一种黑臭水体修复菌剂及其应用

本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种黑臭水体修复菌剂及 其应用。

随着城市化进程的加快、经济的快速发展，越来越多的生产废水和生活污 水排入河流，造成了河流不同程度的污染，其中较为严峻的就是河流黑臭现象。 水体黑臭已成为近几十年来普遍存在的问题，存在诸多危害，不仅影响了城市 形象，也会导致水体生态系统恶化，给周边居民的健康造成影响。因此，黑臭 水体修复技术的研究显得尤为迫切。

黑臭水体修复技术可分为化学修复、物理修复、生物修复。其中化学 修复存在向水体中引入污染物造成二次污染的风险；物理修复成本较高， 容易破坏水体生态系统，导致黑臭复发；生物修复具有环境友好、成本低 廉、技术简单、易于维护等优点，是目前水环境修复和黑臭水体治理研究 领域的热点。

投加菌剂是常用的一种生物修复方法，强化微生物分解功能，利用微 生物对污染物的吸收转化达到降解污染物的目的。目前在黑臭水体修复中， 复合菌剂构建方法不明确，制备工艺复杂，组成菌种类繁多，应用成本较 高，且普遍存在菌剂投加到环境中后无法定量检测其生长情况的问题，亟 待解决。

针对现有技术的不足，本发明提供了一种黑臭水体修复菌剂，可有效 修复黑臭水体。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明公开了一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2021年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编 号为：CGMCC No.24061。

相应的，一株酿酒酵母，其16S rDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

相应的，包含上述所述酿酒酵母的修复菌剂。

优选的，还包括蜡样芽孢杆菌、克雷伯氏菌和链霉菌。

优选的，所述蜡样芽孢杆菌，于2021年12月09日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24062；所 述链霉菌于2021年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24063。

优选的，所述蜡样芽孢杆菌、克雷伯氏菌、酿酒酵母、链霉菌的活菌 量分别为2.1×109cfu/mL、8×108cfu/mL、6.2×108cfu/mL、6.4×109cfu/mL。

优选的，所述修复菌剂的构建方式为：将单独发酵的链霉菌和将蜡样 芽孢杆菌、克雷伯氏菌和酿酒酵母进行混合发酵后的菌液进行混合。

优选的，所述蜡样芽孢杆菌、克雷伯氏菌和酿酒酵母进行混合发酵的 比例为0.31：0.18：0.51，单独发酵的链霉菌和混合发酵后的菌液的质量 比为1:1。

相应的，所述修复菌剂在黑臭水体处理中的应用。

优选的，所述修复菌剂在黑臭水体中的投加方式为：采用喷洒方式投 加菌液至黑臭水体中，同时曝气24h，随后停止；3d后再次投加，曝气24h， 随后停止；3d后再次投加，曝气24h。

优选的，按照体积比，单次投加所述修复菌剂的投加量为0.1～1％。

本发明具备以下有益效果：

1.本发明提供的修复菌剂由四种菌株组成，分别为蜡样芽孢杆菌、克 雷伯氏菌、酿酒酵母和链霉菌；经过复配比例优化和降解条件优化，该复 合菌剂可有效修复水体黑臭，降低水中COD、氨氮等污染物浓度，提升水 体DO、ORP、透明度，可将重度黑臭水体修复为无黑臭状态；而且，菌剂组 成简单，发酵方法简单，投加量少，可有效降低黑臭水体修复成本。

2.本发明所公开的修复菌剂通过荧光定量PCR检测方法可以定量检测 菌剂投加到环境中的定植情况；一方面可以根据菌剂的存在情况定期补加 菌剂，另一方面可以深入研究菌剂的生长特性，对复合菌剂进行进一步优 化；结果表明菌株投加67d后仍定植于环境中，环境稳定性好。

