一株索诺拉沙漠芽孢杆菌及其筛分培养方法和应用

本发明涉及环境微生物技术领域，具体来讲，涉及一株索尼拉沙漠芽孢杆菌及其筛分培养方法和应用。

随着“厕所革命”工作的进一步推进，大量的公园、旅游区和户外作业区将安装环保厕所。而在打包、免水冲及循环水冲这三种生态厕所类型中，循环水冲型微生物降解厕所可以实现水资源的循环使用和粪便减量化，同时具有安全、环保、无臭味等优势，目前占据了较大的市场份额。

为实现循环水冲环保厕所的水循环，需要快速对入厕产生废水的COD及氨氮进行去除，其中，生物脱氮技术因其简单高效且成本低廉被大量采用。异养硝化菌能够在有氧环境下降解有机底物的同时进行硝化和反硝化将氨氮降解，这打破了传统反硝化作用只能在厌氧条件下进行的观点。好氧反硝化使得同步脱氮体系的构建成为可能，因此，异养硝化-好氧反硝化菌成为重点研究对象。近年来，国内外对异养硝化-好氧反硝化菌的研究取得了一定成果，已经发现的能够异养硝化-好氧反硝化的菌属有人苍白杆菌属(Ochrobactrum)、假单胞菌属(Pseudomonas)、泛养硫球菌属(Paracoccus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia)和嗜吡啶红球菌属(Rhodococcuss)等，以上异养硝化-好氧反硝化菌均在污水处理方面具有广泛的应用价值。

因此，筛选更多、更优质的兼具异养硝化-好氧反硝化功能的菌株，对提高废水的脱氮效率具有重要意义。

本发明的目的在于解决现有技术存在的上述不足中的至少一项。例如，本发明的目的之一在于提供一株能够降解去除生活废水中的有机质及氨氮的索诺拉沙漠芽孢杆菌及其筛分培养方法和应用。

为了实现上述目的，本发明的一方面提供了一株索诺拉沙漠芽孢杆菌，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌的分类命名为索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CSB-5，已于2020年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020113。

在本发明一株索诺拉沙漠芽孢杆菌的一个示例性实施例中，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，有芽孢，菌体为杆状，有运动性，专性需氧。

在本发明一株索诺拉沙漠芽孢杆菌的一个示例性实施例中，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明一株索诺拉沙漠芽孢杆菌的一个示例性实施例中，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则形状，48h后菌落为圆形，白，直径为0.5～0.8mm，边缘整齐，扁平湿润。

在本发明一株索诺拉沙漠芽孢杆菌的一个示例性实施例中，所述索诺拉沙漠芽孢杆菌具有抗逆特性，能够在盐浓度为0.5％～8％的培养基中生长。

本发明的另一方面提供了一株索诺拉沙漠芽孢杆菌的筛分培养方法，所述筛分培养方法包括以下步骤：采集样品并低温保存，所述样品包括化粪池污泥、畜禽粪便、土壤、水、淤泥和有机肥；采用梯度稀释法将所述样品的稀释液涂布在硝化细菌固体培养基上，20～55℃恒温培养；待所述培养基长出菌落后，挑选形态不同的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线培养；随后，挑取一环菌落进行重复划线培养，并结合显微观察，直至获得纯化的菌株。

本发明的再一方面提供了所述索诺拉沙漠芽孢杆菌或其菌悬液或其培养液或其发酵产物在降解去除生活废水、养殖废水以及工业废水的有机质及氨氮中的应用。

本发明的再一方面提供了一种生物制剂，所述生物制剂可以包括上述的索诺拉沙漠芽孢杆菌或其菌悬液或其培养液或其发酵产物。

本发明的再一方面提供了上述索诺拉沙漠芽孢杆菌或上述生物制剂在降解去除生活废水、养殖废水以及工业废水的有机质及氨氮中的应用。

本发明的再一方面提供了上述索诺拉沙漠芽孢杆菌或上述生物制剂在生态厕所中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果包括：本发明的索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CSB-5能够有效降解去除生活废水、养殖废水以及工业废水的有机质和氨氮；在纯培养条件下，接菌培养72h后，索诺拉沙漠芽孢杆菌对生活废水的有机质降解率达70.42％以上，氨氮去除率达79.12％以上，处理效果显著；索诺拉沙漠芽孢杆菌具有较强抗逆能力，可作为优良处理菌用于生活废水、养殖废水以及工业废水的处理，应用前景良好。

