一株绿木霉及其应用

一株绿木霉及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株绿木霉及其应用，特别是涉及一株耐抑制物强的绿木霉及其在制备纤维素酶方面的应用。

背景技术

纤维素是世界上最大的可再生性有机资源，每年通过全球生物合成可再生性纤维素达1000亿吨以上，但被利用的极少。将天然纤维素降解为可利用的糖类，再进一步转化为乙醇、菌体蛋白、气体燃料等物质，对解决当今世界所面临的环境污染、粮食短缺、资源紧张和能源危机等问题具有重大现实意义，而纤维素酶是降解纤维素最有效的生物催化剂。

酶解法的高成本是生物质能源工业化的主要制约因素之一。降低纤维素酶成本主要涉及降低纤维素酶产生菌培养基及发酵成本、提高纤维素酶活性等问题。因此，提供能够利用廉价原料，发酵周期短和耐受能力强的菌株产生高活性纤维素酶对木质纤维素转化为生物质能源具有重要意义。

许多细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶，其中真菌类是研究和应用最广的纤维素酶生产菌。生产纤维素酶的真菌主要有木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Asperigillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizqpus)和漆斑霉属(Myrotheeium)等，尤以木霉属类菌种居多。

CN201210408018.6公开了一株深绿木霉B-8-1-34（Trichodermaatroviride）及其在制备纤维素酶方面的应用，该菌株能够利用含有木质纤维素的工农业生产废弃物，配合麸皮、玉米浆、豆饼粉等廉价原料，通过液态或固态发酵生产纤维素酶。其液态产酶发酵培养基中当以2.5%木糖渣为碳源时，发酵66h得到粗酶液，然后用粗酶液糖化木糖渣和玉米芯48h，还原糖浓度分别达3.7%和4.4%。

CN201210295819.6公开了一种可分泌纤维素酶的菌株及其纤维素酶提取方法与应用，解决了现有产纤维素酶菌株酶活产量低的问题，该菌株为绿木霉ZY-01(TrichodermavirensZY-01)，该菌株可以用于甘蔗渣及秸秆的高效降解，分泌的纤维素酶具有较高的纤维素降解活性。

KrisztinaKovács等（Trichodermaatroviridemutantswithenhancedproductionofcellulaseandβ-glucosidaseonpretreatedwillow[J]，EnzymeandMicrobialTechnology，2008(43):48-55）报道了通过诱变获得的三株深绿木霉TUBF-1721、TUBF-1741和TUBF-1753，滤纸酶活分别达1.14FPU/mL、1.18FPU/mL和1.14FPU/mL。

林英等（产纤维素酶绿木霉F-UV₂₆₄产酶条件优化，安徽农业科学，2006，34(11)：2312-2314)对诱变菌株绿木霉F-UV₂₆₄的产纤维素酶条件进行了研究，结果表明：以l%(NH4)₂SO₄和2%酵母膏为氮源，并加入3%表面活性剂，2%的Mandels营养盐，麸皮与稻草粉比例为1:3，30℃发酵130h可达到最高酶活。

目前获得的产纤维素酶的菌株，大多数是直接采用木质纤维素原料为碳源和酶蛋白诱导物，酶蛋白产量少，分泌的纤维素酶对预处理木质纤维素底物酶解适应性不强，用于预处理木质纤维素原料的酶解，葡萄糖得率不高。为了提高产纤维素酶对预处理木质纤维素的酶解效果，可以利用预处理木质纤维素原料作为碳源和诱导物，但是，木质纤维素在预处理过程中由于糖类及木质素的降解，会释放一些微生物生长的抑制剂，有弱酸类抑制物（甲酸，乙酸，乙酰丙酸等），糠醛类抑制物（糠醛、5-羟甲基糠醛）以及酚类抑制物（香草醛，对苯二酚，4-羟基苯甲酸）等，这些抑制物尤其是酚类对菌株产纤维素酶及纤维素酶解都有一定的抑制作用，因此需要进行中和、水洗等脱毒处理，操作繁琐。如果直接采用预处理后木质纤维素原料，则由于菌体耐受能力有限，纤维素酶的产量和活性不高。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一株绿木霉F4（TrichodermavirideF4）及其应用。该菌株在以预处理木质纤维素作为碳源和诱导物生产纤维素酶的过程中，能够耐受预处理木质纤维素引入的多种抑制物，仍然可以高效产酶，分泌的纤维素酶成分全，酶活性高，用于酶解预处理木质纤维素时的耐受性强。

