一株葡萄球菌及其应用

一株葡萄球菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种高效亚硝酸型（短程脱氮）反硝化菌株。本发明的脱氮菌株能以亚硝氮为氮源进行反硝化，特别适用于含氨废水短程硝化反硝化过程中的脱氮。 

背景技术

传统的生物脱氮工艺主要包括硝化和反硝化两个过程，硝化是反硝化过程的前提，反硝化过程才能真正脱除废水中的含氮化合物。由于硝化菌有强烈的好氧性，硝化过程是好氧的；而反硝化菌一般为兼性细菌，在有氧条件下即以氧作为电子受体，进行有氧呼吸，只有无氧状态时才以硝酸盐或亚硝酸盐作为电子受体，获取合成细胞体的能量。一般认为在好氧条件下，硝酸或亚硝酸还原酶不能表达或氧分子会对这些酶产生抑制。如当溶解氧分别大于4.05mg/L、2.15 mg/L、0.25mg/L时Pseudomonas nautica硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氮氧化物还原酶完全失活。 

传统的脱氮工艺大多是将硝化和反硝化设置在两个构筑物中进行分级脱氮，存在污水处理工艺流程较长，基建投资高，需要向硝化池补充碱度等不足。所以一些新型的、效果更好的脱氮微生物，如异养硝化细菌、好氧反硝化细菌、厌氧氨氧化细菌等相继被发现。 

目前为止已分离出60多种反硝化菌，主要分布于假单胞属(Pseudomonas )、产碱杆菌属(Alcaligeneas)、泛养硫球菌属（Thiosphera pantotroph）、动胶菌属（Zoogloeas）和芽孢杆菌属（Bacillus）等，大多数为兼性厌氧菌。Lukow从垃圾渗滤液的硝化工段分离出属于Zoogloeas一株菌TL1（Aerobic denitrification by  a newly isolated heterotrophic bacterium strain TL1[J ] . Biotechnology Letters  ,1997 

11(19) : 1 157～1 159），该菌可以同时利用氧和降解硝酸盐。Naokia筛得两株反硝化菌，分别为Pseudomonas stutzeri TR2和Pseudomonas sp.K50（Aerobic Denitrifying  Bacteria that Produce low Levels of Nitrous Oxide [ J] .Applied and  Environmental Microbiology, 2003, 69 (6):3152‑3157）。张光亚（华侨大学学报，2004，25(1)）从土壤中分离出一株以硝酸钠为氮源的好氧反硝化菌HN，经鉴定为Rhodococcus sp.，王琳等（环境科学，2009，(30)1）以硝酸盐氮为电子受体、以柠檬酸钠为碳源、从河流沉积物中分离到一株粪产碱杆菌(Acaligenes faecalis)。王晓宇等（环境科学学报，2009，(29)1）从活性污泥中分离到假单胞产碱杆菌（Pseudomonas  pseudoalcaligenes）和假单胞菌属门多萨菌（Pseudomonas mendocina）。以上对反硝化微生物的研究主要集中在以硝酸盐氮为电子受体的反硝化菌。张小玲等（微生物学通报，2008，35(10)）从池塘底泥中分离到一株好氧反硝化菌株H2，经初步鉴定属于芽孢杆菌属，该菌株对亚硝酸盐最高降解速率为0.885mg/(L·d)；李兵等（水生生态杂志，2009，2(3)）从土壤中筛选到芽孢杆菌D5，该菌株的最大降解速率为2.22mg/(L·h)。安健等（环境科学研究，2010，23(1)）从对虾养殖池塘中筛选到一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)YX‑6，该菌株能够在14h内将亚硝酸盐氮由10mg/L降至0。以上分离到的降解亚硝酸盐氮菌株都属于芽孢杆菌属（Bacillus），这些菌株能以亚硝氮为电子受体进行反硝化脱氮，且降解速率可达10mg/(L·h)，所处理废水的亚硝酸盐氮浓度也达到了100mg/L。

葡萄球菌作为一种环境微生物，已经分离筛选到具有降解甲胺磷、乙苯、2‑甲基吡啶和对偶氮染料具有脱能力的株菌。邓先余等（海洋与沼泽,2009,40(5)）从湘潭南天化工厂的甲胺磷废水和污泥中分离到一株为巴氏葡萄球菌(Staphylococcus  pasteuri)，菌株HN003 对甲胺磷最大耐受浓度为40000—45000mg/L。CN200610046643.5公开了一株木糖葡萄球菌Staphylococcus xylous Y1，该菌株对乙苯具有高效降解性能；CN200610046645.4公开了开了一株木糖葡萄球菌Staphylococcus xylous B1，该菌株对2‑甲基吡啶具有较高的降解性能；CN201010103745.2公开了一株巴斯德葡萄球菌(Staphylococcus  pasteuri)，该菌株具有广谱的偶氮染料脱能力，并且能够适应极端环境，在强碱性条件下仍然能够对偶氮染料进行脱。大连理工大学环境与生命学院环境工程研究所从染料废水处理厂泥中筛选得到菌株AZR 属于葡萄球菌属(Staphylococcus)中的科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)，该菌株具有对偶氮染料进行脱的能力。尚未见葡萄球菌用于处理工业废水中亚硝酸盐氮的报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有天然生长优势的、直接以亚硝酸盐作为电子受体的科氏葡萄球菌，本发明提供的科氏葡萄球菌亚硝酸还原酶活性高，在有氧和无氧条件下均能够表达。新菌株的发现有利于促进短程硝化反硝化工艺和同步硝化反硝化工艺在实际污水处理过程中的应用。 

