一种β冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用

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β
冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用
1.本技术是申请日为2020年10月27日，申请号为202011165603.9，发明名称为“一种β冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用”的发明专利申请的分案申请。

背景技术：

2.冠状病毒科含有4个冠状病毒属，分别是α、β、γ、δ。严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)以及新型冠状病毒(2019-ncov，后又被命名为sars-cov-2)都是属于β冠状病毒属。它们都是正链rna囊膜病毒，能够广泛感染人和动物。新冠病毒通过人血管紧张素转换酶2(human angiotensin-converting enzyme 2，hace2)进入细胞，hace2受体在动静脉内皮细胞，动脉平滑肌细胞，肠上皮细胞和肺泡，支气管等呼吸系统器官都有分布，病毒可以感染这些含有hace2受体的细胞。
3.对于疾病的，有三级预防，分别是一级预防，是疾病尚未发生时对病因而采取的措施，也是预防、控制和消灭疾病的根本措施；二级预防是在潜伏期为了阻止或减缓疾病的发生而采取的措施，以及三级预防：在疾病的临床期为了减少疾病的危害而采取的措施。其中：一级预防是最高级的预防，是能够消灭疾病的根本措施，β冠状病毒疫苗属于一级预防，因此β冠状病毒疫苗的研发至关重要。
4.β冠状病毒的包膜上主要有3种糖蛋白：s蛋白(刺突蛋白，spike protein，s)、e蛋白(囊膜蛋白，envelope protein，e)蛋白和m蛋白(膜蛋白，membrane protein，m)。s蛋白和冠状病毒入侵细胞的过程密切相关，而且是疫苗研发中重要抗原，可以产生中和抗体。其中s蛋白的受体结合区(receptor binding domain，rbd)是机体诱导产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。

技术实现要素：

5.发明目的
6.本发明的目的在于提供一种β冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用。我们前期发现了，将β冠状病毒s蛋白的两个rbd串联在一起形成单链二聚体rbd蛋白可以稳定表达，二聚体rbd蛋白比单体rbd蛋白的免疫原性更好，可以诱导更高的抗体水平，这种亚单位疫苗设计策略在β冠状病毒中是通用的(pmid:32645327)。本发明聚焦β冠状病毒s蛋白的rbd区域作为疫苗抗原，构建rbd多聚体抗原，以期获得更好的免疫效果。新冠病毒rbd多聚体可以稳定的表达，免疫小鼠后可以强烈的诱导免疫反应，产生很高的中和抗体。而且新冠病毒rbd多聚体诱导小鼠产生的新冠假病毒中和抗体滴度都与新冠病毒rbd二聚体有显著性差异，说明新冠病毒多聚体相对于rbd二聚体提高了免疫原性，是一个很好的候选疫苗。
7.一种β冠状病毒多聚体抗原，其氨基酸序列包括：多个直接串联或通过连接氨基酸序列串联的、β冠状病毒的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，其中串联的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列来自于同一β冠状病毒，所述多个为≥3个的整数。
8.上述β冠状病毒多聚体抗原在一种可能的实现方式中，串联的刺突蛋白的受体结
合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列来自于同一β冠状病毒为：串联的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列均来自严重呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒或2019新型冠状病毒。
9.上述β冠状病毒多聚体抗原在一种可能的实现方式中，所述多个为3个或4个。
10.上述β冠状病毒多聚体抗原在一种可能的实现方式中，串联的β冠状病毒的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列为完全相同的序列。即串联的序列之间完全相同，为多个重复序列。
11.上述β冠状病毒多聚体抗原在一种可能的实现方式中，不同位置的连接氨基酸序列相互独立地选自以下序列：(ggs)n连接序列，其中n表示ggs的个数，n为≥1的整数；可选地，n为选自1-10的整数；进一步可选地，n为选自1-5的整数。ggs三个字母分别表示氨基酸g、g、s。不同位置的连接氨基酸序列相互独立是指：连接从n端起第一个和第二个串联序列的连接氨基酸序列可以不同于连接从n端起第二个和第三个串联序列的连接氨基酸序列，依此类推。