本发明的索诺拉沙漠芽孢杆菌已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2020年5月11日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020113。

通过下面结合附图进行的描述，本发明的上述和其他目的和特点将会变得更加清楚，其中：

图1A示出了本发明的一个示例性实施例的索诺拉沙漠芽孢杆菌在显微镜下的菌体形态；图1B示出了索诺拉沙漠芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落形态；

图2示出了本发明的一个示例性实施例的索诺拉沙漠芽孢杆菌的16S rDNA序列的系统发育图。

在下文中，将结合附图和示例性实施例来详细说明本发明的索诺拉沙漠芽孢杆菌及其筛分培养方法和应用。

本发明的一方面提供了一株索诺拉沙漠芽孢杆菌，该菌株的分类命名为索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CSB-5，已于2020年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020113。

在本实施例中，索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)CSB-5为革兰氏阳性菌，有芽孢，菌体为杆状，有运动性，专性需氧。

在本实施例中，提取菌株CSB-5的总DNA，扩增16S rDNA片段，测得的16S序列如SEQID NO.1所示。将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，CSB-5与GenBank中的模式菌株索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)NRRL B-23154T的相似度最高(99.8％)，从而确定了CSB-5在分类上属于索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillussonorensis CSB-5)。

在本实施例中，索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)CSB-5在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则形状，48h后菌落为圆形，白，直径为0.5～0.8mm，边缘整齐，扁平湿润。

在本实施例中，索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)CSB-5具有抗逆特性，能够在盐浓度为0.5％～8％的培养基中生长。

本发明的另一方面提供了一株索诺拉沙漠芽孢杆菌的筛分培养方法，所述筛分培养方法包括以下步骤：

1)采集样品并低温保存，所述样品包括化粪池污泥、畜禽粪便、土壤、水、淤泥和有机肥；

2)采用梯度稀释法将预定量(例如，3～8g)所述样品的稀释液涂布在硝化细菌固体培养基上，20～55℃恒温培养；这里，取用的样品宜适量，培养的温度可根据目标菌株应用环境的温度范围进行调整，例如，样品可取5g，若目标菌株应用于高温环境，培养的温度可以为50℃，若目标菌株应用于常温环境，培养的温度可以为25℃。

3)待所述培养基长出菌落后，挑选形态不同的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线培养；

4)随后(例如，培养16～18h后)，挑取一环菌落进行重复划线培养，并结合显微观察，直至获得纯化的菌株，将所述纯化后的菌株接入牛肉膏蛋白胨培养基的试管斜面培养基保存。

本发明的索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)CSB-5具有很强的降解能力，能够降解去除生活废水、养殖废水以及工业废水的有机质及氨氮。

优选地，本发明的索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)CSB-5的菌悬液，或其培养液，或其发酵产物也具有很强的降解能力，能够有效降解去除生活废水、养殖废水以及工业废水的有机质及氨氮。

本发明的再一方面还提供了一种生物制剂。在本发明的生物制剂的一个示例性实施例中，该生物制剂可以包括本发明的索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)CSB-5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物。

本发明的生物制剂同样具有很强的降解能力，能够有效降解去除生活废水、养殖废水以及工业废水的有机质及氨氮。

本发明的索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)CSB-5或生物制剂具有良好的降解应用潜力，能够在生态厕所中应用。

为了更好地理解本发明的上述示例性实施例，下面结合具体示例对其进行进一步说明。

示例1

(1)索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis CSB-5(简称“菌株CSB-5”)的分离、纯化和保存

