KDM1A抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤生长的药物中的应用

kdm1a抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤生长的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及肿瘤技术领域，具体涉及kdm1a抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤生长的药物中的应用。

背景技术：

2.胶质母细胞瘤(gbm)是最常见的原发性脑肿瘤，是最具侵袭性的人类癌症，因其极强的侵袭性和异质性，导致难以治愈。肿瘤细胞代谢重编程的一个标志性特征是增加营养消耗，以满足能量、合成代谢和促进生存的需求。胆固醇合成途径是肿瘤维持恶性生长和转移所必须的，以胆固醇合成通路作为研究对象在肿瘤防治中具有重要的科学价值。目前肿瘤中胆固醇代谢重编程的相关的研究还比较少，机制也不清楚，尤其是关于胶质母细胞瘤中胆固醇代谢重编程的调控机制还尚不明确。kdm1a(组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1a)作为第一个被正式提出的甲基转移酶在细胞的代谢途径中起着关键作用，目前还没有证据指出kdm1a是否参与肿瘤细胞的胆固醇合成代谢途径调控。本发明探究kdm1a是否参与调控胶质母细胞瘤的胆固醇合成代谢重编程机制，以期进一步在临床上通过对胆固醇含量的干扰而对胶质母细胞瘤达到更好的效果。