本发明所述的绿木霉F4，其分类命名为绿木霉（Trichodermaviride），已于2008年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.2736。

本发明所述的绿木霉F4的分生孢子梗形成金字塔式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，8-12×2.5-3.5μm；分生孢子卵形、宽椭圆形，4-5×3.5-4μm，或近球形，直径3.5-4.5μm；单个近无，聚集时呈淡绿，壁粗糙。

本发明所述的绿木霉F4菌落在PDA平板上25℃培养4天扩展5-10cm，初期白稀疏，后形成绿产孢区，反面无。该菌株可以在腐木，秸秆，有纤维素的土壤，马铃薯，玉米粉等上生长，生长最适pH值为5.0-5.5，生长最适温度为25-35℃。

本发明所述的绿木霉F4是通过富集，木块涂布筛选，滤纸涂布筛选，刚果红-CMC双层平板筛选得到的一株耐受抑制物能力强，纤维素酶成分全，酶活性高的绿木霉菌株。

本发明所述的绿木霉F4在生产纤维素酶方面的应用。所述绿木霉F4发酵生产纤维素酶的pH值为3.0-6.0，发酵温度为23-35℃，发酵时间为48-120h。

本发明所述的绿木霉F4在以预处理木质纤维素为培养基碳源和诱导物发酵生产纤维素酶方面的应用，具有耐受抑制物能力强，纤维素酶成分全，酶活性高的特点。所述的发酵培养基为：麦麸10-50g/L，预处理木质纤维素10-60g/L，微晶纤维素5-30g/L，酵母膏5-30g/L，KH₂PO₄0.1-10g/L，CaCl₂0.01-3g/L，MgSO₄0.01-3g/L，ZnSO₄·7H₂O0.01-50mg/L，MnSO₄·4H₂O0.01-20mg/L，CoCl₂0.01-50mg/L。发酵结束后，经检测发酵液中的滤纸酶活为5-15IU/ml，CMC酶活为10-20IU/ml，β-葡萄糖苷酶活为1-5IU/ml，酶产量及酶活稳定。

本发明所述的木质纤维素原料包括一切含纤维素的生物质原料，如秸秆、木屑、能源植物（如柳枝稷）和废纸等，优选为玉米秸秆。采用稀酸预处理、稀酸蒸汽爆破预处理，或其它一切可用于木质纤维素预处理过程中，提高木质纤维素酶解效果的预处理技术。稀酸预处理的条件为：酸浓度为0.5wt%-2.5wt%，干物质浓度为（可溶性固体和不可溶性固体质量之和与体系总质量的百分比，下同）10wt%-20wt%，温度115-180℃，时间5-120min。稀酸蒸汽爆破预处理的条件为：酸浓度0.5wt%-2.5wt%，干物质浓度25wt%-40wt%，温度150-180℃，时间5-20min。预处理木质纤维素挤压脱水后直接加入到发酵培养基中，挤压脱水后干物质中，木糖含量1wt%-10wt%，纤维素含量30wt%-40wt%，木质素含量15wt%-18wt%，乙酸含量0.5wt%-2wt%，甲酸含量0.1wt%-0.5wt%，5-羟甲基糠醛含量0.01wt%-0.05wt%，糠醛含量0.02wt%-0.08wt%，总酚含量0.005wt%-0.015wt%。

