一株产油单针藻及其培养应用

一株产油单针藻及其培养应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一株产油单针藻及其培养应用。

背景技术

随着社会的快速发展，化石能源日益短缺，环境污染日趋严重，能源问题成为了制约整个人类社会发展的关键，寻一种清洁、经济、高效、可再生的新能源成为了当前急需解决的问题，世界正逐步走向“后石油时代”。

生物质是一种可持续、可再生、低成本，且可代替化石燃料的新能源。微藻，作为一种水生生物质资源，具有光合作用效率高、生长速率快、生物质产量高、环境适应能力强等优点，有综合利用价值，可用于生产生物质能源，包括生物柴油，生物燃料乙醇等，且不与粮争地，不与人争粮，可作为生物燃料原料，并具有较好的发展前景。开发微藻生物能源，具有多重效果，既可减少化石燃料的使用、减少CO₂的排放又可净化废气和污水。

微藻在光合作用自养的过程中，细胞内可积累油脂、淀粉、糖原等成分，某些藻类中淀粉和糖原含量占细胞干重的30%，也有一些藻类在特定培养条件下油脂含量可高达80%。如何有效的筛选获得具有高油脂或高淀粉含量、环境适应能力强、可规模化培养且成本较低的新藻种，便成了各国工作者研究的重点。

杨勋等（富油微藻Monoraphidium sp.的分离及其油脂提取工艺研究，安徽农业科学，2011年第32期）采用尼罗红荧光染料对分离自海南淡水水体的微藻进行初筛，得到油脂含量较高的Monoraphidium sp.，采用Bligh-Dyer超声法提取该微藻的油脂，并通过正交试验优化微藻油脂提取的工艺条件为：溶剂氯仿、甲醇和水的比例为10:10:9，超声功率600W、提取温度50℃、提取时间30 min。在该条件下出油率为22.95%。

CN103540533A公开了一种产油单针藻LB59的获得及应用，自野外环境分离获得，能够耐受高浓度碳酸氢钠并以其为碳源，培养温度30-35℃，油脂含量可达到细胞干重的30.2%。CN103555584A公开了一种产油单针藻LB50的获得及应用，能够耐受高浓度碳酸氢钠并以其为碳源，培养温度25-30℃，油脂含量可达到细胞干重的30.4%。CN104073437A公开了一种单针藻C29，开放式培养的温度为16-40℃，作为优选，开放式培养的温度为28℃。CN104611228A公开了一种富含油脂的单针藻（Monoraphidium sp.）SS-B1及其培养应用，该藻株可以利用含CO₂和SO₂的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，培养温度为15-40℃，优选25-28℃，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。

但是，上述分离筛选出来的微藻，有的不能利用CO₂进行自养生长，有的耐低温性能差，在低温条件下（低于15℃），生长速度缓慢，有的甚至死亡。在冬天寒冷的天气下，需要进行加热培养，能耗较高。

发明内容

针对现有产油微藻的不足，本发明提供了一株产油单针藻及其培养应用。该藻株在自养条件可以高效生长，获得富含油脂的生物质；而且环境适应能力强，在低温下仍能保持较快的生长，油脂含量高，可用于生物柴油的生产。

本发明提供的产油单针藻SHJ-02，其分类命名为单针藻(Monoraphidium sp.) ，已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10763。

本发明提供的单针藻SHJ-02在显微镜下单个藻细胞呈梭形，长轴28-32μm，短轴4-6μm。

本发明提供的单针藻SHJ-02的18S rDNA基因测序分析结果见序列表。

本发明所述单针藻SHJ-02的培养方法，包括如下步骤：

（1）配制BG11淡水微藻培养基，分装，灭菌；

（2）从固体平板上挑选单藻落接种到上述培养基中，培养至指数生长期；

（3）将步骤（2）培养的藻液转接至装有BG11培养基的管式光反应器中，通气培养，通气量为0.5-3vvm（每分钟通气量/培养液体积），CO₂含量为0.5%-3%（v/v），温度为5-33℃。

本发明步骤（1）中，将配制好的BG11培养基分装在50-250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为20-100mL，用透气膜封口，包上牛皮纸进行灭菌，在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20-30min。

本发明步骤（2）中，接种操作在无菌间进行，接种后将培养液摇匀，用透气膜包好，在5-33℃的恒温光照反应摇床中进行，光照强度为1000-10000Lux，光暗反应周期为24h，光暗时间比为14:10，摇床转速为80-160rpm，培养至指数生长期。