12.上述β冠状病毒多聚体抗原在一种可能的实现方式中，β冠状病毒的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列为β冠状病毒的刺突蛋白的受体结合区的全部氨基酸序列的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。
13.上述β冠状病毒多聚体抗原在一种可能的实现方式中，当β冠状病毒为2019新型冠状病毒时，其刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列选自包括以下氨基酸序列的任意一种：
14.(1)来自于2019-ncov刺突蛋白的受体结合区的319-537区域；
15.(2)在(1)中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列，该氨基酸序列编码的蛋白质具有与(1)所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性。
16.其中：2019-ncov刺突蛋白的受体结合区的319-537区域来源于2019-ncov的wh01株的刺突蛋白序列(ncbi上的genbank：qhr63250)的r319-k537区域。
17.上述β冠状病毒多聚体抗原在一种可能的实现方式中，当β冠状病毒为2019新型冠状病毒时，β冠状病毒抗原的氨基酸序列包括选自以下氨基酸序列的任意一种：
18.直接串联的3个来自于2019-ncov刺突蛋白的受体结合区的319-537区域，序列如seq id no.1所示，即r319-k537-r319-k537-r319-k537；
19.直接串联的4个来自于2019-ncov刺突蛋白的受体结合区的319-537区域，序列如seq id no.2所示，即r319-k537-r319-k537-r319-k537-r319-k537。
20.本发明还提供了一种制备上述β冠状病毒多聚体抗原的方法，包括以下步骤：在编码上述β冠状病毒抗原的核苷酸序列的5’端加入编码信号肽的序列，3’端加上编码组氨酸标签的序列以及终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后转染表达系统的细胞进行表达，表达后收集细胞上清，纯化得到β冠状病毒抗原。
21.上述方法在一种可能的实现方式中，所述表达系统的细胞包括为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞，可选地；所述哺乳动物细胞包括293t细胞或cho细胞，所述细菌细胞包括大肠杆菌细胞。
22.本发明还提供了一种编码上述β冠状病毒多聚体抗原的多核苷酸、一种包括上述多核苷酸的重组载体、一种包括上述重组载体的表达系统细胞。
23.本发明还提供了一种上述β冠状病毒多聚体抗原、编码上述β冠状病毒多聚体抗原的多核苷酸、包括上述多核苷酸的重组载体或包括上述重组载体的表达系统细胞在制备β冠状病毒疫苗中的应用。
24.本发明还提供了一种β冠状病毒疫苗，包括上述β冠状病毒多聚体抗原和佐剂。
25.上述β冠状病毒疫苗在一种可能的实现方式中，所述佐剂选自铝佐剂、mf59佐剂、类mf59佐剂或者addavax
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佐剂。
26.本发明还提供了一种β冠状病毒dna疫苗，其包括有：包含编码上述β冠状病毒多聚体抗原的dna序列的重组载体。
27.本发明还提供了一种β冠状病毒mrna疫苗，其包括有：包含编码上述β冠状病毒多聚体抗原的mrna序列的重组载体。
28.本发明还提供了一种β冠状病毒病毒载体疫苗，其包括有：包含编码上述β冠状病毒多聚体抗原的核苷酸序列的重组病毒载体；可选地，病毒载体选自以下的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体、水疱性口炎病毒载体(vesicular stomatitis virus，vsv)。
附图说明：
29.图1是本发明实施例1中新型冠状病毒rbd单体(ncov-rbd-monomer)、二聚体(ncov-rbd-dimer)、三聚体(ncov-rbd-trimer)和四聚体(ncov-rbd-tetramer)的western blot。
30.图2是本发明实施例2中ncov-rbd-trimer新冠rbd三聚体蛋白的分子筛分析与凝胶电泳分析。
31.图3是本发明实施例2中ncov-rbd-tetramer新冠rbd四聚体蛋白的分子筛分析与凝胶电泳分析。
32.图4是本发明实施例3中hace2和ncov-rbd单体的亲和力测定，横坐标time(s)值为400时，纵坐标响应值从高到低，对应的样品(不同浓度的hace2蛋白)分别是800nm，400nm，200nm，100nm，50nm，25nm，12.5nm，6.25nm，3.125nm，1.156nm，0.78nm。