本发明提供一株葡萄球菌，科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii）FSDN‑C，2011年7月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.5062。 

本发明提供的科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii）FSDN‑C主要形态特征为：菌落颜为白、菌株个体呈杆状，无芽孢。 

本发明所述的科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii）FSDN‑C的生理生化特征表现为：革兰氏染为阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性性，能利用多种碳源。 

本发明的科氏葡萄球菌FSDN‑C能以亚硝氮为氮源进行反硝化脱氮，亚硝酸还原酶的表达不受溶解氧条件限制，在有氧和缺氧环境下均能进行反硝化。 

本发明提供的科氏葡萄球菌FSDN‑C的16SrRNA基因序列见序列表。 

本发明提供的科氏葡萄球菌FSDN‑C，主要应用于短程反硝化脱氮。该菌株生长速度快、细胞产量高，要求C/N比低，无论是新鲜培养液还是超低温保藏的培养液均具有较高的脱氮活性。该菌株在pH为9.0的条件下仍然能够生长。该菌株短程反硝化脱氮的条件为：温度15℃～35℃；pH6.5～10.0；溶解氧为0.2~1.5mg/L；碳氮质量比3：1~10：1。 

本发明的科氏葡萄球菌FSDN‑C在处理含氮废水时，能够耐受高浓度亚硝酸盐氮、最高可达400mg/L，降解速率能大于10mg/(L·h)。 

本发明的科氏葡萄球菌FSDN‑C能够处理含盐废水，耐受盐含量可达25g/L，在脱氮的同时能去除COD。 

本发明的科氏葡萄球菌在处理含氮废水时，工艺简单，能够耐受高浓度有机碳源。投入使用后系统启动快，在各类废水脱氮处理过程中具有非常广阔的应用前景，特别适合短程硝化反硝化或者同步硝化反硝化过程中，在脱氮效果不理想的情况下可以作为生物修复剂进行补加。还可以制备脱氮菌剂。 

生物材料保藏说明

本发明提供的科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii）FSDN‑C菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC NO.5062；保藏日期：2011年7月14日。

具体实施方式

本发明的科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii）FSDN‑C是从中国石油抚顺石油三厂污水处理厂活性污泥中筛选得到，能够以亚硝氮为氮源进行反硝化脱氮，其生理生化试验结果见表1。 