图1为20株菌对黑臭水体COD、NH3-N的五天去除率；

图2为20株菌株修复黑臭水体后的DO和ORP值；

图3为40组复合菌剂对黑臭水体COD、NH3-N的五天去除率；

图4为40组复合菌剂修复黑臭水体后DO和ORP值；

图5为FN4(左)与复合菌剂(右)扫描电镜图；

图6为复合菌剂投加量为0.1％时COD去除率、NH3-N去除率响应结果；

图7为菌株C111、B16、J13、FN4的菌落形态；

图8为菌株C111、B16、J13、FN4荧光定量PCR标准曲线；

图9为复合菌剂在上覆水中定量检测结果；

图10为复合菌剂在表层沉积物中定量检测结果。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进 行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没 有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的 范围。

若未特别指明，实施举例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知 的常规手段。

本发明涉及的各试剂和培养基如下：

1、LB培养基(富集培养基)：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母粉5g，水 1000mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。加入琼脂20g则为LB固体培养基， 加入琼脂7.5g则为LB半固体培养基。

2、黑臭水体斜面培养基：黑臭水体1000mL，琼脂20g。

3、初筛培养基(黑臭底泥培养基)：黑臭底泥100g，琼脂20g，加水 至总体积1000ml。

4、人工模拟黑臭水体：牛肉膏0.35g，NaCl0.16g，KCl0.03g，CaCl2 0.022g，MgSO4·7H2O 0.022g，K2HPO4 0.84g，KH2PO4 0.11g，乳酸0.05mL， 磺胺酸0.0073g，柠檬酸铁0.0073g，尿素0.06g，蛋白胨0.36g，自然黑 臭水体50mL，30℃厌氧静置5d。

一、黑臭水体修复单菌筛选

1.单菌来源。

采用平板划线、纯化分离的方法从成都市和什邡市五处黑臭水体(十 陵河黑臭水、东湖公园、川大荷花池、锦江黑臭段、科分院池塘)和四处 黑臭底泥(十陵河底泥、双沙桥底泥、双流黑臭河底泥、什邡黑臭河底泥) 纯化分离土著菌株59株。

2.菌株驯化。

将所有菌株从斜面接种至对应的液体培养基中，恒温震荡箱30℃， 140r/min培养2～3天，作为种子液；制备培养基(黑臭水：LB培养基＝3： 7，v/v)，接种种子液进行一次传代，恒温震荡箱30℃，140r/min培养2～ 3天；制备培养基(黑臭水：LB培养基＝5：5，v/v)，进行二次传代，恒 温震荡箱30℃，140r/min培养2～3天；制备培养基(黑臭水：LB培养基 ＝7：3，v/v)，进行三次传代，恒温震荡箱30℃，140r/min培养2～3天； 制备培养基(黑臭水：LB培养基＝9：1，v/v)，进行四次传代，恒温震荡 箱30℃，140r/min培养2～3天；最后将菌株保存至黑臭水斜面培养基中。

3.定性初筛。

选择能够在黑臭底泥中定植的微生物制备黑臭水体修复菌剂，可以保 证投加的菌剂在黑臭水体中长期稳定存在。因此，用灭菌后的黑臭底泥培 养基对驯化后的菌株进行进一步筛选。用上述驯化后的菌株进行平板划线， 恒温培养箱30℃培养五天后，观察并记录菌株在平板上的生长情况，挑选 出20株在初筛培养基上生长良好的菌株，20株菌株菌落形态见下表1所示。