33.图5是本发明实施例3中hace2和ncov-rbd-trimer的亲和力测定，横坐标time(s)值为400时，纵坐标响应值从高到低，对应的样品(不同浓度的hace2蛋白)分别是800nm，400nm，200nm，100nm，50nm，25nm，12.5nm，6.25nm，3.125nm，1.156nm，0.78nm。
34.图6是本发明实施例3中hace2和ncov-rbd四聚体的亲和力测定，横坐标time(s)值为400时，纵坐标响应值从高到低，对应的样品(不同浓度的hace2蛋白)分别是800nm，400nm，200nm，100nm，50nm，25nm，12.5nm，6.25nm，3.125nm，1.156nm，0.78nm。
35.图7是本发明实施例4中免疫小鼠的流程图。
36.图8是本发明实施例5中第35天后诱导产生的针对新冠病毒假病毒中和抗体滴度结果图。
具体实施方式
37.在前期研究中，我们发现了基于新冠病毒的单链二聚体rbd蛋白制备的亚单位疫苗比单体rbd蛋白疫苗具有更高的免疫原性，可以诱导产生更好的抗体水平(pmid:
32645327)。为了进一步提高疫苗效果，我们尝试将更多的rbd蛋白串联在一起，检测得到的蛋白是否可以比二聚体rbd蛋白免疫动物后诱导更强的免疫反应，用于疫苗研发。
38.实施例1：新冠病毒rbd同源三聚体和四聚体的设计
39.通过设计我们把三个或者四个新冠病毒rbd蛋白串联起来，获得新冠病毒rbd三聚体和rbd四聚体，再尝试进行表达纯化和免疫原性检测。
40.我们设计的三聚体和四聚体的构建是：(1)把三个新冠病毒rbd序列(319-537)串联(seq id no.1)，n端连接信号肽(mihsvfllmflltptes)，c端加上6个组氨酸(hhhhhh)以及终止密码子，得到的构建命名为ncov-rbd-trimer；(2)把四个新冠病毒rbd序列(319-537)串联(seq id no.2)，n端连接信号肽(mihsvfllmflltptes)，c端加上6个组氨酸(hhhhhh)以及终止密码子，得到的构建命名为ncov-rbd-tetramer。
41.我们还制备了单体和二聚体的构建作为对照，分别如下：(1)把一个新冠病毒rbd序列(319-541)(seq id no.3)，n端连接信号肽(mfvflvllplvssqc)，c端加上6个组氨酸(hhhhhh)以及终止密码子，得到的构建命名为ncov-rbd-monomer；(2)把两个新冠病毒rbd序列(319-537)串联(seq id no.4)，n端连接信号肽(mihsvfllmflltptes)，c端加上6个组氨酸(hhhhhh)以及终止密码子，得到的构建命名为ncov-rbd-dimer。
42.将编码ncov-rbd-trimer的开放阅读框(包含信号肽、his标签和终止密码子)按照人源密码子优化得到dna序列(seq id no.5)，将编码ncov-rbd-tetramer的开放阅读框(包含信号肽、his标签和终止密码子)按照人源密码子优化得到dna序列(seq id no.6)，将编码ncov-rbd-monomer的开放阅读框(包含信号肽、his标签和终止密码子)按照人源密码子优化得到dna序列(seq id no.7)，将编码ncov-rbd-dimer的开放阅读框(包含信号肽、his标签和终止密码子)按照人源密码子优化得到dna序列(seq id no.8)，编码基因的orf上游含有kozak序列gccgccacc，然后将这四段基因在金唯智公司合成并克隆到pcaggs载体，得到表达三聚体rbd和四聚体rbd的质粒pcaggs-ncov-rbd-trimer、pcaggs-ncov-rbd-tetramer，以及表达单体rbd和二聚体rbd的质粒pcaggs-ncov-monomer、pcaggs-ncov-dimer。
43.将以上四种质粒pcaggs-ncov-trimer、pcaggs-ncov-tetramer、pcaggs-ncov-monomer、pcaggs-ncov-dimer转染hek293t细胞，72小时后收集细胞上清，通过蛋白印迹法(western blot)检测目的蛋白的表达，结果如图1所示，细胞能稳定表达新冠病毒rbd三聚体、rbd四聚体、rbd单体、rbd二聚体蛋白。
44.实施例2：ncov-rbd-trimer和ncov-rbd-tetramer表达纯化
45.使用hek293t细胞表达ncov-rbd-trimer和ncov-rbd-tetramer。将质粒pcaggs-ncov-trimer和pcaggs-ncov-tetramer分别转染hek293t细胞，72小时后收集上清，离心去除沉淀再通过0.22μm的滤膜过滤，进一步除去杂质。将细胞上清在4℃通过镍亲和柱(histrap,ge healthcare)吸附。用缓冲液a(20mm tris,150mm nacl,ph 8.0)洗涤，除去非特异结合蛋白。然后用缓冲液b(20mm tris,150mm nacl,ph 8.0,300mm咪唑)将目的蛋白从histrap上洗脱下来，并用30kd浓缩管将洗脱液浓缩换液30倍以上至缓冲液a，终体积小于1ml。再通过superdex