技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种kdm1a抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤生长的药物中的应用。
4.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.1、kdm1a抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤生长的药物中的应用。
6.本发明优选的，所述kdm1a抑制剂为ory-1001。
7.本发明优选的，所述kdm1a抑制剂为shrna载体。
8.所述shrna载体为sh1forward和sh1reverse，sh2 forward和sh2reverse退火形成双链后分别连入plko.1-trc载体的shrna construct的agei酶切位点和ecori酶切位点处；
9.所述sh1forward核苷酸序列为：5
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ccgggctacatcttaccttagtcatctcgagtactgattccattctacatcgtttttg-3’10.所述sh1reverse核苷酸序列为：5
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aattcaaaaagctacatcttaccttagtcatctcgagtactgattccattctacatcgg-3’11.所述sh2 forward核苷酸序列为：5
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ccggtattcagtttaatgtctaggcctcgagcggatctgtaatttgacttattttttg-3’12.所述sh2reverse核苷酸序列为：5
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aattcaaaaatattcagtttaatgtctaggcctcgagcggatctgtaatttgacttatg-3’。
13.本发明优选的，kdm1a抑制剂通过下调胶质母细胞瘤的胆固醇代谢相关途径中的srebp2、hmgcs1、hmgcr、sqle基因的表达量，从而降低胆固醇的合成量，抑制胶质母细胞瘤的生长。
14.本发明的有益效果在于：本发明明确了kdm1a通过激活胆固醇代谢相关途径中的srebp2、hmgcs1、hmgcr、sqle基因的表达量，参与调控胶质母细胞瘤的胆固醇合成代谢重编程机制，在临床上可通过使用kdm1a抑制剂ory-1001或shrna载体，干扰胶质母细胞瘤的胆固醇代谢，从而对胶质母细胞瘤达到更好的效果。
附图说明
15.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
16.图1为dm1a与胆固醇合成途径基因的表达关联性(spearman)分析；
17.图2为在lpds的条件下，gbm的kdm1a和胆固醇代谢途径被激活；
18.(a)lpds条件下u87细胞kdm1a及胆固醇代谢途径基因表达情况；
19.(b)lpds条件下ln229细胞kdm1a及胆固醇代谢途径基因表达情况；
20.图3为下调kdm1a抑制gbm胆固醇代谢途径；
21.(a)下调kdm1a对gbm细胞u87的胆固醇代谢途径基因表达情况的影响；
22.(b)下调kdm1a对gbm细胞ln229的胆固醇代谢途径基因表达情况的影响；
23.(c)ory-1001对gbm细胞胆固醇合成途径影响的蛋白水平分析；
24.(d)下调kdm1a对gbm细胞胆固醇合成途径影响的蛋白水平分析；
25.图4为恢复kdm1a激活gbm胆固醇代谢途径；
26.图5为在lpds的条件下，kdm1a不同表达量的gbm细胞kdm1a和胆固醇代谢途径被激活；
27.(a)lpds条件下u87细胞kdm1a及胆固醇代谢途径基因表达情况；
28.(b)lpds条件下ln229细胞kdm1a及胆固醇代谢途径基因表达情况；
29.图6为下调kdm1a导致gbm细胞中脂质含量降低(标尺长度为100px)。
具体实施方式
30.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
31.实施例1、kdm1a在胶质母细胞瘤中与胆固醇合成相关基因的表达呈正相关
32.基于基因表达谱数据动态分析(gene expression profiling interactive analysis，gepia)公共数据库(http://gepia.cancer-pku/)，分析临床表达谱数据中kdm1a在gbm与多个脂肪酸和胆固醇合成途径相关基因，如：srebp2、hmgcs1、hmgcr、sqle等基因呈显著相关性(图1)，说明kdm1a与gbm的胆固醇合成途径密切相关，这为本项目的开展奠定了理论基础。
33.实施例2、kdm1a激活lpds环境下gbm细胞的胆固醇合成途径
34.在正常细胞中，脂肪酸和胆固醇的合成主要发生在肝脏。由于血脑屏障的原因，gbm的脂类合成主要来自于自身合成以及从星形胶质细胞中摄取。为了研究gbm细胞中胆固醇合成途径是否可以被kdm1a激活，对gbm细胞进行脂蛋白缺乏血清(lpds)处理，研究在外源缺乏脂类物质条件下，gbm细胞内的胆固醇合成途径被激活的情况。结果显示，将gbm细胞u87、ln2292在lpds的条件下培养48h后，胆固醇合成途径相关基因如srebp2、hmgcr、hmgcs1
等显著上调(图2，a和b)。说明在lpds的条件下，gbm中胆固醇合成及摄取被显著激活，在营养缺陷型的肿瘤微环境中具备从头合成胆固醇的能力。值得注意的是，在lpds条件下，kdm1a的表达量也显著上升(图2，a和b)，说明在脂类营养缺陷条件下，kdm1a被激活，暗示着kdm1a与gbm脂肪类物质合成和摄取具有密切联系，可以利用该模型来研究gbm胆固醇代谢重编程的调控及分子机制。
35.实施例3、kdm1a抑制剂ory-1001处理和下调kdm1a的表达抑制了胆固醇合成相关基因的表达
36.根据前期的研究已经发现kdm1a与gbm细胞胆固醇合成代谢有明显的相关性，因此我们分别用kdm1a抑制剂ory-1001和shrna载体对gbm细胞的kdm1a表达量进行下调，通过qrt-pcr和western blot实验检测了kdm1a下调后的gbm细胞中胆固醇合成相关基因的表达量，发现srebp2、hmgcs1、hmgcr、sqle的mrna表达水平和蛋白表达水平均有明显的下调(图3，a，b，c和d)。接下来，我们将下调kdm1a的gbm细胞用kdm1a过表达慢病毒进行处理恢复其kdm1a的表达量，通过western blot检测发现随着kdm1a表达量的恢复，gbm细胞中与胆固醇合成相关的蛋白表达量也有明显的恢复(图4)。因此，kdm1a在gbm细胞中能够调控胆固醇合成相关基因的转录并进一步抑制这些基因的翻译表达。
37.shrna载体是基于商业化plko.1-trc空载体构建，根据kdm1a序列构建shrna载体的kdm1ashrna序列，具体序列分别为：
38.sh1forward：5
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ccgggctacatcttaccttagtcatctcgagtactgattccattctacatcgtttttg-3’39.sh1reverse：5
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aattcaaaaagctacatcttaccttagtcat ctcgagtactgattccattctacatcgg-3’40.sh2 forward：5
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aattcaaaaatattcagtttaatgtctaggcctcgagcggatctgtaatttgacttatg-3’42.分别将sh1forward和sh1reverse，sh2 forward和sh2reverse退火形成双链后分别连入plko.1-trc载体的shrna construct的agei酶切位点和ecori酶切位点处。
43.实施例4、将lsd1的表达下调后，lpds处理gbm细胞不能激活胆固醇合成途径
44.根据之前的研究我们发现在外源脂质缺乏的环境下gbm细胞的kdm1a以及胆固醇合成途径相关基因的表达被明显上调，为了研究kdm1a是否参与指导lpds环境中胆固醇从头合成的激活，将gbm细胞的kdm1a表达量下调以后再进行lpds处理。与对照组相比，kdm1a下调后srebp2、hmgcs1、hmgcr的表达量并未发现非常明显的上调，而且kdm1a本身的表达量也没有表现出明显的变化(图5，a和b)。这说明kdm1a缺失后在脂质缺乏营养胁迫环境中，gbm细胞不能最大限度地激活胆固醇生物合成来支撑自身的营养所需。这些实验现象进一步说明了kdm1a对胆固醇合成相关基因的调控作用，且kdm1a在gbm细胞的胆固醇生物合成途径的激活中起到关键的启动作用。
45.实施例5、kdm1a的表达量调控gbm细胞中胆固醇的含量
46.根据前期的实验我们已经知悉kdm1a能够调控gbm细胞胆固醇合成相关基因的表达，为了进一步研究kdm1a对gbm细胞胆固醇含量的影响我们采用了油红o染对
47.kdm1a下调后的gbm细胞中脂质的分布进行了检测。研究发现，与对照组相比，下调了kdm1a的gbm细胞中只有极少量的脂质分布，且细胞中出现了大量的细胞空泡(图6)。因此我们认为kdm1a的表达量与gbm细胞中胆固醇的分布以及含量密切相关。
48.综合以上研究结果，我们发现kdm1a调控gbm细胞中与胆固醇合成相关的基因的表达并最终反映到gbm细胞中胆固醇的含量上。
49.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：