表1 20株菌株菌落形态特征

菌株编号 菌落形态 B16 乳白菌落，圆形，菌落较大，表面湿润粘稠 Y1279 菌落透明，中间隆起，向四周发散，形状不规则，粘稠 C11 乳白，圆形，表面光滑，凸起，湿润 J16 乳白，圆形，表面光滑，凸起，湿润 Y1250 白圆形，中间凸起，表面光滑，边缘干燥 J13 白菌落，不规则，表面光滑湿润，中间突起 J25 形状不规则，较透明，表面湿润，中间凸起 FN4 菌落直径约2mm，圆形，干燥，中间凸起，白，边缘透明 FN7 菌落呈圆形，中间隆起，白，边缘透明凹陷 Y1122 白菌落，边缘不规则，表面湿润 Q17 白圆形，直径约1.5mm，中间隆起，表面较湿润 Y1117 白圆形，表面湿润，扁平无隆起 Y115 浅黄圆形菌落，中间隆起，表面湿润 Q11 圆点状，菌落直径约1mm，表面干燥 C111 白圆形，直径约3mm，表面湿润，边缘呈绒毛状向外发散 Y1115 白圆形，直径约2mm，表面湿润，边缘圆滑 Y106 淡黄圆形，边缘湿润，顶部呈同心圆向上凸起，凸起部分白干燥 CX4 黄菌落，不规则圆形，表面湿润，中间隆起 C13 白菌落，边缘不规则，表面干燥，扁平无隆起 Q24 白菌落，边缘呈浅黄，较透明，中间隆起，呈乳白，表面湿润

4.定量复筛。

将上述菌株接种于150mL LB培养基中，恒温震荡箱30℃，140r/min 培养48h。在无菌环境中，用移液器吸取3mL培养液，5000r/min离心5min， 倒掉上清，用无菌生理盐水将沉淀清洗三次后加入100mL人工模拟黑臭水 体中。五天后测定黑臭水体COD、氨氮、DO、ORP，根据水质指标公式评价 其修复效果。五天后COD去除率、NH3-N去除率见图1所示，水体ORP值、水体DO值见图2所示。由降解试验结果可知，菌株FN4、Y1122、Q24对黑 臭水体COD五天去除率最高，分别为63.9％、57.9％、56.8％；菌株Y115、 C111、B16对黑臭水体NH3-N五天去除率最高，分别为13.04％、12.4％、11.7％； 菌株J16、C11、J13对黑臭水体溶解氧提高最明显；菌株FN4、FN7、B16 对黑臭水体ORP值提升最明显。

5.拮抗作用测定。

采用牛津杯法对20株菌株间的拮抗作用进行了测定。双层培养基底层 为LB固体培养基，上层为琼脂含量为0.75％、菌液含量为10％的LB半固体 培养基，其中添加的菌液的选择方式为：测量两种菌的拮抗作用时，选择 其中一种菌的菌液添加到LB半固体培养基中。底层培养基凝固后，插入牛 津杯，将含底物菌液的上层培养基倒入培养皿中，凝固后取出牛津杯，每 孔加入100μL反应物菌液，30℃培养24h后，观察并记录抑菌圈直径。结 果见下表2所示。

表2菌株间拮抗作用抑菌圈测定结果(mm)

注：牛津杯直径为8mm，抑菌圈直径大于8mm表明两株菌之间有抑制生长作用。

二、黑臭水体修复菌剂构建

1.种子液制备。

用LB培养基将20株菌分别发酵至对数后期，用无菌水稀释，测定菌 液的OD600，调整菌液OD值为0.2作为种子液，调节菌液的OD值是通过调 节菌液的浓度实现。

2.混合发酵。

以各菌株处理黑臭水体后COD、NH3-N的去除率、水体DO、ORP的修复 效果为四个水平，根据降解试验选择各水平最优的前三株菌作为三个因素， 设计四因素三水平的全因子复合实验，得到81组微生物落。根据拮抗作 用去除包含Y115-FN4、B16-FN7、C11-Y115的落，最终剩下40组复合菌 剂，命名为EM1～EM40，对应的组成菌株见表3所示。

表3 40组复合菌剂及其组成菌株

将各单菌种子液按体积比为1：1：1：1的比例接种至LB培养基中， 恒温震荡箱30℃，140r/min培养2～3天得到40组复合菌剂。在无菌环境 中，用移液器吸取3mL培养液，5000r/min离心5min，倒掉上清，用无菌 生理盐水将沉淀清洗三次后加入100ml人工模拟黑臭水体中。五天后测定 黑臭水体COD、氨氮、DO、ORP，根据水质指标公式评价其修复效果。五天 后COD去除率、NH3-N去除率见图3所示，水体ORP值、水体DO值见图4 所示。综合考虑四个主要指标，复合菌剂EM31(FN4，C111，B16，J13)对 黑臭水体修复效果明显，该落对黑臭水体中COD五天去除率为77％，氨氮 去除率为44％，比单菌COD去除率提升13.5％，氨氮去除率提升31％。

