一株芽孢杆菌W608及其在防治油菜菌核病中的应用

本发明涉及芽孢杆菌，尤其是涉及一种芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608及其在制备防治油菜菌核病发酵上清液中的应用。

长期以来化学农药一直是植物病害防治的主要方式，它对农业生产上防治病虫害起到了十分重要的作用，但长期不合理使用化学农药产生了药物残留、环境污染及病原耐药性增加等诸多问题。因此，开发对人类和环境友好、防治效果优良的植物病害防治新策略尤为重要。生物防治是利用微生物或其活性产物来防治农作物病虫害，具有安全高和防治效果好的优点，已经成为当前控制农作物病虫害的重要途径，其中活性微生物筛选是至关重要的环节。

深远海作为远离陆地，面积广阔的海域，具有独立的潮汐系统和强大的洋流系统，而且高压、低温、黑暗、高盐、寡营养的深海极限环境使得生长于该区域的微生物在适应极端环境过程中形成了特殊的生理代谢和防御机制。因而，这些深海微生物可能是结构新颖、活性优良天然产物的重要来源，开发利用高活性深海微生物或其活性产物已成为当前海洋生物资源研发的热点之一。

芽孢杆菌（Bacillus sp.）因能产生耐热抗逆的芽孢，所以是土壤和植物微生物生态的优势种。同时由于芽孢杆菌具有内生芽孢、抗逆性强、繁殖速度快、营养要求简单和易于在植物根部定殖的特点，使其在植物病害生物防治中被加以应用。例如，由美国Gustafson公司开发的命名为GBO3的芽孢杆菌能有效防治Fusarium和Rhizoctonia引起的植物病害，与此同时其还具有防病和促进植物生长的作用。江苏省农业科学院筛选获得的Bacillus sp.916菌株对水稻白叶枯病具有显著的防治效果。

本发明的目的之一在于提供一株芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608。

本发明的目的之二在于提供一株芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608在制备防治油菜菌核病发酵上清液中的应用。

所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608分离自中国第31次大洋科学考察所采集的深海沉积物样品（152º57′3012′′W，6º44′9371′′N）；该菌已于2020年07月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCC NO：M2020335。

所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608通过聚合酶链式反应（PCR）扩增16S rDNA序列，与美国国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，发现其与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）细菌具有99%的序列相似性。

所述防治油菜菌核病发酵上清液的制备方法如下：首先将芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608在含有5 mL LB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到500 mLLB培养基中进行发酵培养，发酵培养结束后离心除去菌体，得到防治油菜菌核病发酵上清液。

所述离心除去菌体是在10,000 r/min下离心15～20min。

所述活化培养的时间为12-24 h。

所述发酵培养的温度为28-30℃，发酵培养的时间为48-60 h，发酵培养的摇床转速为180-220 r/min。

所述油菜菌核病致病真菌为核盘菌。

所述防治油菜菌核病发酵上清液的使用方法如下：将防治油菜菌核病发酵上清液直接或稀释后喷洒在植物上。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：发酵上清液的制备工艺简单，抑真菌谱广，生防效果好。在油菜菌核病（核盘菌）的田间防治试验中显示出较好地生物防治效果，防效可达57%以上。

图1为芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608的菌落形态。

图2为芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608的发酵上清液对不同植物致病真菌的抑菌效果图。在图2中：A：宛氏拟青霉；B：核盘菌；C：立枯丝核菌；D：镰刀菌；E：长柄链格孢；F：梨菌；G：葡萄座腔；H：梨黑斑。

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1 芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608的分离筛选

本发明涉及芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608来源于本申请人从中国第31次大洋科学考察所采集的深海沉积物样品。先将沉积物样品用无菌海水梯度稀释至10-10，分别取100μL的10-1-10-10的稀释液均匀涂布在LB平板上，每个梯度做三个平行重复，并放置在28℃培养箱中培养48h。根据菌落的形态、颜等特征，挑取单菌落划线于LB培养板，经过3轮重复划线，直至每株得到纯培养，即完成菌株的分离纯化。

