一种PHA合酶和编码基因及其制备和应用

本发明涉及一种PHA合酶的基因序列及其制备方法。本发明提 供了该PHA合酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在合成聚羟基 脂肪酸酯(PHA)方面的应用。本发明提供的PHA合酶可广泛应用于 农业、食品、医药及环保等领域。

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，缩写为PHAs)是微生 物合成的一类聚酯(PHB是PHA的一种)，由于其具有优良性质，如 生物可降解性、生物相容性和光学性能等，有很广泛的用途。生物可 降解性和热加工性使得其可制作塑料袋，农用地膜及农用除草剂、杀 虫剂、肥料的载体，提高它们的利用效率而不会产生环境污染。生物 相容性使得其可用作医用植入材料，药物载体，可调节药物的释放速 率。手物：其手性单体(R型)可以作为手物或者手物 合成的中间体。良好的气体相隔性使得其可用作食品等的包装材料。 此外PHA还可用于生产生物能源，具有可燃性，经甲酯化处理以后， 可直接作为生物燃料，只比柴油的燃烧热低15％左右。由于其具有这 些优良特性，所以现已吸引了科技界和工业界的广泛兴趣。

PHA合酶(PhaC)是PHA合成代谢途径中的一个关键酶，在 Ralstonia eutropha中的这个酶研究较为详细，测定了酶活以及动力 学特性，确定了活性中心以及做过定点突变等工作，将该酶与其它两 个酶一起在大肠杆菌或者毕赤酵母中构建了PHA代谢途径，产量也 比较高，还通过添加不同底物的方式改变PHA的组成特性以生产具 有某些特殊性能的PHA，在Ralstonia eutropha中，基本上相关的方面 都已经研究过了，但是在Methylobacterium菌属中只是确认了在该 菌属中存在着这种酶，没有异源表达，也没有详细的测过酶活以及动 力学特性。由于有机试剂对很多酶有较强的抑制作用，容易使酶的高 级结构发生变化而变性失活，而Methylobacterium可以在甲醇培养 液中生长，所以来源于Methylobacterium中的该酶应该对对机试剂具 有一定的耐受性，这也是其它来源的这个酶可能不具有的特性。我们 研究了在Methylobacterium sp.中该酶的活力大小以及动力学特性，更 好地认识和利用了该酶。

本发明的第一个目的是提供一种新型的PHA合酶PhaC及其编码 基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型PHA合酶PhaC的方 法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的PHA合酶PhaC基因重组 表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种新型PHA合酶PhaC在合成PHA 中的应用。

本发明所提供的PHA合酶PhaC，来源于土壤中甲基杆菌属 (Methylobacterium sp.在中国北纳菌种保藏中心的资源编号为： BNCC195932)，从中扩增出的PHA合酶PhaC编码基因(命名为phaC)， 具有下述核苷酸序列特征之一：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA) 序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到 80％及以上，且能编码PHA合酶活性蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序 列。

4)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或 几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有PHA合酶活性的核 苷酸序列。

本发明还提供了PHA合酶PhaC的氨基酸序列，具有如下特征之 一：

1)序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-607为具有活性 PhaC的氨基酸序列，607-613为His-Tag的氨基酸序列。

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-607位氨基酸 残基进行一个或多个氨基酸取代、缺失或添加而形成具有PHA合酶 活性不变的氨基酸序列。

本发明的PHA合酶PhaC的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可 以根据预测的PhaC的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获 得。

制备重组酶PhaC的方法，是将编码基因phaC克隆入重组表达 载体，导入宿主细胞，获得重组表达的PHA合酶。

所述的重组表达PHA合酶PhaC的表达载体可以是大肠杆菌表达 载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌 表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表 达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达PHA合酶PhaC的重组菌或转基因细胞系，可以是 大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、 Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis等)、枯草杆菌宿主 细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920等)、乳酸菌宿主 细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如 Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichoderma viride， Trichoderma reesei，Aspergillus niger、Aspergillus nidulans等)、昆虫 细胞(如Bombyx mori，Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如 中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞 CHL等)。

本发明的PHA合酶PhaC的基因序列是通过PCR技术从甲基杆菌 属(Methylobacterium sp.)中克隆得到。该基因编码区长1824bp， 属于PhaC-N超家族。

