一株烟草普通花叶病毒生防菌及其应用

本发明属生物技术领域，具体涉及一株烟草普通花叶病毒生防菌拜式不动杆菌菌株，以及该菌株及从该菌株中分离到的上清液和蛋白粗提液在烟草普通花叶病毒防治方面的应用。

烟草普通花叶病毒病是由烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)侵染烟株引起的，自苗床至大田整个生育期均可发生，烘烤后的病叶颜不均匀，吃味较差，品质下降，产量降低。TMV 广泛分布于我国各植烟区，据统计，2009年全国16个植烟省因TMV造成的烤烟产量损失达168.27万kg，产值亏损近2千万元。

多年来，生产上多以化学农药为主对烟草普通花叶病毒病进行防治，然而化学农药的不合理使用及其高毒、高残留的特性对人畜安全、生态环境都造成了极大的威胁。随着对绿生态农业可持续发展的追求，低毒、无残留的生物制剂逐渐进入人们的视野，并逐渐成为综合防治的核心，因此现在亟需研究开发出一些效果显著的抗烟草花叶病的生物制剂。

目前，国内已有不少针对烟草花叶病毒病生物防治的研究，但多数仅限于对生防菌株的筛选和盆栽试验阶段，而对其产生的拮抗活性物质的分离提取等方面鲜少进行深入研究。本发明将从生物防治方面进行探索，筛选防效优良的拮抗菌株，对其产生的拮抗活性物质进行分离提取，并应用于烟草花叶病毒病的生物防治中。

本发明的目的在于提供一株烟草普通花叶病毒生防菌拜式不动杆菌(Acinetobacter beijerinckii)菌株，以及将该菌株及从该菌株分离到的蛋白粗提液应用于烟草普通花叶病毒的防治，为烟草普通花叶病毒病的防治提供新的微生物资源。

本发明的目的是这样实现的，从土样中分离到该菌株，经鉴定为拜式不动杆菌(Acinetobacter beijerinckii)，菌株代号为S1，该菌株于2016年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCC No.13114。

由菌株S1制备蛋白粗提液的方法，包括以下步骤：

(1)将活性菌株S1接种到LB固体培养基上进行纯化，挑取生长良好的单一菌落接种于3mL LB液体培养基中，28℃、140rpm振荡培养48h，后以1:100比例接种于LB液体培养基中进行大规模发酵培养，最后以无菌水稀释成1×108cfu/mL作为菌液备用。

(2)在菌液中加入30％饱和度的硫酸铵，4℃沉淀过夜，12000rpm 离心20min，用少量磷酸缓冲液(pH7.2)对沉淀物进行溶解，4℃透析除盐(透析袋截流分子量为14000)，12000rpm离心30min，得上清液，将上清液过滤(ψ＝0.22μm)除杂质得到蛋白粗提液，-20℃保存备用。

本发明获得的拮抗烟草普通花叶病毒病的生防菌拜式不动杆菌菌株，可应用于对烟草普通花叶病毒病的防治，统计枯斑数显示其发酵液对TMV的抑制率高达93.55％，而蛋白粗提液对TMV的防效为 87.50％。同时，S1菌株发酵上清液的防效也较明显，可抑制TMV侵染和增殖，在生产上具有一定的实用价值。

图1为菌株对TMV的拮抗活性效果图；

图2为不同处理对TMV的抑制效果图(a：S1发酵上清液；b：阿泰灵1000倍液；c：LB液体培养基)；

图3为S1菌株在透视电镜下的菌体形态图。

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。

实例一

挑取纯化菌株接种于3mL LB液体培养基，28℃、140rpm振荡培养48h，后以1:100比例接种于LB液体培养基中进行大规模发酵培养，最后以无菌水稀释成1×108cfu/mL作为菌液备用。取2mL发酵菌液与等体积40倍TMV汁液混匀，LB液体培养基与等体积40 倍TMV汁液混合液作为对照，15min后采用半叶法分别摩擦接种三生-NN烟，接种3d后观察结果如图1所示，并统计枯斑数计算抑制率。结果显示，发酵菌液对TMV的抑制效果较好，枯斑抑制率高达93.55％(表1)，生防菌株在生长代谢过程中产生了抑制TMV活性的抗性物质。

抑制率(％)＝[1－(处理平均枯斑数/对照平均枯斑数)]×100。

表1发酵菌液对TMV的抑制作用

实例二

在发酵菌液中加入30％饱和度的硫酸铵，4℃沉淀过夜，12000rpm 离心20min，用少量磷酸缓冲液(pH7.2)对沉淀物进行溶解，4℃透析除盐(透析袋截流分子量为14000)，12000rpm离心30min，将上清液过滤(ψ＝0.22μm)除杂质得到蛋白粗提液。将磷酸缓冲液作为对照，采用半叶法接种三生-NN烟，3d后统计枯斑数计算抑制率，结果发现蛋白粗提液的生物活性较强，对TMV的抑制率达87.50％，由此可见，可将蛋白粗提液作为提纯对象来进一步分离纯化。

表2蛋白粗提液对TMV的抑制作用

实例三

为了比较菌株发酵上清液与其他抗病毒药剂对TMV的抗病效果，发明人将发酵菌液于4℃、12000rpm离心10min，去菌体，制成胞外代谢物的发酵上清液，同时挑选阿泰灵1000倍液和LB液体培养基进行抗性效果比较。

选用4-5叶期的三生-NN烟苗作为实验材料，移栽缓苗后分别喷施菌株发酵上清液、阿泰灵1000倍液和LB液体培养基，每株喷洒量为10mL，每个处理4株，3次重复。48h后接种TMV，3d后各处理烟株的生长情况如图2，喷洒阿泰灵1000倍液、LB液体培养基的烟株发病较为严重，对TMV的防效相对较低，而喷洒菌株发酵上清液的烟株叶浓绿，发病较轻，枯斑数较少，对TMV的防效较好。

实例四

发明人将菌株发酵上清液用负染法处理，后在JEM-100CX透射电镜下观察菌体形态。如图3所示，菌体呈球状，单个或成双组合。另，按照试剂盒说明书对S1菌株进行DNA提取、PCR扩增，用细菌通用引物作扩增引物，后交由北京华大中生生物科技有限公司进行测序。并通过NCBI网站上的BLAST程序将测序结果与GenBank中的序列进行比对，结果显示，测得的S1菌株序列与拜式不动杆菌部分序列相同，同源性较高，因此鉴定S1菌株为拜式不动杆菌。