一种具有解纤维素作用的南海芽孢杆菌及其应用

本发明涉及生物领域，具体涉及一种具有解纤维素作用的南海芽孢杆菌及其应用。

纤维素是植物的主要组成部分，含量可达到40％以上，也是世界上最丰富的再生资源。每年全球秸秆作物达到29亿吨，大多秸秆作物的处理方式是直接焚烧，不但造成严重的环境污染，而且严重浪费资源(冯海玮等，2013)。如果可以将纤维素有效地转化利用，不仅可以从根源上解决焚烧农作物秸秆所产生的环境污染问题，而且可以将其能量转化为能源为人类利用。由于纤维素属于含有大量高能氢键的高分子化合物，并且难降解、难水解，所以现纤维素的资源化利用程度较低(杨升等，2012)。纤维素的处理方法有物理、化学和生物3种处理方法。物理方法需要消耗大量能量，化学方法易造成环境污染，而生物方法是利用微生物产生的解纤维素酶来分解纤维素。生物方法处理纤维素安全无污染，是众多科学家研究的一个重点方向(穆春雷，2013)。

目前，自然界中可以产生解纤维素酶的微生物主要分为细菌、真菌和放线菌。目前研究较多的是木霉属的真菌，其中纤维素酶活力较强的是木霉、曲霉、根霉和青霉，其中里氏木霉、绿木霉、康氏木霉是典型代表。细菌中产生纤维素酶活力较高的菌种有纤维杆菌属、生孢纤维粘菌属和梭菌属。放线菌中产生纤维素酶活力较高的菌种有黑红旋丝放线菌、玫瑰放线菌和纤维放线菌等(庞良伟， 2003)。有研究表明，细菌的解纤维素酶主要分泌在胞内，真菌和放线菌主要在胞外产生解纤维素酶。目前，人们主要研究方向是寻可以产生高效解纤维素酶的菌种，并且优化其产酶条件。有的学者对微生物菌株进行基因诱变，通过特定的筛选方式，培养出产高效解纤维素酶的菌种，并且取得巨大成功(张超，2006)。还有学者通过人为改变土壤的肥沃程度，从而提高土壤中解纤维素菌的产酶效率，这对农业生产与环境保护都产生了巨大作用(吕宗浩，2016)。但目前仍缺乏高效降解纤维素的菌株。所以纤维素的高效利用是作为废弃物资源化研究的一个重要方向。

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种具有解纤维素作用的南海芽孢杆菌及其应用。

本发明的第一个方面是提供一种南海芽孢杆菌，所述南海芽孢杆菌为南海芽孢杆菌XJC-YS-26(Fictibacillus nanhaiensis XJC-YS-26)，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.19591。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的南海芽孢杆菌的发酵液或发酵液的过滤液。

优选地，发酵时pH值为3-9，更优选为6.0-7.0。

优选地，发酵时温度为30-55℃，更优选为35℃。

本发明的第三个方面是提供一种纤维素降解酶制剂，其含有本发明第一个方面所述南海芽孢杆菌的发酵液或发酵液的过滤液。

优选地，发酵时pH值为3-9，更优选为6.0-7.0。

优选地，发酵时温度为30-55℃，更优选为35℃。

其中，所述纤维素降解酶制剂含有外葡聚糖酶、和/或内葡聚糖酶、和/或β- 葡萄糖苷酶、和/或滤纸纤维素酶、和/或α-淀粉酶、和/或木聚糖酶、和/或果胶酶、和/或蛋白酶。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的南海芽孢杆菌、或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的过滤液、或者本发明第三个方面所述的纤维素降解酶制剂在降解纤维素中的应用。

本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的南海芽孢杆菌、或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的过滤液、或者本发明第三个方面所述的纤维素降解酶制剂在降解淀粉中的应用。

本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的南海芽孢杆菌、或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的过滤液、或者本发明第三个方面所述的纤维素降解酶制剂在降解蛋白质中的应用。

本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的南海芽孢杆菌、或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的过滤液在制备含有外葡聚糖酶、和/ 或内葡聚糖酶、和/或β-葡萄糖苷酶、和/或滤纸纤维素酶、和/或α-淀粉酶、和/ 或木聚糖酶、和/或果胶酶、和/或蛋白酶的制剂中的应用。

本发明的南海芽孢杆菌为革兰阴性，16S rRNA基因序列的研究表明，菌株 XJC-YS-26和Fictibacillus halophilus|AS8|KP265300(相似性99.58％), Fictibacillusnanhaiensis|JSM 082006|GU477780(相似性99.86％)和 Fictibacillusphosphorivorans|Ca7T|JX258924(相似性99.17％)序列在同一节点进行聚集，并且具有较近的遗传距离，表明这些序列为同一个属的，与此同时和其他属遗传距离则较远，进化树所得出的结果与序列比对的种属关系所得出的结果相一致，并将生理生化等方面与其模式菌进行对比后，可将XJC-YS-26鉴定为南海芽孢杆菌(Fictibacillus nanhaiensis)。