本发明从大肠杆菌重组表达获得的PHA合酶PhaC，以R-3-羟基 丁酰辅酶A为底物时，在28℃、pH8.1的条件下测得比活为0.5-1000 U/mg。

本发明的PHA合酶PhaC可广泛应用农业、食品包装材料、医药 及环保等领域。

图1：基因phaC琼脂糖凝胶电泳检测。

图2：PhaC纯化的SDS-PAGE图。各泳道加入的样品分别是：泳 道1-预染蛋白分子量标准；泳道5-PhaC纯化蛋白。

图3：气相检测PHB。

实施例1 PHA合酶全长基因克隆

参照基因组DNA纯化试剂盒(Thermo公司)操作步骤提取 Methylobacterium sp.(Methylobacterium sp.在中国北纳菌种保藏中 心的资源编号为：BNCC195932)的基因组DNA。对The National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中硫解基因序列进行多 序列比对分析后，设计引物PhaC-F:5’ ATATATCCATGGCCACGGAGCGGACGGGCCCGGCA-3’；PhaC-R:5’- CGCTGACTCGAGCGCCTTCATGCGCACATAGGTGCCCG-3’，以提取的sp. 的基因组DNA为模板，扩增编码PHA合酶成熟蛋白的基因序列(不包 括信号肽基因)。PCR反应条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s， 55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃3min，1个循环。PCR产物 进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的片段进行切胶回收， 经双酶切的方法连接到原核表达载体pET28a上后测序。

实施例2 PHA合酶基因序列分析

测序的结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，Vector NTI Suite 8.0软件进行多序列比对， 分析序列信息。

获得的PHA合酶基因(命名为PhaC)编码区长1824bp，其核苷 酸序列如SEQ ID NO 1所示。phaC基因编码607个氨基酸和一个终止 密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质理论分子量为 67278.6，等电点为5.98，带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)有71个， 带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)有64个，酸性氨基酸有71个，占 11.7％，碱性氨基酸有64个，占10.54％，极性氨基酸有134个，占 22.08％，疏水性氨基酸有226个，占37.23％，分子式为 C3019H4686N824O882S20，在体外的半衰期为30个小时，不稳定性指数为 40.39，属于不稳定蛋白。

序列表

(1)SEQ ID No.1的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：1842碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Methylobacterium sp.菌株。