采集的化粪池污泥样品，低温保存带回实验室。取样品5g，采用梯度稀释法，于硝化细菌固体培养基平板上涂布，30℃恒温培养。待长出菌落后，从平板上挑选形态不同的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线培养。待培养16h，挑取一环进行重复划线培养，结合显微观察，直至纯化为止。纯化后的菌株接入牛肉膏蛋白胨培养基的试管斜面培养基保存。

硝化细菌固体培养基组成：(NH4)2SO4 0.5g/L，琥珀酸钠5.62g/L，K2HPO4 0.25g/L，MgSO4·7H2O 0.13g/L，NaCl0.13g/L，FeSO4·7H2O 0.0025g/L，MnSO4 ·4H2O 0.025g/L，去离子水1L，pH值7.0，121℃灭菌20min。

如图1所示，本实施例的分离纯化得到的菌株CSB-5在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，培养48h后菌落为圆形，白，直径为0.5～0.8mm，边缘整齐，扁平湿润。其中图1A示出了菌落形态，图1B为菌落在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线培养后的示意图。

(2)菌株CSB-5的16S rDNA的扩增及系统发育分析

提取菌株总DNA，以总DNA为模板，用27F和1492R为引物扩增16S片段，PCR反应用Bio-RADMyCyclerTM仪器。

反应体系(50μl)：2×PCRMix25μl，引物27F和1492R(10μM)各1μl，DNA模板1μl，加超纯水补足至50μl；引物27F和1492R的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸8min。

PCR扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到上海生工生物工程有限公司进行序列测定。用软件DNA man6.0进行基因序列相似度的计算。所测序列结果如SEQ IDNo.1(序列表所示)。

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库中进行比对，发现CSB-5的16S rDNA基因序列与数据库中的模式菌株索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillussonorensis)NRRL B-23154T的相似度最高，为99.8％。根据NCBI比对结果，选择相似性最高的模式菌株作为参比菌株，用MEGA 6.0软件的邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树(图2)，自展值(bootstrap)1000。

基于以上特征，将菌株CSB-5鉴定为索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillussonorensis)。该菌株已于2020年5月11日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020113。

(3)菌株CSB-5降解去除生活废水的COD能力实验

将CSB-5接种于LB液体培养基上活化，待活化培养的菌悬液OD600＝1.0时，按5％接种至已灭菌的100mL生活废水(集自钻井队循环水冲生态厕所好氧曝气池)，30℃，140rpm振荡培养，以不接菌为对照，重复3次。

菌株降解生活废水COD能力测定：收集上述试验培养72h后培养液，10000rpm离心5min，收集上清液，测定其COD含量并记录(T1)，同法测定处理液初始COD含量并记录(T2)。生活废水COD去除率(％)＝(T2-T1)*100/T1。

测定结果表明，培养72h后，接种CSB-5菌株的处理的生活废水COD去除率达到87.56％。

(4)菌株CSB-5降解去除生活废水氨氮能力实验

将CSB-5接种于LB液体培养基上活化，待活化培养的菌悬液OD600＝1.0时，按5％接种至已灭菌的100mL氨氮浓度为244.36mg/L的生活废水(集自钻井队循环水冲生态厕所好氧曝气池)，30℃，140rpm振荡培养，以不接菌为对照，重复3次。

菌株降解去除生活废水氨氮能力测定：取发酵液离心，收集上清液，分别测定培养液中NH4+－N、NO3－－N、NO2－－N和TN的浓度，并转换为氮含量，记为C1；同法测定对照发酵液的氮含量，记为C2。生活废水氨氮去除率(％)＝(C2-C1)*100/C2。