获得菌株在LB培养基上生长，28℃培养24 h后，菌体不透明，呈白，边缘不光滑呈锯齿状。

实施例2

芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608的菌种鉴定利用16S rDNA通用引物27F和1492R（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAT；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT） 对深海沉积物来源菌株W608的16S rDNA序列进行扩增。以W608总DNA为PCR扩增模板，在PCR扩增仪上进行PCR反应。反应条件为：94℃变性1 min；55℃退火1 min；72℃延伸1.5 min，30个循环。扩增序列经测序公司测序后，获得该菌株16S rDNA序列。将该序列通过与美国国家生物技术信息中心GenBank中核酸数据进行比对分析（http://ncbi.nlm.nih.gov/blast）。结果显示，W608的16S rDNA序列与Bacillus velezensis（MN938176.1）、Bacillus siamensis（MN865945.1）、及Bacillus amyloliquefaciens（MK182997.1）等菌株的序列相似性为99％，即芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608与芽孢杆菌同源，因此，将其命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608。

所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608的16S rDNA部分序列如下：

AAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGG GCGGTGTGTA CAAGGCCCGGGAACGTATTC ACCGCGGCAT GCTGATCCGC GATTACTAGC GATTCCAGCT TCACGCAGTC GAGTTGCAGACTGCGATCCG AACTGAGAAC AGATTTGTGG GATTGGCTTA ACCTCGCGGT TTCGCTGCCC TTTGTTCTGTCCATTGTAGC ACGTGTGTAG CCCAGGTCAT AAGGGGCATG ATGATTTGAC GTCATCCCCA CCTTCCTCCGGTTTGTCACC GGCAGTCACC TTAGAGTGCC CAACTGAATG CTGGCAACTA AGATCAAGGG TTGCGCTCGTTGCGGGACTT AACCCAACAT CTCACGACAC GAGCTGACGA CAACCATGCA CCACCTGTCA CTCTGCCCCCGAAGGGGACG TCCTATCTCT AGGATTGTCA GAGGATGTCA AGACCTGGTA AGGTTCTTCG CGTTGCTTCGAATTAAACCA CATGCTCCAC CGCTTGTGCG GGCCCCCGTC AATTCCTTTG AGTTTCAGTC TTGCGACCGTACTCCCCAGG CGGAGTGCTT AATGCGTTAG CTGCAGCACT AAGGGGCGGA AACCCCCTAA CACTTAGCACTCATCGTTTA CGGCGTGGAC TACCAGGGTA TCTAATCCTG TTCGCTCCCC ACGCTTTCGC TCCTCAGCGTCAGTTACAGA CCAGAGAGTC GCCTTCGCCA CTGGTGTTCC TCCACATCTC TACGCATTTC ACCGCTACACGTGGAATTCC ACTCTCCTCT TCTGCACTCA AGTTCCCCAG TTTCCAATGA CCCTCCCCGG TTGAGCCGGGGGCTTTCACA TCAGACTTAA GAAACCGCCT GCGAGCCCTT TACGCCCAAT AATTCCGGAC AACGCTTGCCACCTACGTAT TACCGCGGCT GCTGGCACGT AGTTAGCCGT GGCTTTCTGG TTAGGTACCG TCAAGGTGCCGCCCTATTTG AACGGCACTT GTTCTTCCCT AACAACAGAG CTTTACGATC CGAAAACCTT CATCACTCACGCGGCGTTGC TCCGTCAGAC TTTCGTCCAT TGCGGAAGAT TCCCTACTGC TGCCTCCCGT AGGAGTCTGGGCCGTGTCTC AGTCCCAGTG TGGCCGATCA CCCTCTCAGG TCGGCTACGC ATCGTCGCCT TGGTGAGCCGTTACCTCACC AACTAGCTAA TGCGCCGCGG GTCCATCTGT AAGTGGTAGC CGAAGCCACC TTTTATGTCTGAACCATGCG GTTCAGACAA CCATCCGGTA TTAGCCCCGG TTTCCCGGAG TTATCCCAGT CTTACAGGCAGGTTACCCAC GTGTTACTCA CCCGTCCGCC GCTAACATCA GGGAGCAAGC TCCCATCTGT CCGCTCGACTTGC。

实施例3：植物致病真菌抗菌谱的测定

芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608发酵上清液的制备方法如下：首先将芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608在含有5 mL LB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到500 mL LB培养基中进行发酵培养，发酵培养结束后离心除去菌体，得到发酵上清液。