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200 increase 10/300gl柱子(ge healthcare)进行分子筛层析进一步纯化目的蛋白。分子筛层析缓冲液为pbs缓冲液(8mm na2hpo4,136mm nacl,2mm kh2po4,2.6mm kcl,ph 7.2)。经过分子筛层析，ncov-rbd-trimer在13-14ml左右有一个洗脱峰(图
2)，进行sds-page分析，显示非还原(不加dtt)和还原(加dtt)条件下蛋白都是75kd左右(图2)，为三聚体大小。ncov-rbd-tetramer在12-13ml左右有一个洗脱峰(图3)，进行sds-page分析，显示非还原(不加dtt)和还原(加dtt)条件下蛋白都是100kd左右(图3)，为四聚体大小。
46.单体和二聚体的表达纯化也按照上述方法进行。
47.实施例3：新冠病毒rbd三聚体蛋白和rbd四聚体蛋白与hace2蛋白相互作用亲和力实验
48.为了检测新冠病毒rbd三聚体蛋白和rbd四聚体蛋白与hace2蛋白的亲和力，我们通过表面等离子共振实验检测其结合亲和力，将新冠病毒rbd单体蛋白和hace2蛋白亲和力作为对照。
49.用浓缩离心的方法将实验所用的蛋白换液至(10mm na2hpo4；2mm kh2po4,ph 7.4；137mm nacl；2.7mm kcl；0.005％(v/v)tween-20),本实验使用仪器为biacore 3000，cm5芯片(ge healthcare)，将新冠病毒rbd单体蛋白、三聚体蛋白和四聚体蛋白以1000响应值固定在芯片上，以hace2蛋白作为流动相，按照800nm，400nm，200nm，100nm，50nm，25nm，12.5nm，6.25nm，3.125nm，1.156nm，0.78nm倍比稀释流动相蛋白，用不同浓度流动相蛋白依次流过芯片，记录实时响应值。数据经biaevaluation version 4.1(ge healthcare)软件处理，计算得到新冠病毒rbd单体、三聚体和四聚体蛋白与hace2蛋白亲和力。
50.表面等离子共振实验检测其结合亲和力的结果如图4、5、6所示。新冠病毒rbd单体和hace2结合的亲和力为2.83
±
0.32nm(图4)，ncov-rbd-trimer和hace2结合的亲和力为4.31
±
0.97nm(图5)，ncov-rbd-tetramer和hace2结合的亲和力为7.37
±
0.96nm(图6)。ncov-rbd-trimer和ncov-rbd-tetramer与hace2的亲和力，与新冠病毒rbd单体和hace2的亲和力相当，说明ncov-rbd-trimer和ncov-rbd-tetramer也能较好的暴露出受体结合基序(receptor binding motifs，rbms)。
51.实施例4：新冠病毒rbd三聚体蛋白和rbd四聚体蛋白免疫小鼠实验
52.为了进一步检测疫苗的免疫原性，我们将纯化的rbd三聚体、rbd四聚体、rbd单体、rbd二聚体蛋白免疫balb/c小鼠。所使用的balb/c小鼠从维通利华公司购买，均为雌性，7周龄大小。小鼠分组(每组6只)及疫苗剂量如表1所示，免疫流程图如图7所示。小鼠免疫实验设置的免疫组使用新冠病毒rbd三聚体蛋白和rbd四聚体蛋白(实施例2获得)作为免疫原，对照组分别是ncov-rbd的单体、rbd二聚体蛋白和pbs作为阴性对照。
53.表1冠状病毒rbd同源三聚体和四聚体疫苗免疫小鼠分组及剂量
[0054][0055]
将免疫原用pbs稀释至0.2mg/ml，addavax
tm
佐剂与免疫原按照体积比1:1的比例混合乳化制备成疫苗。混合后的疫苗对balb/c小鼠进行免疫，每组6只。小鼠实验流程如图7所示，所有小鼠分别在第0天、第21天进行第一次和第二次免疫，每次肌肉注射100μl的抗原佐
剂混合物(其中50μl免疫原+50μl佐剂混合)。第35天进行眼眶取血并离心收集血清，于-80℃冰箱保存，之后用于检测假病毒中和抗体滴度。
[0056]
实施例5：中和实验检测疫苗免疫后产生的针对新冠假病毒中和抗体水平
[0057]
新冠病毒假病毒的制备方法见论文establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for sars-cov-2(pmid:32207377)，与论文中记录的方法相同。
[0058]
中和实验方法：
[0059]
(1)实验前一天，用胰酶消化以收获对数生长期的huh7细胞，计数，重新接种于96孔板中，待18-24小时细胞密度达到80-100％时，可进行微量中和实验。