SEQ ID NO.1

ATGGCCACGGAGCGGACGGGCCCGGCAGCACCGGATTTCGAG ACCATCGCGCGCAACGCGAATCAACTGGCGGAGGCGTTCCGGC AATCGGCGGCGGCCTCGCTCAAGCCGTTCGACCCGGCGGGGCA GGGGACCGGTCTGCCGACCGCCAAGCTCCAGGGCTCCGACGA GATCGACGAGATGACCCGCACGCTGACGCGGGTCGCCGAGACA TGGTTGAAGGATCCCGAGAAGGCGCTCCAGGCCCAGACCAAG CTCACACACTCCTTCGCCGCGCTGTGGGCCTCGACCCTGACCC GGATGCACGGCGCTCCCGCCACGCCGATCGTCGAGCCCGAGGC CAAGGACAAGCGCTTCGCCCACGCCGATTGGAGCGCCAACCCG GTCTTCGACCTGATCAAGCAGAGCTACCTCATCCTCGGCCGCTG GGCGGAGGAGATGGTCGAGACGGCCGACGGCATCGACGAGCA CACCCGCCACAAGGCCGAGTTCTATCTGCGCCAGCTCCTCTCGG CCTACTCGCCCTCGAACTTCGTGATGACGAACCCCGAGCTCCTG CGCCAGACGCTGGAGGAGGGCGGCGCCAACCTGATGCGCGGC ATGAAGATGCTGCAGGAGGATTTGGAGGCCGGCGGCGGACAGC TCCGCGTCCGCCAGACCGACCTGAACGCCTTCACCTTCGGCCA GGACGTGGCGGTGACCCCCGGCGAGGTCATCTTCCGCAACGAC CTGATGGAGCTGATCCAGTATGCGCCCACGACCGAGACGGTGC TGAAGCGTCCGTTGCTGATCGTGCCGCCCTGGATCAACAAGTAC TACATTCTCGACCTCAACCCGACGAAGAGCCTCATCGGCTGGAT GGTCTCTCAAGGCATCACGGTGTTCGTGATTTCCTGGGTCAATC CGGACGAGCGCCACCGGGACAAGGACTTCGAGTCCTACATGCG CGAGGGCATCGAGACGGCGATCGACATGATCGGCGTCGCCACC GGCGAGACCGACGTGGCGGCGGCGGGCTACTGCGTCGGCGGC ACCCTGCTCGCCGTGACGCTGGCCTACCAGGCGGCCACCGGCA ATCGGCGGATCAAGAGCGCGACGTTCCTCACCACGCAGGTCGA CTTCACCCATGCGGGCGACCTCAAAGTCTTCGCCGACGAGAGT CAGATCAAGGCGATCGAGGAGCGGATGGCCGAGCGCGGCTACT TGGAGGGCGCGCGCATGGCCAACGCCTTCAACATGCTCAGGCC CAACGACCTGATTTGGTCCTACGTCGTCAACAACTATGTGCGCG GCAAGCCGCCGGCGGCCTTCGACCTGCTCTACTGGAACGCCGA CGCCACCCGGATGCCGGCGGCCAACCACTCGTTCTACCTGCGC AACTGCTACCTCAACAACACGCTCTCCAAGGGGCAGATGGTGC TCGGCAACGTGCGCCTCGACCTGAAGAAGGTGAAGGTGCCCGT GTTCAACCTCGCCACCCGCGAGGATCACATCGCGCCTGCGCTCT CCGTGTTCGAGGGGTCGGCGAAGTTCGGTGGCAAGGTCGATTA CGTGCTGGCGGGCTCGGGCCACATCGCGGGCGTCGTCGCTCCC CCCGGCCCCAAGGCGAAGTACGGCTTCCGCACCGGGGGGCCG GCCAGGGGCCGGTTCGAGGACTGGATCGAGAAATCGACCGAG CATCCCGGCTCGTGGTGGCCCTACTGGTTTCAATGGCTGGAGGA GCAGGCGCCCGAGCGCGTGCCGGCGCGTATTCCCGGAACGGGA GCGCTGCCCTCGCTCGCACCGGCACCGGGCACCTATGTGCGCAT GAAGGCGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

*长度：613氨基酸残基

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白

SEQ ID NO.2

MATERTGPAAPDFETIARNANQLAEAFRQSAAASLKPFDPAGQGTGLPTAKLQGS DEIDEMTRTLTRVAETWLKDPEKALQAQTKLTHSFAALWASTLTRMHGAPATPIVE PEAKDKRFAHADWSANPVFDLIKQSYLILGRWAEEMVETADGIDEHTRHKAEFYL RQLLSAYSPSNFVMTNPELLRQTLEEGGANLMRGMKMLQEDLEAGGGQLRVRQ TDLNAFTFGQDVAVTPGEVIFRNDLMELIQYAPTTETVLKRPLLIVPPWINKYYILD LNPTKSLIGWMVSQGITVFVISWVNPDERHRDKDFESYMREGIETAIDMIGVATG ETDVAAAGYCVGGTLLAVTLAYQAATGNRRIKSATFLTTQVDFTHAGDLKVFADES QIKAIEERMAERGYLEGARMANAFNMLRPNDLIWSYVVNNYVRGKPPAAFDLLY WNADATRMPAANHSFYLRNCYLNNTLSKGQMVLGNVRLDLKKVKVPVFNLATR EDHIAPALSVFEGSAKFGGKVDYVLAGSGHIAGVVAPPGPKAKYGFRTGGPARGR FEDWIEKSTEHPGSWWPYWFQWLEEQAPERVPARIPGTGALPSLAPAPGTYVR MKALEHHHHHH