本发明步骤（3）中，在管式光反应器中，优选温度为10-25℃，通气量为0.75-1.5vvm，CO₂含量为1.5%-2.5%。在光照强度1000-10000Lux，光暗反应周期为24h，光暗比为10:14-14:10，pH值为6-9，培养至进入稳定期，结束培养，收获藻细胞。

本发明的单针藻SHJ-02在生产微藻油脂中的应用。该单针藻藻株耐低温能力强，在低温5-15℃下仍能保持较快的生长，油脂含量高，所占细胞干重可达40%以上，能够进行生物柴油的生产。

与现有单针藻相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明筛选得到的单针藻，在自养条件可高效生长，耐低温能力强，即使在5-15℃下，仍能保持较快的生长速率，胞体内油脂含量高。

2、该藻株所得产品的经济性高，在普通培养条件下，温度10-25℃下，经过14-18天培养后，藻干重比（每升培养液中藻的干重）可达6.3g/L；藻体内的油脂含量也相对较高，所占细胞干重最高可达55.6%，可作生物柴油的部分原料。

生物材料保藏说明

本发明提供的单针藻（Monoraphidium sp.）SHJ-02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 10763；保藏日期：2015年4月24日。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但不因此造成对本发明的限制。

实施例1 分离筛选获得单针藻SHJ-02

（1）富集培养：2011年10月从黑龙江松花江采集水样，纱布过滤，除去大的固形物；将80mL过滤后的水样接种到200mL的BG11培养基中，富集培养，培养的光照强度为8000Lux，温度为25℃，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10，培养半个月后，培养基呈现明显绿，显微镜观察到大量藻体存在。所述BG11培养基的配方见表1、表2。

表1 BG11培养基

*表2 表1中A5+Co solution的组成

（2）纯藻株的获得：将富集培养的水样稀释至10^-5倍，在无菌条件下，涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为8000Lux，温度为25℃，培养约13天后平板上出现绿的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养10天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得单藻落。

（3）目的藻株的获得：将获得的单藻落接种到50mL摇瓶中进行继续培养，培养光照强度为8000Lux，温度为25℃，光暗周期为24小时，光暗时间比为14:10，每天摇动至少3次，至对数生长期，以5%的接种量接种到管式光照反应器中，培养光照强度为8000Lux，通入CO₂ 3%（v/v），连续光照，控制培养温度从25℃逐级降低至5℃，每次降温2℃，反复驯化培养3次。驯化完后，取部分液体在BG11平板上进行划线，从而获得目标藻株SHJ-02。

实施例2 藻株的鉴定

将获得SHJ-02藻细胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18S rDNA基因测序分析结果见序列表。将18S rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Monoraphidium sp.有最大的相似性，其BLASTn值为2619，Max index值为99%，可以确定SHJ-02为单针藻（Monoraphidium sp.）。

实施例3 单针藻SHJ-02的培养应用

（1）根据表1、表2配制BG11淡水微藻培养基，分装在250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为50mL，用透气膜封口，包上牛皮纸进行灭菌，在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20-30min。

（2）从固体平板上挑选单藻落SHJ-02接种到上述培养基中，在5-33℃的恒温光照反应摇床中进行，光照强度为8000Lux，光暗反应周期为24h，光暗时间比为14:10，摇床转速为100rpm，培养至指数生长期。

（3）将步骤（2）培养的藻液转接至装有BG11培养基的管式光反应器中，通气培养，通气量为1.0vvm，CO₂含量为2%（v/v），温度为5-30℃，光照强度8000Lux，光暗反应周期为24h，光暗比为10:14-14:10，pH值为7，培养至进入稳定期，结束培养，收获藻细胞。

将收获的藻细胞冷冻干燥后检测微藻生物量和油脂含量。在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量。采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量，具体为：称量干燥的藻粉，重量计为m，放入瓷研钵中，加入适量石英砂和液氮，待液氮挥发后，研磨破壁；加入10mL乙酸乙酯:正己烷=1:1的混合有机溶剂，超声清洗仪处理20min，50-60℃恒温水浴中提取45min；离心15min，收集上清液至离心管中，重复提取两次，合并提取液；向提取液中加入等体积的蒸馏水，震荡混匀后离心4分钟，收集上层有机相至已烘干并准确称量净重（计为W1）的试管中；70-80℃水浴蒸发试管中的溶剂1.5h（至看不到液体状溶剂），70-80℃烘箱烘干至恒重，计为W2。计算藻细胞的总脂含量C（%）：C=100×（W2-W1）/m。不同培养温度下，微藻生物量和油脂含量的培养结果如表3所示。