3.复合菌剂优化。

3.1比例优化

不同的接种比例会导致菌株间相互作用程度不一样，因此优化菌株间 接种比例有利于提升复合菌剂对黑臭水体的处理效果。混料设计主要研究 各实验因子的不同比例与反应变量的关系，通过对不同百分比的混料试验， 得到试验指标与混料中各种成分所占百分比的回归方程，通过回归方程给 出统计结论。用混料设计确定复合菌剂比例，可以通过少量试验即得到试 验指标与各菌比例的关系，能够更精确地分析和预测混合效果。

采用minitab软件进行混料设计，将四个菌株按照试验组中比例接种 于150mL LB培养基中进行混合发酵，恒温震荡箱30℃，140r/min培养48h。 在无菌环境中，用移液器吸取3mL培养液，5000r/min离心5min，倒掉上 清，用无菌生理盐水将沉淀清洗三次后加入100ml人工模拟黑臭水体中。 五天后测定黑臭水体COD、氨氮，以COD去除率(COD EF％)和氨氮去除率 (NH3-N EF％)作为响应值。混料设计15组实验组设置及响应值测定结果见表 4所示。

表4混料设计试验组及响应值

以COD去除率为响应值的模型拟合优化结果为FN4：C111：B16：J13＝0： 0.31：0.18：0.51，以氨氮去除率为响应值发现菌株间比例与氨氮去除率 无对应关系。结合菌株生理生化特性测定结果，考虑到FN4具有硝酸盐还 原作用，且FN4为球状结构，有利于构建具有空间结构的高效微生物落， 促进各菌株之间产生的代谢中间体、辅因子、维生素等物质传递，确保具 有菌株生长，增强代谢物和信号分子在不同细胞之间的有效转移，提高 落对环境的抗压能力，因此采用“单独发酵的FN4菌丝球+混合发酵的(C111： B16：J13)”模式构建高效微生物落复合菌剂。C111：B16：J13混合发 酵的体积比为0.31：0.18：0.51。FN4菌丝球与混合发酵的(C111：B16： J13)比例为1：1(质量比)，其中，蜡样芽孢杆菌、克雷伯氏菌、酿酒酵 母、链霉菌的活菌量分别为2.1×109cfu/mL、8×108cfu/mL、6.2×108cfu/mL、 6.4×109cfu/mL。对发酵前和发酵后的菌丝球进行电镜扫描(图5)，从微 生物形态可以初步判定FN4的菌丝上负载有另外三株菌。

3.2降解条件优化

以COD去除率和氨氮去除率为响应值优化复合菌剂降解黑臭水体时的 pH、温度和菌剂投加量三个因素。采用minitab进行响应面设计，按3.1 优化结果进行混合菌剂发酵，在无菌环境中，用移液器吸取3mL培养液， 5000r/min离心5min，倒掉上清，用无菌生理盐水将沉淀清洗三次后加入 100ml人工模拟黑臭水体中。五天后测定黑臭水体COD、氨氮，以COD去除 率(COD EF％)和氨氮去除率(NH3-N EF％)作为响应值。响应面17个试验组 及试验结果见表5所示，其中菌剂的投加量根据黑臭水体的体积确定。

表5响应面实验组及响应值

对COD去除率和氨氮去除率结果(即表5中数据)进行模型拟合，得到 投加量为0.1％、pH为6.187、温度为20.964℃时，COD和氨氮去除率有最 大期望值，最佳降解条件及预期期望值见表6所示，响应面三维响应图见 图6。

表6响应面优化结果

pH 温度/℃ 投加量/％ COD EF％ NH₃-N EF％ 期望值 6.187 20.964 0.100 78.995 52.396 0.640

3.3优化结果验证

根据上述优化结果验证复合菌剂和优化后复合菌剂对人工模拟黑臭水 体进行降解试验，结果见表7所示。表7结果表明，优化前复合菌剂对COD 去除率为73.3％，氨氮去除率为40％，优化后复合菌剂对COD去除率为83.16％， 氨氮去除率为53.23％。

