一株高产淀粉和油脂的单针藻及其培养应用

一株高产淀粉和油脂的单针藻及其培养应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一株高产淀粉和油脂的单针藻及其培养应用。

背景技术

由于世界石油资源的枯竭和价格逐渐走高、环保问题日益严峻，以及全球气候变化引发一系列的影响，20世纪70年代以来，许多国家日益重视生物能源和生物基化学品的发展。在众多的生物质能和生物质化学品中，微藻凭借其“不与人争粮，不与粮争地”的优势得到了越来越多的关注。

藻类是最原始的生物之一，分布很广，大多数藻类生活在水中，其结构简单，具有光合效率高、生长周期短和速度快等特点。藻类包括微藻（单细胞真核生物）、大型藻（海藻）和蓝细菌（蓝绿藻）。不同藻类可通过光合作用将CO₂和水转化为O₂和大分子有机物，如碳水化合物和油脂。微藻可以利用废水中N、P等营养物质，从而降低水体的富营养化，节约水资源和营养盐成本。因此，利用非粮且可再生的微藻为原料生产能源和化学品，与其它生物质相比，一定程度上能够降低成本，同时也为微藻下游产品的开发提供了一个新的途径。

单针藻是绿藻的一种，为不规则的纺锤形，目前发现的单针藻仅用于积累油脂。CN103540533A公开了一种产油单针藻LB59的获得及应用，自野外环境分离获得，能够耐受高浓度碳酸氢钠，易于进行开放式培养，富含油脂，油脂含量可达到细胞干重的30.2%。CN103555584A公开了一种产油单针藻LB50的获得及应用，能够耐受高浓度碳酸氢钠，油脂含量可达到细胞干重的30.4%。CN104073437A公开了一种单针藻C29，其生长速度快，油脂产率高，是生产生物柴油的优良菌株；该发明还提供了一种单针藻的开放式养方法，此方法采用特定培养基培养，更利于单针藻C29的生长及油脂的积累。CN104611228A公开了一种富含油脂的单针藻（Monoraphidium sp）SS-B1及其培养应用，保藏编号为CGMCCNo.7479，该藻株能够耐受高浓度的CO₂和SO₂，可以利用含CO₂和SO₂的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，固碳效率高，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。

但是，上述单针藻仅用于生产油脂，产品单一，应用范围窄。目前还没有发现既可以高产淀粉又可以高产油脂的单针藻。

发明内容

针对现有单针藻产品单一，应用范围窄的不足，本发明提供一种高产淀粉和油脂的单针藻及其培养应用。该藻株在适宜条件下既可以高产淀粉又可以高产油脂，可以满足下游生产的不同需求，拓宽其应用范围。

本发明高产淀粉和油脂的单针藻SS-06，其分类命名为单针藻（Monoraphidium sp.），已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10765。

本发明提供的单针藻SS-06在显微镜下藻细胞呈纺锤形，绿，短轴2-4微米，长轴55-65微米。

本发明提供的单针藻SS-06的18S rDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，本发明的单针藻SS-06与已公布的单针藻的18S rDNA数据存在差异。

本发明所述单针藻SS-06的培养方法，采用的培养基可以是BG11、SE、TAP或D1等淡水微藻培养基，通气量0.1-1.0vvm，CO₂含量为1v%-3v%，光照强度为1000-10000lux，光暗比为10:14-14:10，温度为15-35℃，pH 6-11。培养结束后，收获藻细胞，测定其蛋白含量为20%-30%，脂质含量为20%-30%，淀粉含量为10%-30%。

本发明提供的单针藻SS-06在产淀粉中的应用。在富含N元素的微藻培养基中培养时，通气量0.1-1.0vvm，CO₂含量为1v%-3v%，光照强度5000-10000lux，光暗比10:14-14:10，培养至对数期，更换低N微藻培养基，并在培养基中添加0-50mmol/L的3-磷酸甘油酸，连续光照培养至稳定期。通过上述培养，有助于加速微藻对环境的适应性和快速增殖，同时也有助于提高藻细胞中的淀粉含量。

本发明提供的单针藻SS-06在产油脂中的应用。在富含N元素的微藻培养基中培养时，通气量0.1-1.0vvm，CO₂含量为1v%-3v%，光照强度5000-10000lux，光暗比10:14-14:10，培养至对数期，更换低N微藻培养基，并在培养基中添加0-10mmol/L的焦磷酸钠，连续光照培养至稳定期。通过上述培养，有助于加速微藻对环境的适应性和快速增殖，同时也有助于提高藻细胞中的油脂含量。