所述离心除去菌体是在10,000 r/min下离心20min。

所述活化培养的时间为20h。

所述发酵培养的温度为28℃，发酵培养的时间为48h，发酵培养的摇床转速为200r/min。

采用纸片法测定芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608对8种植物致病真菌的抑制活性。用无菌打孔器将受试致病真菌制成菌块，用牙签挑取一菌块接种于马铃薯固体培养基平板中央，28℃的条件下培养。待受试致病真菌菌丝体扩散生长后，将灭菌的双层滤纸片（直径6mm）放置于菌块四周，滤纸片距离菌丝边缘约1 cm。在每个滤纸片上加60 μL的无菌发酵上清液，继续培养24 h，通过与对照组比较，观测菌丝体的生长是否会受到抑制，若受试致病真菌的菌丝体受到抑制，菌丝体会形成月牙型或者线型边缘。结果如图2所示，芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608发酵上清液对8种受试植物致病真菌具有抑制活性，分别为：核盘菌、镰刀菌、长柄链格孢、立枯丝核菌、梨黑斑菌、梨菌、宛氏拟青霉和葡萄座腔。

表1. W608抑制相关致病真菌的抑菌直径表

（注：抑菌圈直径<10mm为有抑菌作用，10-14mm为中强抑菌，15-20mm为高强抑菌，20mm以上为极强抑菌作用）

实施例4：油菜菌核病（核盘菌）的生物防治盆栽试验

油菜菌核病菌在马铃薯蔗糖培养基上培养3天后制成直径5 mm的菌碟，留待备用。供试油菜品种为皖油29号。叶片接种试验和茎秆接种试验每小区都为5株油菜，每单株计算防效，其中4株施加芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608发酵上清液，1株不施药作为对照CK。

于油菜主茎开花期，将芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608发酵上清液稀释10倍，用小型喷雾器（500 mL）对每株油菜进行均匀喷雾，施药量为20 mL稀释液。施药后第二天于叶片中央接种1个菌碟，菌碟上覆盖4层卫生纸，再在卫生纸上加1 mL清水保湿，以利发病，每处理接种30张叶片。茎秆接种在茎秆基部接种一个菌碟，然后用胶带包裹接种体并绕茎一圈，保湿并防止接种体脱落，每处理接种30个茎秆。

叶片接种试验交叉量取病斑直径，计算平均值，以平均直径计算病斑面积，每株测量5个病斑，共测量20个病斑的直径。茎秆接种试验每株测量5个病斑的长度，共测量20个病斑的长度。

叶片接种试验防效按下式计算：

结果进行反正弦平方根转换，用邓肯氏法进行统计分析。

计算结果表明，芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608对油菜菌核病叶片防效达到57.48%，茎秆防效可达57.35%。

表1 芽孢杆菌（Bacillus sp.）W608防治油菜菌核病试验结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）

<120> 一株芽孢杆菌W608及其在防治油菜菌核病中的应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1403

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta 60

caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct 120

tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg aactgagaac agatttgtgg gattggctta 180

acctcgcggt ttcgctgccc tttgttctgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 240

aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc 300

ttagagtgcc caactgaatg ctggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt 360

aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgccccc 420

gaaggggacg tcctatctct aggattgtca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg 480

cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 540

agtttcagtc ttgcgaccgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttag ctgcagcact 600

aaggggcgga aaccccctaa cacttagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta 660

tctaatcctg ttcgctcccc acgctttcgc tcctcagcgt cagttacaga ccagagagtc 720

gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc tacgcatttc accgctacac gtggaattcc 780

actctcctct tctgcactca agttccccag tttccaatga ccctccccgg ttgagccggg 840

ggctttcaca tcagacttaa gaaaccgcct gcgagccctt tacgcccaat aattccggac 900

aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg 960

ttaggtaccg tcaaggtgcc gccctatttg aacggcactt gttcttccct aacaacagag 1020

ctttacgatc cgaaaacctt catcactcac gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat 1080

tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg 1140

tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc atcgtcgcct tggtgagccg ttacctcacc 1200

aactagctaa tgcgccgcgg gtccatctgt aagtggtagc cgaagccacc ttttatgtct 1260

gaaccatgcg gttcagacaa ccatccggta ttagccccgg tttcccggag ttatcccagt 1320

cttacaggca ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc gctaacatca gggagcaagc 1380

tcccatctgt ccgctcgact tgc 1403

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcat 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acggctacct tgttacgact t 21