本发明所述的绿木霉F4在以预处理木质纤维素为培养基碳源和诱导物，发酵生产纤维素酶的过程中，当发酵10-24h后，加入山梨糖、纤维二糖、槐树粉、异麦芽糖、葡糖酸内脂等的一种或几种，再发酵48-120小时。

本发明采用绿木霉F4生产的纤维素酶在酶解预处理木质纤维素方面的应用，将发酵后粗酶液采用2-50KD超滤膜进行浓缩，浓缩10-200倍；采用浓缩的酶液对预处理木质纤维素原料进行酶解，酶加入量为0.01-0.1g/g纤维素。控制酶解体系的pH为4.8-5.2，温度为48-52℃，干物质浓度为5wt%-30wt%。酶解结束后，葡萄糖浓度为4.5wt%-15.8wt%，葡萄糖得率为83.4%-99.5%。

本发明筛选获得的绿木霉F4在以预处理木质纤维素作为碳源和诱导物生产纤维素酶过程中，能够耐受预处理木质纤维素（硒酸预处理或稀酸蒸汽爆破预处理）引入的多种抑制物（乙酸、甲酸、5-羟甲基糠醛、糠醛和酚等），在这些抑制物存在下仍然可以高效产酶，分泌的纤维素酶成分全，酶活性高，产生的纤维素酶用于酶解预处理木质纤维素时，具有耐受性强，酶解活性高。

生物材料保藏说明

本发明的绿木霉F4（TrichodermavirideF4）菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCCNo.2736；保藏日期：2008年11月10日。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细说明。本发明中，wt%为质量分数。

实施例1绿木霉F4的分离筛选

本发明绿木霉F4（TrichodermavirideF4）是从辽宁省抚顺市山顶松树根部的泥土中筛选获得的，是通过富集，木块涂布筛选，滤纸涂布筛选，刚果红-CMC双层平板筛选得到的。具体筛选过程为：

（1）将取得的泥土样品稀释，混悬于无菌水中，加入到发酵培养基中，于30℃培养72-84h；

（2）取步骤（1）的适量培养液，按10^－4，10^－5，10^－6稀释，涂布于木块上，30℃培养72h；

（3）挑选菌落大的接种于发酵培养基中，30℃培养72-84h；

（4）取适量培养液，按10^－4，10^－5，10^－6稀释，涂布于滤纸上，30℃培养72h；

（5）挑选滤纸被降解掉处的菌落，按10^－4，10^－5，10^－稀释，涂布于刚果红-CMC双层平板，30℃培养72h；

（6）挑出透明圈大的单菌落，做液态发酵实验，测定产纤维素酶能力，选择2-3株酶活高的做重复实验，获得产量最高的菌株——绿木霉F4。

发酵培养基的配方为：麦麸50g/L，预处理木质纤维素25g/L，微晶纤维素25g/L，酵母膏20g/L，KH₂PO₄0.2g/L，CaCl₂0.4g/L，MgSO₄0.4g/L，ZnSO₄·7H₂O6mg/L，MnSO₄·4H₂O2.5mg/L，CoCl₂2mg/L。其中木质纤维素原料为玉米秸秆，纤维素38.2wt%，半纤维素22.1wt%，木质素20.2wt%，灰分3.9wt%，用粉碎机粉碎至颗粒大小为1-5mm。采用稀酸蒸汽爆破进行预处理，2wt%的硫酸，干物质浓度30wt%，蒸煮温度190℃，停留时间5min。预处理后原料干物质中纤维素含量为37.3wt%，乙酸含量0.6wt%，甲酸含量0.5wt%，5-羟甲基糠醛含量0.05wt%，糠醛含量0.03wt%，总酚含量0.015wt%。

刚果红-CMC双层平板培养基配方为：KH₂PO₄1g，(NH₄)₂SO₄0.7g，MgSO₄0.3g，CaCl₂0.15g，0.5mlMandel’s营养液，定容到500ml……记为溶液⑴。