测定结果表明，培养72h后，接种CSB-5菌株的处理的生活废水氨氮去除率达到79.12％。

(5)菌株CSB-5的抗性实验

耐盐能力测定：配制牛肉膏蛋白胨培养基，调节pH值为7；在基础牛肉膏蛋白胨培养基中添加NaC1，分别配制盐浓度为0.5％、1％、2％、4％、8％和10％的培养基。121℃灭菌30min后，按1％(v:v)添加菌悬液至新配置的培养基，设三个重复，置于30℃恒温培养箱中以150r/min转速震荡培养48h，用紫外分光光度计在波长λ＝600下测定菌的数量。

生长温度范围测定：配制牛肉膏蛋白胨培养基，调节pH值为7，121℃灭菌30min后，按1％(v:v)添加菌悬液至新配置的培养基，将接菌的培养基分别放置于10℃、20℃、30℃、40℃、55℃和65℃的恒温培养箱中以150r/min转速震荡培养48h，每个温度设3个重复，用紫外分光光度计在波长λ＝600下测定菌的数量。

结果表明，索诺拉沙漠芽孢杆菌CSB-5有良好的抗逆特性，其耐盐能力较强，能在含8％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长；生长温度范围较广，能在20～55℃温度范围内生长。

(5)菌株CSB-5应用于生态厕所实验

将CSB-5菌株接种于LB液体培养基，28℃振荡培养，培养24h，按5％接种至钻井队循环水冲型生态厕所的好氧曝气池，厕所使用频率可达100人次/天。每两周取好氧曝气池排出水样，测定水样COD及氨氮含量。以不接菌处理为对照，实验周期为8周。

结果表明(表1)：接种处理菌CSB-5的好氧曝气池COD和氨氮均显著低于对照；接菌处理4周后，曝气池液体COD和氨氮不再增加，且持续降低，相比于对照处理，COD和氨氮的减少率大于70％，表现出了良好的处理应用潜力。

表1菌株CSB-5对好氧曝气池中COD以及氨氮的处理效果

综上所述，本发明的索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)CSB-5能够有效降解去除生活废水、养殖废水以及工业废水的有机质和氨氮；在纯培养条件下，接菌培养72h后，索诺拉沙漠芽孢杆菌对生活废水的有机质降解率达70.42％以上，氨氮去除率达79.12％以上，处理效果显著；索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)CSB-5具有较强抗逆能力，可作为优良处理菌用于生活废水、养殖废水以及工业废水的处理，应用前景良好。

尽管上面已经结合示例性实施例及附图描述了本发明，但是本领域普通技术人员应该清楚，在不脱离权利要求的精神和范围的情况下，可以对上述实施例进行各种修改。

序列表

<110> 中国石油天然气集团有限公司 中国石油集团川庆钻探工程有限公司

<120> 一株索诺拉沙漠芽孢杆菌及其筛分培养方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1448

<212> DNA

<213> 索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)

<400> 1

gagggcgtgt gctataatgc agtcgagcgg accgacggga gcttgctccc ttaggtcagc 60

ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa 120

ccggggctaa taccggatgc ttgattgaac cgcatggttc aattattaaa gggggctttt 180

aacttcccct ttccgatgga cccccggcgc attaactaat tggtgaggga acggctcccc 240

aaggggacga tgcgtaaccg acctgaaagg gtgatcggcc accctgggac tgaaacacgg 300

cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360

aacaacgccg cgtgagtgat gaagggtttc ggatcgtaaa actctggtgg tagggaaaaa 420

caagtaccgg tccaataggg cggtaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480

tacctgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgkccggaat tattgggcgt 540

aaagcgcgcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600

gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 720

gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg agtgctaagt gttagagggt ttccgccctt tagtgctgca gcaaacgcat 840

taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960

ttgacatcct ctgacaaccc tagagatagg gcttcccctt cgggggcaga gtgacaggtg 1020

gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080

acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa 1140

ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200

tgctacaatg ggcagaacaa agggcagcga agccgcgagg ctaagccaat cccacaaatc 1260

tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat 1320

cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380

cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttggagccag ccgccgaagg 1440

tcacagat 1448

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(27F)

<400> 2

agagttgatc ctggctcag 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(1492R)

<400> 3

cggttacctt gttacgactt 20