表7复合菌剂优化结果

指标 COD(mg/L) 氨氮(mg/L) DO(mg/L) ORP(mV) 透明度(cm) 黑臭程度 黑臭水体 172.5 16 0.1 -217 14.4 重度黑臭 优化前复合菌剂 46 9.6 5.11 220 >30 轻度黑臭 优化后复合菌剂 29.05 7.48 6.27 287 >30 无黑臭

三、菌株鉴定

1.生理生化特性鉴定。

将C111、B16、J13、FN4接种于LB培养基上，置于30℃的恒温培养箱 中进行培养，24h后观察菌落形态，菌落形态如图7所示。菌株的糖发酵实 验可以衡量菌株对不同碳源的利用能力，菌株的絮凝能力对于污水中有机 污染物的去除有重要作用。对四株菌进行絮凝活性测定、葡萄糖、乳糖、 蔗糖发酵实验、硝酸盐还原作用的测定。

各检测方法如下：

(1)絮凝活性测定：称取5g高岭土，加入1L去离子水，采用磁力搅 拌器高速旋转5min，用NaOH溶液调节pH值到7.0。量取20mL高岭土悬 液加入25mL比管，加入1mL CaCl2溶液(10g/L)，再加入5mL发酵上清液， 轻轻上下摇匀，静止5min在550nm处测定吸光值。以去离子水作为空白对 照。

絮凝活性的计算公式＝(空白组在550nm处的吸光值-样品组550nm处 的吸光值)/空白组在550nm处的吸光值*100％。

(2)葡萄糖发酵实验：制备糖发酵液体培养基(蛋白胨1％，NaCl 0.5％， 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1％，葡萄糖溶液1％，其余为水)，培养基中放入倒 置的杜氏小管，在无菌环境中，将四株菌分别接种至培养基中，置于37℃ 恒温培养箱中培养48h，培养基变黄为产酸阳性，杜氏小管中有气泡为产 气阳性，否则为阴性。

(3)乳糖发酵实验：制备糖发酵液体培养基(蛋白胨1％，NaCl 0.5％， 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1％，乳糖溶液1％，其余为水)，培养基中放入倒置 的杜氏小管，在无菌环境中，将四株菌分别接种至培养基中，置于37℃恒 温培养箱中培养48h，培养基变黄为产酸阳性，杜氏小管中有气泡为产气 阳性，否则为阴性。

(4)蔗糖发酵实验：制备糖发酵液体培养基(蛋白胨1％，NaCl 0.5％， 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1％，蔗糖溶液1％，其余为水)，培养基中放入倒置 的杜氏小管，在无菌环境中，将四株菌分别接种至培养基中，置于37℃恒 温培养箱中培养48h，培养基变黄为产酸阳性，杜氏小管中有气泡为产气 阳性，否则为阴性。

(5)硝酸盐还原实验：制备硝酸盐培养基(KNO3 0.1％，柠檬酸钠0.5％， 磷酸氢二钾0.1％，七水硫酸镁0.02％，三水磷酸氢二钾0.1％，其余为水)， 培养基中放入倒置的杜氏小管，在无菌环境中，将四株菌分别接种至培养 基中，置于37℃恒温培养箱中培养1～4d，将检测试剂甲液(对氨基苯磺 酸0.8g+5mol/L醋酸100mL)和乙液(α-萘胺0.5g+5mol/L醋酸100mL) 等量混合(各0.5mL)后加入培养基内，培养基出现红为硝酸盐还原阳性， 否则为阴性。

结果如表8所示，其中，“-”表示呈阴性，“+”表示呈阳性。

表8生理生化指标鉴定结果

2.分子鉴定。

(1)C111：采用生工细菌DNA提取试剂盒提取纯化后的C111菌的DNA， 以之为模板，选取16S rRNA细菌通用引物进行PCR扩增，并进行电泳纯化 及回收，PCR产物交由生工进行测序，得到长度为840bp的序列，具体序列 如SEQ ID NO：1所示。