1.kdm1a抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤生长的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的kdm1a抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤药物中的应用，其特征在于：所述kdm1a抑制剂为ory-1001。3.根据权利要求1所述的kdm1a抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤药物中的应用，其特征在于：所述kdm1a抑制剂为shrna载体。4.根据权利要求3所述的kdm1a抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤药物中的应用，其特征在于：所述shrna载体为sh1forward和sh1reverse，sh2 forward和sh2reverse退火形成双链后分别连入plko.1-trc载体的shrna construct的agei酶切位点和ecori酶切位点处；所述sh1forward核苷酸序列为：5
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ccgggctacatcttaccttagtcatctcgagtactgattccattctacatcgtttttg-3’所述sh1reverse核苷酸序列为：5
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aattcaaaaagctacatcttaccttagtcatctcgagtactgattccattctacatcgg-3’所述sh2 forward核苷酸序列为：5
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ccggtattcagtttaatgtctaggcctcgagcggatctgtaatttgacttattttttg-3’所述sh2reverse核苷酸序列为：5
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aattcaaaaatattcagtttaatgtctaggcctcgagcggatctgtaatttgacttatg-3’。5.根据权利要求1所述的kdm1a抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤药物中的应用，其特征在于：kdm1a抑制剂通过下调胶质母细胞瘤的胆固醇代谢相关途径中的srebp2、hmgcs1、hmgcr、sqle基因的表达量，从而降低胆固醇的合成量，抑制胶质母细胞瘤的生长。

技术总结

本发明公开了KDM1A抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤生长的药物中的应用，本发明明确了KDM1A通过激活胆固醇代谢相关途径中的SREBP2、HMGCS1、HMGCR、SQLE基因的表达量，参与调控胶质母细胞瘤的胆固醇合成代谢重编程机制，在临床上可通过使用KDM1A抑制剂ORY-1001或shRNA载体，干扰胶质母细胞瘤的胆固醇代谢，从而对胶质母细胞瘤达到更好的效果。从而对胶质母细胞瘤达到更好的效果。从而对胶质母细胞瘤达到更好的效果。

技术研发人员：

祝顺琴 胡婷 张夕梅 刘堰

受保护的技术使用者：

西南大学

技术研发日：

2022.09.29

技术公布日：

2022/11/25