本发明的南海芽孢杆菌XJC-YS-26具有良好地产内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等酶活性，能有效降解纤维素和半纤维素，并且还具有产α-淀粉酶、木聚糖酶、果胶酶和蛋白酶等酶活性，能降解淀粉和蛋白质，对于农作物秸秆等具有高效降解功能，可使农作物秸秆等快速腐解，释放养分，为环境中的其他微生物提供营养，改善突然微生态，避免环境污染，在废弃物资源化利用中具有很高的实用价值。

图1为菌株C、XJC-YS-26、4-Z-7、5-Z-8初筛时透明圈结果。

图2为电镜观察下菌株XJC-YS-26的形态特征结果。

图3为菌株XJC-YS-26系统发育树。

图4为菌株XJC-YS-26产酶活性检测结果。

图5为菌株XJC-YS-26在不同培养条件下产酶活性检测结果。

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明提供了一种南海芽孢杆菌，所述南海芽孢杆菌为南海芽孢杆菌 XJC-YS-26(Fictibacillus nanhaiensis XJC-YS-26)，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.19591，保藏日期为2020年04 月20日，保藏地址：中国北京。本发明的南海芽孢杆菌XJC-YS-26从海永新岛软珊瑚中分离、筛选得到。

1实验材料

1.1样品采集

软珊瑚样品采自海南省南海永新岛(112°20′22"E,16°49′53"N)，采样深度 15-20m，共采集软珊瑚样品7份，分别放入无菌封口袋中混匀、封口、编号，装入冰盒内保存后，送至实验室进行共附生菌的分离。

1.2主要试剂

(1)DNS试剂：称量3,5-二硝基水杨酸10g溶于500ml蒸馏水中，加入 20g氢氧化钠、200g酒石酸钾钠，将溶液加热溶解后加入2g苯酚和0.5g无水亚硫酸钠，待溶质溶解后冷却至室温，定容至1000ml。试剂保存于棕容量瓶中，放置一周后过滤使用。

(2)醋酸钠缓冲溶液：称取16.4g醋酸钠溶于1000ml蒸馏水中，形成PH4.6 的0.2mol/L的缓冲液。

(3)CMC底物溶液：称取0.625g羧甲基纤维素钠盐溶于100ml醋酸钠缓冲溶液，加热搅拌直至溶解。

(4)微晶纤维素底物溶液：称取0.5g微晶纤维素溶于100ml醋酸钠缓冲溶液中。

(5)滤纸底物溶液：称取0.5g的滤纸浸于100ml的醋酸钠缓冲溶液中。

(6)氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠溶于50ml蒸馏水中，配置2mol/L 的氢氧化钠溶液。

(7)标准葡萄糖溶液：将27.0g葡萄糖溶于25ml蒸馏水中，配置6mol/L 的葡萄糖溶液。根据表1配置葡萄糖溶液标准曲线。

表1标准葡萄糖溶液

1.3主要培养基

本实验所用主要培养基配方，如表2所示。

表2主要培养基及其配方

1.4主要仪器

本实验所用主要仪器设备，如表3所示。

表3设备仪器及产品信息

2实验方法与结果

2.1解纤维素菌的初筛

软珊瑚中分离到的60株细菌样品，用点接法在纤维素刚果红培养基上点2 个点的细菌样品，一个培养基上可以接种两个菌株样品。30℃恒温培养7d后，观察培养基的菌落周围是否产生透明圈。产生透明圈的菌种说明可以产生解纤维素酶。采用透明圈法对120株菌株进行初筛，得到14株产生透明圈的菌株。

纤维素刚果红培养基可以筛选纤维素酶的作用机理是刚果红可以和纤维素的多糖作用产生鲜艳红的多聚糖-刚果红复合物，当纤维素的多糖被菌株产生的纤维素酶分解成葡萄糖时，刚果红会从多聚糖-刚果红复合物中脱落，从而产生透明圈。当酶活性较大时，会分解较多纤维素的多糖，则会产生较大的透明圈。所以透明圈的大小可以初步判断纤维素酶活性的大小。