[0060]
(2)稀释血清，用完全培养基(含10％fbs的dmem)对待检测小鼠血清进行稀释，血清样品从20倍起始，2倍梯度依次稀释。
[0061]
(3)稀释假病毒，提前将假病毒置于冰上融化，然用完全培养基将病毒稀释，再将病毒和血清稀释物混匀，每个孔加入的假病毒量为100tcid
50
，置于37℃5％co2下培养1小时。分别设置只加培养基的空白对照，以及不含有小鼠血清含有等量假病毒的对照。
[0062]
(4)将前一天铺的96孔板细胞上清弃掉，加入病毒和血清混合物，置于37℃5％co2下培养24小时。
[0063]
(5)弃细胞上清，并加入50μl细胞裂解液，在冰上裂解10min，取10μl细胞裂解液上清加入到检测板中，使用luciferase assay systerm(promega,e4550)，按照试剂盒提供的说明书操作，再用glomax 96microplate luminometer(promega)检测荧光素酶活性值。
[0064]
(6)数据分析，抗体滴度值被定义为反应值小于阴性对照值的10％的血清最高稀释倍数，即中和抗体nt90。当最低稀释倍数(检测限)的反应值仍大于阴性对照值的10％时，该样品的滴度定义为最低稀释倍数的一半。
[0065]
结果分析：
[0066]
通过微量中和实验检测第二次免疫后小鼠血清针对新冠病毒假病毒的中和抗体滴度结果如图8所示。ncov-rbd-trimer和ncov-rbd-tetramer二免之后可诱导产生较高的针对新冠病毒假病毒中和抗体。
[0067]
免疫三聚体ncov-rbd-trimer后小鼠血清针对新冠病毒的假病毒中和结果如图8。三聚体ncov-rbd-trimer诱导了接近1:104的针对新冠病毒假病毒中和抗体水平，较二聚体ncov-rbd-dimer所诱导的中和抗体显著性水平提高(**代表p《0.01)，较单体ncov-rbd-monomer诱导的特异性抗体水平显著提高(****代表p《0.0001)，较pbs对照免疫组诱导的中和抗体水平显著提高(****代表p《0.0001)。
[0068]
此外，免疫四聚体ncov-rbd-tetramer后小鼠血清针对新冠病毒的假病毒中和结果如图8。四聚体ncov-rbd-tetramer诱导了约1:104的针对新冠病毒假病毒中和抗体水平，较三聚体ncov-rbd-trimer免疫组诱导产生的中和抗体水平没有明显的提高(ns代表p》0.05)，较二聚体ncov-rbd-dimer二聚体所诱导的中和抗体显著性水平提高(***代表p《0.001)，较单体ncov-rbd-monomer单体诱导的中和抗体水平显著提高(****代表p《0.0001)，较pbs对照免疫组诱导的中和抗体水平显著提高(****代表p《0.0001)。
[0069]
由以上结果可见，新冠病毒rbd三聚体和新冠病毒rbd四聚体可以稳定的表达，免疫小鼠后可以强烈的诱导免疫反应，产生很高的新冠假病毒中和抗体。而且新冠病毒rbd三
聚体和新冠病毒rbd四聚体诱导小鼠产生的中和抗体滴度都与新冠病毒rbd二聚体有显著性差异，说明新冠病毒rbd三聚体和新冠病毒rbd四聚体相对于rbd二聚体提高了免疫原性，是一个很好的候选疫苗。我们前期发现了，将冠状病毒两个rbd串联在一起形成单链二聚体rbd蛋白可以稳定表达，二聚体rbd蛋白比单体rbd蛋白的免疫原性更好，可以诱导更高的抗体水平，这种亚单位疫苗设计策略在β冠状病毒中是通用的(pmid:32645327)，因此这里我们发现新冠病毒rbd三聚体和四聚体免疫小鼠诱导的中和抗体水平比二聚体rbd更高(具有显著性差异)，这种rbd三聚体和四聚体的策略在其它β冠状病毒(比如mers病毒、sars病毒等)的亚单位疫苗设计中很可能也是通用的。

技术特征：

1.一种β冠状病毒多聚体抗原，其特征在于：β冠状病毒多聚体抗原的氨基酸序列包括：多个直接串联或通过连接氨基酸序列串联的、β冠状病毒的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，其中串联的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列来自于同一β冠状病毒，所述多个为≥3个的整数。2.根据权利要求1所述的β冠状病毒多聚体抗原，其特征在于：串联的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列来自于同一β冠状病毒为：串联的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列均来自严重呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒或2019新型冠状病毒。3.根据权利要求1所述的β冠状病毒多聚体抗原，其特征在于：所述多个为3个或4个。4.