信号以及终止子的线性dna，在含有或不含有靶标配体人凝血酶蛋白的无细胞转录翻译系统中进行转录过程，观察其输出信号的变化，从而选择可以对靶标配体做出响应，影响下游基因转录的适体序列。8.一种如权利要求1或3所述的人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3在识别、分析和检测人凝血酶蛋白中的应用。9.一种如权利要求1或3所述的人凝血酶蛋白的核酸适体as2-3在对凝血酶促凝血功能中的抗凝血活性的应用。

技术总结

本发明公开一种人凝血酶蛋白的核酸适体AS2-3及其筛选方法和应用，核酸适体AS2-3的序列如SEQ ID NO:1所示；筛选方法为：在先前筛选得到的人凝血酶蛋白适体的基础上，保留其特定序列进行文库构建，采用Capture-SELEX方法进行初筛后利用无细胞转录翻译系统的转录过程再次进行筛选，本发明成功得到了既可以与人凝血酶蛋白进行特异性结合，又可以以线性和质粒的形式，在无细胞转录过程中能够响应0.5μM人凝血酶蛋白，而对下游基因转录做出抑制调控的核酸适体序列AS2-3；通过结合这两种筛选方法，有希望将其应用于其他靶标配体的适体序列筛选，从而有机会代替转录调控因子作为基因元件应用于生物回路中进行调控。应用于生物回路中进行调控。应用于生物回路中进行调控。