2.2解纤维素菌的复筛

将初筛的具有透明圈的菌株样品再次用点接法在纤维素刚果红培养基上点 4个点的细菌样品。30℃恒温培养5d后，观察并测量平板上4个透明圈直径(D) 和菌落直径(d)，求两者的比值，取其平均值，并且计算D/d比值(见表4)。比值的大小可以初步反映菌株产生纤维素酶的活力大小。由表4可知，菌株C、 XJC-YS-26、4-Z-7、5-Z-8的D/d比值排列在前四位，比值分别为5.39、5.38、 4.86、4.86。故可初步判断这4株菌株的纤维素酶活力最强。故此选取XJC-YS-26 菌株进行鉴定及后续实验。

表4透明圈法测量菌株纤维素酶活力

2.3菌株分类鉴定

(1)革兰氏染

经电子显微镜可观察到，菌株XJC-YS-26在30℃细菌基础培养基上生长良好(图2)，经过结晶紫法检测可知，菌株XJC-YS-26属于革兰氏阴性菌。

(2)菌株生理生化分析

参照《常见细菌系统鉴定手册》测定(东秀珠等，2001)。

对XJC-YS-26菌株进行生理生化分析(见表5)。菌株XJC-YS-26可以利用的碳源有肌醇、木聚糖、麦芽糖、甘露糖、松三糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、D-半乳糖、无水乳糖、山梨糖、α-乳糖、鼠李糖、蜜二糖、D-果糖、D- 甘露糖，不可以利用的碳源有可溶性淀粉；可以利用的氮源有天门冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、四水合钼酸铵、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、草酸铵、甘氨酸，不可以利用的氮源有氯化铵、硝酸铵、氨酸、硫酸铵、乙酸铵；可以使硝酸盐还原，可以产生尿素酶，V-P反应呈现阳性，不能产生硫化氢、尿素酶、脂酶，MR反应呈现阴性；菌株XJC-YS-26适宜生长的pH范围在6.0～9.0，耐盐性在11％以下。

表5菌株生理生化指标

“+”代表实验结果为阳性；“－”代表实验结果为阴性。

(3)16S rDNA序列分析

选择细菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′) 和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)建立PCR扩增体系进行扩增，如表6。产物纯化后测定基因序列，将菌株的序列分别在GeneBank和 EzBioCloud数据库中进行同源性的比对，应用MEGA7..软件的相关功能构建邻接距离矩阵法系统发育关系进化树(图3)。菌株XJC-YS-26和Fictibacillus halophilus|AS8|KP265300(相似性99.58％)，Fictibacillusnanhaiensis|JSM 082006|GU477780(相似性99.86％)和Fictibacillus phosphorivorans|Ca7T|JX258924(相似性99.17％)序列在同一节点进行聚集，并且具有较近的遗传距离，表明这些序列为同一个属的，与此同时和其他属遗传距离则较远，进化树所得出的结果与序列比对的种属关系所得出的结果相一致，并将生理生化等方面与其模式菌进行对比后，可将XJC-YS-26鉴定为南海芽孢杆菌(Fictibacillus nanhaiensis)。

表6PCR反应条件

2.4纤维素酶活性及其他水解酶活性测定

从复筛的D/d比值中，选取比值最大的XJC-YS-26株菌株进行纤维素酶活性的测定。在复筛培养基上接种4株菌种，使用摇床在150r/min转速、温度为 30℃的条件下进行震荡培养5d，使用DNS法测定各菌株的纤维素酶活性及其他酶活性(王琳，1998)。

(1)纤维素酶活性测定

将新鲜培养的菌株XJC-YS-26悬浮液(2mL 108CFU mL-1)接种到含有 100mL CMC液体培养基的250mL烧瓶中，在30℃下振荡(150rpm)培养5 天。发酵液在4℃下以10000转/分离心5分钟，上清液用作酶提取液。通过测定微晶纤维素(MCC)、羧甲基纤维素(CMC)和水杨酸(SAL)的还原糖释放量，测定了三种胞外纤维素酶(外葡聚糖酶、内葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶)的活性。总纤维素酶活性用滤纸纤维素酶活性(FPA)表示，用Ghose(1987) 所述的滤纸分析法测定，以Whatman 1号滤纸为底物。根据540nm处的二硝基水杨酸(DNS)方法测定纤维素酶活性(Miller，1959；Kaschuk和Frolilini， 2018)，并按照Desta等人的程序进行单糖分析(2016年)。用不同浓度的D- 葡萄糖溶液作校正曲线。所有样品在540nm处用紫外可见分光光度计 (PGENERAL T6；China)测量。酶活性的单位(U)定义为每毫升发酵上清液每分钟释放1μmol(β-葡萄糖苷酶为2μmol)还原糖(以葡萄糖计)的酶量。

结果如图4a所示，培养5d后，外葡聚糖酶活力为8.07IU/mL，内葡聚糖酶活力为3.68IU/mL，β-葡萄糖苷酶活力为2.46IU/mL，滤纸纤维素酶活力为 31.51IU/mL，表明XJC-YS-26菌株具有良好地产内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等酶活性，说明该菌株能有效降解纤维素和半纤维素。