利用BLAST将所测得的序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已登录的 序列进行同源性比较，C111同源性最近菌株为蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)，序列覆盖率为98％，相似性为99％。菌株C111命名为蜡样芽孢杆 菌ZD-C，于2021年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.24062，保藏地址为：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号。

(2)B16：采用生工细菌DNA提取试剂盒提取纯化后的B16菌的DNA， 以之为模板，选取16S rRNA细菌通用引物进行PCR扩增，并进行电泳纯化 及回收，PCR产物交由生工进行测序，得到长度为1190bp的序列。

利用BLAST将所测得的序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已登录的 序列进行同源性比较，B16同源性最近菌株为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)， 序列覆盖率为96％，相似性为99％。同时，从中国科学院成都生物研究所的 微生物资源库中检索发现菌株B16测得的序列与中国发明专利申请号为 201711116739.9的高产生物絮凝剂的BFX-01菌株及获得的生物絮凝剂中所 公开的克雷伯氏菌的序列相同。因此，对于本发明所需的克雷伯氏菌可通 过本发明公开的上述公开的单菌纯化筛选的方式获得，也可采用上述现有 专利中公开的方式进行筛选获得，亦或者通过直接购买的方式获得。

(3)J13：采用生工真菌DNA提取试剂盒提取纯化后的J13菌的DNA， 以之为模板，选取16S rRNA真菌通用引物进行PCR扩增，并进行电泳纯化 及回收，PCR产物交由生工进行测序，得到长度为300bp的序列，具体序列 如SEQ ID NO：2所示。

利用BLAST将所测得的序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已登录的 序列进行同源性比较，J13同源性最近菌株为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，序列覆盖率为98％，相似性为99％。菌株J13命名为酿酒酵母 ZD-J，于2021年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.24061，保藏地址为：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号。

(4)FN4：采用生工真菌DNA提取试剂盒提取纯化后的FN4菌的DNA， 以之为模板，选取16S rRNA放线菌通用引物进行PCR扩增，并进行电泳纯 化及回收，PCR产物交由生工进行测序，得到长度为378bp的序列，具体序 列如SEQ ID NO：3所示。

利用BLAST将所测得的序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已登录的 序列进行同源性比较，J13同源性最近菌株为链霉菌(streptomyces sp.)， 序列覆盖率为99％，相似性为99％。菌株FN4命名为链霉菌ZD-F，于2021 年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.24063，保藏地址为：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号。

至此，发明人构建了一种黑臭水体修复菌剂，其组成菌为C111(bacillus cereus蜡样芽孢杆菌)、B16(Klebsiella sp.克雷伯氏菌属)、J13(saccharomyces cerevisiae酿酒酵母)、FN4(streptomyces sp.链霉菌属)。

四、黑臭水体修复菌剂的定量检测方法

1.引物设计。

在GeneBank中输入各菌株的SEQ序列，综合引物GC含量、退火温度 选择得分最高的引物序列，四个菌株的引物序列见表9所示。

表9四菌株对应的特异性引物

2.荧光定量PCR反应程序和反应体系的优化和建立。

通过对Mg2+浓度、引物浓度和退火温度的选择，以最低Ct值和最高RFU 为筛选指标，确定反应体系和反应程序。

(1)PCR反应程序为：①预变性95℃3min，②荧光收集，95℃10sec， 退火温度(B1659℃；C111 58℃；J13 59℃；FN4 69℃)30sec，每个循 环结束后进行荧光信号收集，扩增40个循环，③溶解曲线分析，55℃逐步 升至95℃，每隔0.2℃收集一次荧光。

(2)PCR反应体系为：体系总体积为20μL，体系组成：2x SYBR Gerrnabstract PCRMix 10μL，模板1μL，引物终浓度为B16 0.3μM， C111 0.2μM，J13 0.3μM，FN4 0.7mM,加ddH2O补足至20μL。