实施例3 PhaC基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化

为了便于基因的重组表达，在设计的实施例1的上下游引物中分 别引入NcoI和XhoI酶切位点。PCR扩增产物和表达载体pET28a分别 用NcoI和XhoI进行双酶切，酶切产物经电泳分离和凝胶回收后，将 经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切的pET28a载体用T4DNA连 接酶连接。将连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含50 μg/mL氨苄青霉素的固体Luria-Bertani培养基上，37℃培养12-16h。 将单克隆接入含有50μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中 培养，提取质粒；使用内切酶NcoI和XhoI对提取的质粒进行双酶切， 在电泳检测，片段大小正确的重组质粒送华大基因测序，结果表明， 在pET28a的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO 1所示的 phaC基因，且插入方向正确，证明构建的重组质粒正确，将该重组 质粒命名为pET28a-PhaC。

将pET28a-PhaC转化E.coli BL21(DE3)，在液体LB培养液中培养， 当OD值达到0.4-0.6时加入0.01mm的IPTG诱导表达三个小时，将 菌液离心，超声破碎细胞，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PHA合酶 PhaC的表达及纯化情况，结果如图2所示，纯化后的PHA合酶PhaC 在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例4 PHA合酶PhaC的酶活测定

(1)测定蛋白的浓度(BCA试剂盒法)

a.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1) 配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

b.完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为 0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但 是为了简便起见，也可以用0.9％NaCl或PBS稀释标准品。

c.将标准品按(可根据实际蛋白的含量确定减少前面或者后面 两个点)0,1,2,4,8,12,16,20μl(分别代表的蛋白含量为：0、0.5、 1、2、4、6、8、10ug蛋白)加到96孔板的标准品孔中，加用于稀 释标准品的溶液补足到20μl。

d.取5、10、15μl样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准 品的溶液到20μl。

e.各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟。

f.测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

(2)PHA合酶PhaC活力的测定

a、配制20mM Tris-HCl、0.5mM MgCl2的缓冲液：秤取Tris 0.2422g， MgCl2·6H2O 0.0102g溶于100mL水中，调pH值到7.5，灭菌。

b、配制100mM Tris-HCl、0.5mM MgCl2的缓冲液：秤取Tris 1.211g， MgCl2·6H2O 0.0102g溶于100mL水中，调pH值到7.5，灭菌。

c、配制10mM的DTNB母液：准确称取0.1982g DTNB，用上述灭过 菌100mM Tris-HCl缓冲液)配制成50ml溶液暗处-20℃避光保存。

d、配制3mM的β-hydroxybutyryl-coenzyme A(CoA)(3-HBCoA)和 5mg/mL的BSA母液：秤取3-HBCoA 2.561mg，BSA蛋白5mg溶于1mL 20mM Tris-HCl缓冲液中。

e、配制5％(wt/vol)trichloroacetic acid(三)：取50mg溶于 1mL 20mM Tris-HCl。

f、配制1mM的CoA母液：秤取CoA1.5351mgCoA溶于2mL 100mM Tris-HCl缓冲液中。

g、测定酶活：取4uL 3mM的3-HBCoA，16uL 20mM Tris-HCl、0.5mM MgCl2的缓冲液混合，在30℃的水浴中水浴2min，加入5uL的酶液， 在28度培养箱放置5min(看酶活情况，可适当的改变水浴时间)，再 加入25uL的三溶液，混合液在4℃12000g离心10min。取 上清33.33uL，1mM的DTNB(用100mM Tris-HCl将10mM的DTNB 母液稀释10倍)166.67uL，28度培养箱放置5min，在412nm处测 定吸收值。

h、制作标准曲线：取各个溶液体积如下(uL)

在室温放置5min，在412nm处测定吸收值。

i、根据标准曲线，计算出酶活。按该方法测得PhaC酶的比活为 0.5-1000U/mg。

实施例5 该酶PhaC与PhaB、PhaA一起在大肠杆菌中构建PHA 代谢途径

(1)、在该酶的基因序列和PhaB、PhaA的基因序列上链接上NcoI 和XhoI酶切位。

(2)、用这两个内切酶将三个基因片段切掉以后，再用T4DNA连 接酶将三个基因序列连接到表达载体pET28a上面，转入大肠杆菌中。

(3)、用LB培养液培养该大肠杆菌3天以产PHA。

(4)、将菌体离心冻干。

(5)、气相谱检测PHA的含量，检测到的PHA含量为菌体干重 的10％-90％，如图：3。