(2)α-淀粉酶、木聚糖酶和果胶酶活性测定

根据Salim等人的研究，测定了α-淀粉酶的活性(2017)，添加0.5毫升1％可溶性淀粉和0.5毫升酶提取液。根据Bhalla等人测定木聚糖酶活性(2014年)，添加0.5毫升1％燕麦木聚糖和0.5毫升酶提取液。果胶酶活性根据Salim等进行(2017)，添加0.5毫升1％果胶(苹果果胶)和0.5毫升酶提取液。将混合物在37℃下孵育30分钟。根据先前描述的DNS方法测量酶活性。为了消除反应颜与酶提取液颜之间的干扰，通过减去酶对照组和底物对照组的吸光度和来计算δ吸光度。a-淀粉酶、木聚糖酶和果胶酶活性的单位(IU)定义为在分析条件下每分钟释放1μmol还原糖。

结果如图4a所示，培养5d后，α-淀粉酶活性54.23IU/mL显著高于其它酶 (p＜0.5)，木聚糖酶活力为25.51IU/mL，果胶酶活性为21.87IU/mL，表明 XJC-YS-26菌株具产有α-淀粉酶、木聚糖酶和果胶酶等酶活性，说明该菌株不仅能有效降解纤维素和半纤维素，还能降解淀粉。

(3)蛋白酶活性测定

根据Sarath等人描述的方法，以偶氮酪蛋白为底物测定蛋白水解活性。 (1989年)。将75μL的酶样品与125μL的2％偶氮酪蛋白溶液(溶于Tris-HCl 缓冲液中；50mM，pH9.0)混合，在37℃下孵育30min，然后向样品中加入 600μL的10％TCA溶液。在冰浴中冷却后，样品以10000rpm离心10分钟， 600μL上清液与700μL 1M NaOH混合。对于每个样品，分别制备空白反应(零时间混合物的值)。蛋白质水解活性的一个单位被定义为在440nm处，反应空白和样品在分析条件下产生单一吸光度差异的酶的数量。

结果如图4a所示，培养5d后，蛋白酶活力为24.36IU/mL，表明XJC-YS-26 菌株具有产蛋白酶等酶活性，说明该菌株不仅能有效降解纤维素和半纤维素，还能降解淀粉和蛋白质。

2.5固态发酵的酶活性

以豆粕、玉米麸、小麦麸、椰子麸和燕麦片为底物，进行了固态发酵。未经处理的基质在烘箱中干燥24小时(60℃)，研磨并筛分以获得基质。固态发酵在含有5g干底物的150ml锥形烧瓶中进行，在121℃蒸压20分钟。用无菌蒸馏水调节水分含量，将48h的老株XJC-YS-26悬浮液(0.5ml108cfuml-1)接种到底物中。在30℃下发酵3天。然后，用蒸馏水以5:1(V/V)的比例提取酶，在30℃下摇动(150转/分)混合1小时，然后在8000转/分钟离心10分钟(4℃)。收集上清液作为酶提取物，然后评估分泌纤维素酶、α-淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶和果胶酶的活性。以豆粕为底物，采用一元一次法对工艺参数进行评价。

结果如图4b、4c、4d所示，在豆粕和香蕉秸秆上培养芽孢杆菌XJC-YS-26，其胞外葡聚糖酶活性分别为9.96IU/g和8.97IU/g，内切葡聚糖酶活性分别为 4.24IU/g和3.11IU/g时，其纤维素酶、蛋白水解酶和果胶水解酶活性均达到最高水平，图4b和图4d显示β-葡萄糖苷酶活性分别为3.07IU/g和2.56IU/g，蛋白酶活性分别为24.92IU/g和19.35IU/g，果胶酶活性分别为21.37IU/g和 17.45IU/g。此外，在豆粕和麦麸上培养芽孢杆菌XJC-YS-26可获得较高的直链淀粉分解活性，α-淀粉酶活分别为57.28IU/g和40.41IU/g，芽孢杆菌XJC-YS-26 促进了麦麸上木聚糖酶的产生，木聚糖酶活为26.74IU/g(图4c)。

3.6运行条件的影响

为了获得芽孢杆菌XJC-YS-26的最适纤维素酶解活性条件，在“2.5固态发酵的酶活性”的基础上，在250ml的锥形烧瓶中进行了进一步的纤维素酶解活性试验，其pH值范围为3.0-9.0，温度范围为15-45℃。结果表明，最适pH 值(图5a)为6.0-7.0，理想温度(图5b)为35℃。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

参考文献

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