3.标准曲线的制备。

(1)目的基因片段的获取。

分别过夜培养C111、B16、J13、FN4菌株，提取各培养液中的总DNA， 通过紫外分光光度计和凝胶电泳确定DNA的纯度和浓度，以上述引物和反 应程序对各菌株DNA进行荧光定量PCR反应。

通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，然后在紫外灯下切下目的 基因条带，用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，即获得纯化的各菌 株目的基因片段。

(2)标准品的制备。

通过紫外分光光度计测量各菌株目的基因DNA A260的值，计算各样品 DNA浓度，计算公式为：DNA浓度(μg/mL)＝A260×稀释倍数×50μg/mL。

根据相对分子质量和阿伏伽德罗常数计算出分子拷贝数，DNA拷贝数计 算公式为：copies/μL＝(6.02×1023copies/mol)×(DNA浓度g/mL×10-9) /(碱基数×660g/mol)，调整标准品的浓度为109copies/uL，然后10倍 系列稀释PCR产物以获得浓度为109，108,107,106,105,104,103,102copies/uL 的DNA溶液每个样品1mL。

(3)标准曲线的建立。

取步骤(2)所得标准品，分别作为实时荧光定量PCR反应的模板进行 扩增，以不同稀释梯度目的基因拷贝数的对数值对相应的阈值循环数做图， 制作标准曲线。C111、B16、J13、FN4对应的荧光定量PCR标准曲线见图8 所示。根据该标准曲线可以获得菌剂投加到自然黑臭水体中后定量检测菌 剂的生长情况。

下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例1

1.菌液的配制：按照3.1优化后所述比例将C111、B16、J13接种至LB 培养基中，恒温振荡箱30℃，140r/min培养24h，单独将FN4接种至LB培 养基中，恒温振荡箱30℃，140r/min培养24h，将两种发酵液混合，恒温 振荡箱30℃，140r/min培养10h，即得复合菌剂菌液。菌液中蜡样芽孢杆 菌、克雷伯氏菌、酿酒酵母、链霉菌的活菌量分别为2.1×109cfu/mL、8× 108cfu/mL、6.2×108cfu/mL、6.4×109cfu/mL。

2.修复方法：自然黑臭水体环境较为复杂，为了使菌株能够定植于自 然环境中，在黑臭水体体积不变的情况下，单次接种量相比3.3优化结果 验证(实验对象为人工模拟黑臭水，投加量为0.1％)扩大了10倍。投加菌 剂的次数变为3次。水温为20～25℃时，试验组采用喷洒的方式向黑臭水 体中投加1％复合菌剂菌液，喷洒当日水体曝气24h，随后停止；3d之后再 次喷洒1％复合菌剂菌液，喷洒当日水体曝气24h，随后停止；一共喷洒3 次菌液。总修复时间为67d。对照组不添加菌液。测定修复前后试验组和对 照组水体的COD、氨氮、DO、ORP、透明度。

其中，化学需氧量COD使用Lovibond COD测定仪按HJ/T 399-2007标 准快速消解分光光度法测定；氨氮按照HJ 535-2009纳氏试剂分光光度法 测定；溶解氧DO按照《水和废水监测分析方法(第四版)》中所述电极法 用便携式测定仪进行原位测定；氧化还原电位ORP按照《水和废水监测分 析方法(第四版)》中所述电化学法进行原位测定；透明度按照《水和废 水监测分析方法(第四版)》中所述方法用透明度计进行测定；黑臭等级 根据《城市黑臭水体整治工作指南》中所述城市黑臭水体污染程度分级标 准进行判定。

结果如表10所示。从表中可以看出，自然条件下，黑臭水体中COD大 部分也可以被降解，但是仍然存在氨氮浓度高、溶解氧浓度低的问题，投 加复合菌剂可以大幅提升黑臭水体中氨氮去除率，增加溶解氧浓度，可将 重度黑臭水体恢复为无黑臭状态。由于前述3.3优化结果验证-模拟黑臭水 体实验中复合菌剂对氨氮的去除率最高为53.23％，而在实际黑臭水体中试 修复实验中，复合菌剂对黑臭水体中氨氮去除率高达95.39％，推测是由于复合菌剂的添加与环境中土著微生物存在相互作用，刺激了某些土著菌株 的生长，使氨氮去除率增加。