表1科氏葡萄球菌FSDN‑C的生理生化试验结果。 

试验项目 结果 试验项目 结果 试验项目 结果

细胞形态 球状 革兰氏染 阳性 接触酶 ＋

硝酸盐还原 － VP反应 ＋ 15%NaCl ＋

对照 － a‑D‑乳糖 － 塔格糖 －

a‑环糊精 － Lactulose － D‑海藻糖 ＋

b‑糊精 － 麦芽糖 ＋ 松二糖 －

糊精 ＋ 麦芽三糖 ＋ 木糖醇 －

糖原 － D‑甘露醇 ＋ D‑木糖 －

菊粉 － D‑甘露糖 ＋ 乙酸 －

甘露聚糖 － 松三糖 － a‑ －

Tween40 ＋ D‑蜜二糖 － b‑ －

Tween80 － a‑甲基半乳糖苷 － g‑ －

N‑乙酰葡萄糖胺 － b‑甲基半乳糖苷 － 扁桃酸 －

N‑乙酰甘露糖胺 － 3‑甲基‑D‑葡萄糖 － a‑氧代戊二酸 －

苦杏仁苷 － a‑甲基葡糖苷 － a‑酮戊酸 ＋

L‑阿拉伯糖 － b‑甲基葡糖苷 － 乳酰胺 －

D‑阿糖醇 ＋ a‑甲基甘露糖苷 － 乳酸甲酯 －

熊果苷 － Palatinose － L‑乳酸 ＋

D‑纤维二糖 － D‑阿洛酮糖 ＋ D‑苹果酸 －

D‑果糖 ＋ D‑棉子糖 － L‑苹果酸 －

岩藻糖 － L‑鼠李糖 － 丙酮酸甲酯 ＋

D‑半乳糖 ＋ D‑核糖 ＋ 丁二酸一甲酯 －

半乳糖醛酸 － 水杨苷 － 丙酸 －

龙胆二糖 － 景天庚酮聚糖 － 丙酮酸 －

D‑葡糖酸 ＋ D‑山梨醇 － 琥珀酰胺酸 b

a‑D‑葡萄糖 ＋ 水苏糖 － 丁二酸 －

m‑肌醇 － 蔗糖 ＋ N‑乙酰谷氨酸 －

氧化酶 － 焦谷氨酸 － 尿苷 ＋

pH4.5生长 ＋ L‑丝氨酸 ＋ 酰苷酸 －

L丙氨酰胺 － 腐胺 － 胸苷酸 －

D‑丙氨酸 ＋ 2,3‑丁二醇 － 尿苷酸 －

L‑丙氨酸 ＋ 甘油 ＋ D‑果糖糖‑6‑磷酸 －

L‑丙氨酰甘氨酸 ＋ 腺苷 － D‑葡糖‑1‑磷酸 －

L‑天冬酰胺 － 2‑脱氧腺苷 － D‑葡糖‑6‑磷酸 －

L‑谷氨酸 ＋ 肌苷 ＋ D,L‑甘油磷酸盐 －

甘氨酰谷氨酸 － 胸苷 －    

经“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”鉴定，该菌株属于科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii）命名为FSDN‑C。图1为该科氏葡萄球菌在琼脂平板上的生长状态，该菌落为白、乳状、纯。 

实施例 1   细菌的富集培养和分离纯化

反硝化细菌的富集培养：

取污水处理场硝化池内的活性污泥，利用含有亚硝酸盐的培养基在低溶解氧条件下进行富集培养一定时间，获得反硝化活性污泥。富集过程中适时补充新鲜培养液。

富集培养液配方：NaNO₂，甲醇，还含有包含Fe^2＋、Mg^2＋、K^＋、Ca^2＋四种金属阳离子。培养条件为：温度30℃；pH 为 8.2， DO（溶解氧）为0.2‑1.0 mg·L^–1。 

四种金属阳离子的摩尔配置比例为1:(4‑8):(5‑15):(1‑5)。培养过程中每天补加金属阳离子总浓度为0.15mol/L的生长促进剂，补加量为反应器内物料体积的0.1%。 

反硝化细菌的筛选： 

吸取1ml上述富集培养液，用蒸馏水重悬并尽可能将颗粒打散，取菌悬液稀释不同的倍数后涂布已经渗透反硝化培养液的牛肉膏蛋白胨平板，30℃培养进行反硝化细菌的筛选，培养过程中定期观察菌体的生长状况，重复上述操作直到获得单菌落。挑取平板上的单菌落划线进行单株纯化，转接两次，即获得纯化的菌株FSDN‑C。

分离培养基配方：牛肉膏：5g/L，蛋白胨：10g/L，NaNO₂：1g/L，平板加入2%的琼脂。 

实施例 2   本发明菌株脱氮能力考察

首先从平板上挑取单菌落FSDN‑C接种到牛肉膏蛋白胨培养基中30℃、120r/min摇床培养48h后菌体浓度最大，结束培养。将菌悬液离心后转入亚硝酸钠‑甲醇培养液中在同样条件下采取批式换水和批次补料两种方式进行脱氮能力考察。表1是批式换水情况下本发明菌株对亚硝氮和COD的同时去除效果。从表中的数据来看，进水总氮浓度由200mg/L提高到469mg/L过程中，总氮去除率始终大于88.63%，进水COD浓度由2728mg/L提高到4149mg/L过程中，COD去除率大于80.14%。可见该菌株在处理总氮的同时还能够去除高浓度COD。

表1  FSDN‑C菌株脱氮能力驯化结果（mg/L）。 

进水NO ₂ ^‑ 进水总N 进水COD 反应时间，h 总N去除率,% COD去除率,%

178.3 211 2728 48 88.63 93.22

257.5 293 2850 24 93.52 86.77

294.9 372 3017 20 93.82 81.17

312.7 469 4149 18 91.68 80.14

实施例 3   本发明菌株处理某炼油厂废水

取一定量实施例2获得的菌悬液按照15%（体积）的接种量进行接种，在温度28℃、pH为8.3、DO（溶解氧）为1.2mg·L^– 1条件下，处理含有碱渣的某炼油废水经曝气处理后的出水，其中无机盐含量为25g/L，NO₂^‑‑N平均为120mg/L，COD平均为800 mg/L。经过处理后出水NO₂^‑‑N和COD平均浓度分别为6.4mg/L和61mg/L，NO₂^‑‑N和COD平均去除率分别为94.7%和92.4%。

实施例 4 本发明菌株在催化剂废水脱氮过程中的应用

取一定量实施例2获得的菌悬液按照15%（体积）的接种量进行接种，在温度30℃、pH 为7.8、DO（溶解氧）为0.3mg·L^–1条件下，对催化剂生产过程中产生的含氨废水短程硝化出水进行反硝化处理，该水中COD为800 mg/L ~1200mg/L，NO₂^‑‑N为500 mg/L ~780mg/L，NO₃^‑‑N为10mg/L。经过处理后废水中总氮去除率达92%以上。