表3 不同温度下微藻生物量和油脂含量

由表3可见，本发明获得的单针藻SHJ-02在低温条件下也具有良好的活性，油脂含量可达55.6%。

实施例4 单针藻SHJ-02的应用

将对数生长期的单针藻SHJ-02的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表1和表2，在管式光生物反应器中培养，温度为10℃，通气量为0.75-1.5vvm，CO₂含量为1.5%-2.5%，光照强度5000-8000Lux，光暗反应周期为24h，光暗比为10:14-14:10，pH值为6-9，培养至进入稳定期，结束培养，收获藻细胞。将收获的藻细胞冷冻干燥后检测微藻生物量和油脂含量。不同培养条件下，微藻生物量和油脂含量的培养结果如表4所示。

表4不同培养条件下微藻生物量和油脂含量

由表4可见，本发明获得的单针藻SHJ-02在低温条件下，仍能保持良好的生长活性，且藻种胞内油脂含量较高，油脂含量达40%以上。

比较例1

以CN104611228A所述的单针藻SS-B1为藻种，采用与实施例4相同的培养条件，其中，选取通气量为1.0vvm，CO₂含量为2.0%，光照强度8000lux，维持培养液pH=7。实验结果发现单针藻SS-B1的生物量为1.3g/L，油脂含量为27.1%。与相同培养条件下的SHJ-02相比，该藻株在低温条件下生长不理想，油脂产量低。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国石油化工股份有限公司

中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院

<120> 一株产油单针藻及其培养应用

<130> 新专利申请

<170> PatentIn version 3.5

<211> 1418

<212> DNA

<213> Monoraphidium sp.

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa ctgcttatac 60

tgtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagttta tttgatggta cctctacacg 120

gataaccgta gtaattctag agctaatacg tgcgtaaatc ccgacttctg gaagggacgt 180

atttattaga taaaaggccg accggggctt gccccgaccc gcggtgaatc atgataactt 240

cacgaatcgc atggccttgt gccggcgatg tttcattcaa atttctgccc tatcaacttt 300

cgatggtagg atagaggcct accatggtgg taacgggtga cggaggatta gggttcgatt 360

ccggagaggg agcctgagaa acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt 420

acccaatcct gatacgggga ggtagtgaca ataaataaca ataccgggca tttaatgtct 480

ggtaattgga atgagtacaa tctaaatccc ttaacgagga tccattggag ggcaagtctg 540

gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata tttaagttgt tgcagttaaa 600

aagctcgtag ttggatttcg ggtgggttcc agcggtccgc ctatggtgag tactgctgtg 660

gccctccttt ttgccgggga cggtctcctg ggcttcactg tccgggaatc ggagtcggcg 720

atgatacttt gagtaaatta gagtgttcaa agcaagccta cgctctgaat actttagcat 780

ggaatatcgc gataggactc tggcctatct cgttggtctg taggaccgga gtaatgatta 840

agagggacag tcgggggcat tcgtatttca ttgtcagagg tgaaattctt ggatttatga 900

aagacgaact actgcgaaag catttgccaa ggatgttttc attaatcaag aacgaaagtt 960

gggggctcga agacgattag ataccgtcgt agtctcaacc ataaacgatg ccgactaggg 1020

attggaggat gttcttttga tgacttctcc agcaccttat gagaaatcaa agtttttggg 1080

ttccgggggg agtatggtcg caaggctgaa acttaaagga attgacggaa gggcaccacc 1140

aggcgtggag cctgcggctt aatttgactc aacacgggaa aacttaccag gtccagacat 1200

agtgaggatt gacagattga gagctctttc ttgattctat gggtggtggt gcatggccgt 1260

tcttagttgg tgggttgcct tgtcaggttg attccggtaa cgaacgagac ctcagcctgc 1320

taaatagtca cgttcgcttt ttgcggatgg ccgacttctt agagggacta ttggcgttta 1380

gtcaatggaa gtatgaggca ataacaggtc tgtgatgc 1418