表10菌剂对实际黑臭水体的修复效果

3.复合菌剂的定量检测。

采用生工土壤DNA提取试剂盒提取修复前和修复后试验组和对照组上 覆水和表层沉积物的总DNA，然后根据表8的引物和反应体系分别进行荧光 定量PCR扩增，得到CT值，根据图8所示的标准曲线计算C111、B16、J13、 FN4菌株目的基因拷贝数。复合菌剂投加到黑臭水体中上覆水和表层沉积物 中四个菌株的基因拷贝数变化见图9和图10所示。

结果显示：菌剂投加前(D0时期)，上覆水和沉积物中都没有检测出 目的基因，菌剂投加结束后(D12时期)，上覆水中四种菌株目的基因拷贝 数较高，拷贝数对数分别为5.11、4.16、4.62、6.57，此时表层沉积物中 四种菌株目的基因拷贝数较低，拷贝数对数分别为0.33、0、0.54、1.14， 此后结束菌剂投加，至实验结束时(D67时期)，上覆水中四种菌株拷贝数 有所降低，而表层沉积物中菌株拷贝数除C111以外明显增加。由此可以看 出该复合菌剂的生长特性，即复合菌剂中的三种菌株(B16、J13、FN4)能 在黑臭水体和黑臭底泥中定植，其中FN4的定植效果最好，另外一株菌C111 仅能在黑臭水体中定植。通过定量检测复合菌剂在环境中的存在情况，一 方面可以根据菌剂的存在情况定期补加菌剂，另一方面可以深入研究菌剂 的生长特性，对复合菌剂进行进一步优化。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明 的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人 员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求 书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种黑臭水体修复菌剂及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 840

<212> DNA

<213> 蜡样芽孢杆菌ZD-C(Bacillus cereus)

<400> 1

actgagacac ggcccagact yctacgggag gcagcagtag ggawyyykcc gcaatggacg 60

aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt 120

gttagggaag aacaagtgct agttgaataa gctggcacct tgacggtacc taaccagaaa 180

gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga 240

attattgggc gtaaagcgcg cgcaggtggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct 300

caaccgtgga gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc 360

catgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatat ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc 420

tggtctgtaa ctgacactga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg 480

gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg 540

aagttaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga 600

attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 660

ccttaccagg tcttgacatc ctctgaaaac cctagagata gggcttctcc ttcgggagca 720

gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 780

gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc catcattaag ttgggcactc taaggtgact 840

<210> 2

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母ZD-J(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

agagcatgag agcttttact gggcaaraar acaagaratg gagagtccag ccgggcctgc 60

gcttaagtgc gcggtcttgc taggcttgta agtttctttc ttgctattcc aaacggtgag 120

agatttctgt gcttttgtta taggacaatt aaaaccgttt caatacaaca cactgtggag 180

ttttcatatc tttgcaactt tttctttggg cattcgagca atcggggccc agaggtaaca 240

aacacaaaca attttattta ttcattaaat ttttgtcaaa aacaaraatt ttcgtaactg 300

<210> 3

<211> 378

<212> DNA

<213> 链霉菌ZD-F(streptomyces sp.)

<400> 3

gcagccgcgg taatacgtag ggcgcgagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagagctc 60

gtaggcggct tgtcacgtcg gttgtgaaag cccggggctt aaccccgggt ctgcagtcga 120

tacgggcagg ctagagttcg gtaggggaga tcggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg 180

cagatatcag gaggaacacc ggtggcgaag gcggatctct gggccgatac tgacgctgag 240

gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt 300

gggcactagg tgtgggcgac attccacgtc gtccgtgccg cagctaacgc attaagtgcc 360

ccgcctgggg agtacgga 378