下层为200ml溶液⑴中加入4g琼脂。

上层为1gCMC，0.1g去氧胆酸钠，0.01g刚果红，溶于100ml溶液⑴中，加入1g琼脂。

实施例2绿木霉F4液态发酵产纤维素酶

以上述含抑制物的预处理玉米秸秆为碳源和诱导物，利用绿木霉F4液态发酵生产纤维素酶。具体过程如下：

（1）配制液体发酵培养基：麦麸50g/L，预处理玉米秸秆50g/L，微晶纤维素25g/L，酵母膏20g/L，KH₂PO₄0.25g/L，CaCl₂0.4g/L，MgSO₄0.4g/L，ZnSO₄·7H₂O6mg/L，MnSO₄·4H₂O2.5mg/L，CoCl₂2mg/L；

（2）将上述培养基置于500mL三角瓶中，121℃灭菌30分钟，冷却后接种绿木霉F4，30℃恒温培养24h，转速200rpm，获得种子液；

（3）将上述种子液按10%（v/v）接种量接种到发酵培养基中，30℃发酵72h；

（4）采用截留分子量大小为5KD的超滤膜对绿木霉F4发酵液进行浓缩；将910mL滤纸酶活为12.4IU/mL的发酵液浓缩30倍得到30mL浓缩的酶液，浓缩液的滤纸酶活为365IU/mL，酶活损失仅1.9%。

发酵结束后，经检测发酵液中与纤维素酶解相关的蛋白包括：外切葡聚糖酶Ⅰ，内切-1,4-β-木糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶C，外切-1,4-β-木糖苷酶，内切葡聚糖酶EG-1，阿拉伯呋喃糖苷酶/B-木糖苷酶，内切-1,4-β-木糖苷酶C，NAD(P)H依赖性D-木糖还原酶，内切-1,4-β-木糖苷酶C等。

测定FPA、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶酶活，酶活测定底物分别采用滤纸、羧甲基纤维素钠和水杨素。酶活测定使用DNS法：以在50℃，pH5.0条件下，1min催化底物水解产生相当于1μmol葡萄糖的还原糖定义为一个国际酶活力单位。水解液中的糖成分，采用高效液相谱(HPLC)法分析。

酶解得率(%)=糖液中还原糖总量(g)×0.9×100/底物中纤维素量(g)

重复4批次的上述三角瓶试验结果表明，滤纸酶活平均达到12.4IU/ml，CMC酶活平均为18.5IU/ml，β-葡萄糖苷酶活平均为1.7IU/ml。

实施例3绿木霉F4液态发酵产纤维素酶

处理工艺和操作条件同实施例2，不同之处在于：将制备的绿木霉F4种子液分别接种到5个相同的培养基中，在发酵24h后，分别加入1.5g槐树粉、山梨糖、纤维二糖、异麦芽糖、葡糖酸，再培养72小时。重复进行3个批次，检测不同样品的FPA、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶酶活，如表1所述。

表1不同样品的酶活检测结果（单位：IU/ml）

实施例4采用发酵粗酶液酶解预处理玉米秸秆

按照表2的配方在三角瓶中分别加入预处理玉米秸秆（PCS）、0.05M柠檬酸缓冲液（pH5.0）和蒸馏水，采用实施例2制备的浓缩粗酶液进行酶解，酶解的干物质浓度为20%，130r/min，50℃振荡酶解72h，控制酶解体系的总质量为50g，酶加入量为0.04、0.05、0.06、0.07、0.08g/g纤维素。根据最终葡萄糖浓度（单位：%），计算葡萄糖得率。

表2F4发酵酶液水解PCS试验条件和结果

由表2可见，采用本发明绿木霉F4菌株制备的纤维素酶液酶解预处理玉米秸秆，耐受抑制物能力强，还原糖得率高，酶解效果好。