根据权利要求1所述的β冠状病毒多聚体抗原，其特征在于：串联的β冠状病毒的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列为完全相同的序列。5.根据权利要求1所述的β冠状病毒多聚体抗原，其特征在于：不同位置的连接氨基酸序列相互独立地选自以下序列：(ggs)n连接序列，其中n表示ggs的个数，n为≥1的整数；可选地，n为选自1-10的整数；进一步可选地，n为选自1-5的整数。6.根据权利要求1所述的β冠状病毒多聚体抗原，其特征在于：β冠状病毒的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列为β冠状病毒的刺突蛋白的受体结合区的全部氨基酸序列的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。7.根据权利要求1所述的β冠状病毒多聚体抗原，其特征在于：当β冠状病毒为2019新型冠状病毒时，其刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列选自包括以下氨基酸序列的任意一种：(1)来自于2019-ncov刺突蛋白的受体结合区的319-537区域；(2)在(1)中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列，该氨基酸序列编码的蛋白质具有与(1)所编码的蛋白质相同或基本相同的免疫原性。8.根据权利要求1所述的β冠状病毒多聚体抗原，其特征在于：当β冠状病毒为2019新型冠状病毒时，β冠状病毒抗原的氨基酸序列包括选自以下氨基酸序列的任意一种：直接串联的3个来自于2019-ncov刺突蛋白的受体结合区的319-537区域，序列如seq id no.1所示；直接串联的4个来自于2019-ncov刺突蛋白的受体结合区的319-537区域，序列如seq id no.2所示。9.一种制备权利要求1-8之一所述的β冠状病毒多聚体抗原的方法，其特征在于：包括以下步骤：在编码权利要求1-8之一所述的β冠状病毒抗原的核苷酸序列的5’端加入编码信号肽的序列，3’端加上编码组氨酸标签的序列以及终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后转染表达系统的细胞进行表达，表达后收集细胞上清，纯化得到β冠状病毒抗原。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述表达系统的细胞包括为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞，可选地；所述哺乳动物细胞包括293t细胞或cho细胞，所述细菌细胞包括大肠杆菌细胞。11.一种编码权利要求1-8之一所述的β冠状病毒多聚体抗原的多核苷酸。12.一种包括权利要求11所述的多核苷酸的重组载体。
13.一种包括权利要求12所述的重组载体的表达系统细胞。14.一种权利要求1-8之一所述的β冠状病毒多聚体抗原、权利要求9-10之一所述的方法、权利要求11所述的多核苷酸、权利要求12所述的重组载体或权利要求13所述的表达系统细胞在制备β冠状病毒疫苗中的应用。15.一种β冠状病毒疫苗，其特征在于：包括权利要求1-8之一所述的β冠状病毒多聚体抗原和佐剂。16.根据权利要求15所述的β冠状病毒疫苗，其特征在于：所述佐剂选自铝佐剂、mf59佐剂、类mf59佐剂或者addavax
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佐剂。17.一种β冠状病毒dna疫苗，其特征在于：包括有：包含编码权利要求1-8之一所述的β冠状病毒多聚体抗原的dna序列的重组载体。18.一种β冠状病毒mrna疫苗，其特征在于：包括有：包含编码权利要求1-8之一所述的β冠状病毒多聚体抗原的mrna序列的重组载体。19.一种β冠状病毒病毒载体疫苗，其特征在于：包括有：包含编码权利要求1-8之一所述的β冠状病毒多聚体抗原的核苷酸序列的重组病毒载体；可选地，病毒载体选自以下的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体、水疱性口炎病毒载体。

技术总结

本发明涉及一种β冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用，该β冠状病毒多聚体抗原，其氨基酸序列包括：多个直接串联或通过连接氨基酸序列串联的、β冠状病毒的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，其中串联的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列来自于同一β冠状病毒，所述多个为≥3个的整数。本发明新冠病毒RBD多聚体可以稳定的表达，免疫小鼠后可以强烈的诱导免疫反应，而且新冠病毒RBD多聚体诱导小鼠产生的中和抗体滴度都与新冠病毒RBD二聚体有显著性差异。著性差异。著性差异。