本发明所述的富含N元素的微藻培养基是指在常规微藻培养基中加入过量无机氮，加入量为2.0-5.0 g/L。所述低N微藻培养基是指在常规微藻培养基中加入微量无机氮，加入量为0-0.5g/L。所述的无机氮是NaNO₃、NH₄NO₃、NH₄Cl等中的一种或几种，优选为NaNO₃。

与现有单针藻相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的单针藻SS-06在适宜条件下既可以高产淀粉又可以高产油脂，可以满足下游生产的不同需求，拓宽其应用范围。

2、本发明选育的单针藻SS-06应用潜力好，环境适应性较广，适合培养温度和pH范围较广，分别是15-35℃（常见微藻培养温度为20-30℃）和pH为6-11（常见微藻pH 为7-9）。

3、本发明提供的单针藻SS-06产品经济价值高，在普通培养条件下，蛋白含量为20-30%，油脂含量为20-30%，淀粉含量为10-30%。可根据不同需求改变培养条件，从而获得高产量的油脂或淀粉。

生物材料保藏说明

本发明提供的单针藻（Monoraphidium sp.）SS-06，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 10765；保藏日期：2015年4月24日。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但不因此限制本发明。本发明中，v%为体积分数。

实施例1 分离筛选获得单针藻SS-06

（1）富集培养：2011年10月从黑龙江杜博尔特蒙古族自治县寿山休闲度假村龙虎湖采集水样，采用纱布过滤后，将100mL水样接种到200mL的BG11培养基中进行富集培养，光照强度为7000lux，温度为25℃，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10，培养约半个月后，培养基呈现明显绿，显微镜观察到大量藻体存在。所述BG11培养基的配方见表1、表2。

表1 BG11培养基

*表2 表1中A5+Co solution的组成

（2）纯藻株的获得：将富集培养的水样稀释至10^-5倍，在无菌条件下涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为7000 lux，温度为25℃，培养约10天后平板上出现绿的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养10天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得单藻落。

（3）目的藻株的获得：对获得的单藻落挑取到50mL摇瓶中进行继续培养，培养光照强度为7000lux，温度为25℃，光暗周期为24小时，光暗时间比为14:10，每天摇动至少3次，至对数生长期，以5v%的接种量接种到管式光照反应器中，培养光照强度为7000lux，通入CO₂ 3v%（v/v），连续光照。对藻株进行温度和pH驯化，先从15℃开始驯化，以5℃为一个温度梯度，同时提高培养基中的pH，从pH 6.0开始，以pH 1为一个梯度，驯化周期为3-5d；当微藻稳定后再同时提高温度和pH，如此反复，当微藻减少时,降低温度和pH，延长驯化周期，直至微藻明显减少，驯化停止，取部分液体在BG11平板上进行划线，从而获得目标藻株SS-06。

实施例2 藻株的鉴定

将获得的SS-06藻细胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18S rDNA基因测序分析结果见序列表。将18S rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Monoraphidium sp.有最大的相似性，其BLASTn值为2591，Max index值为99%，可以确定SS-06为单针藻（Monoraphidium sp.）。

实施例3 单针藻SS-06的培养应用

单针藻SS-06在管式光照反应器中进行培养，培养温度15℃，pH 6.0，光照强度为5000lux，通气量0.25vvm，CO₂ 含量为3v%，连续光照培养7天后，离心收集藻液，冷冻干燥后测得微藻生物量为2.0g/L，蛋白含量为20%，油脂含量22%，淀粉含量11%。

其中蛋白质检测方法为Bradford法测定。油脂检测方法为称量干燥的藻粉，重量计为m，放入瓷研钵中，加入适量石英砂和液氮，待液氮挥发后，研磨破壁；加入10mL乙酸乙酯:正己烷=1:1的混合有机溶剂，超声清洗仪处理20min，50-60℃恒温水浴中提取45分钟；离心15分钟，收集上清液至离心管中，重复提取两次，合并提取液；向提取液中加入等体积的蒸馏水，震荡混匀后离心4分钟，收集上层有机相至已烘干并准确称量净重（计为W1）的试管中；70-80℃水浴蒸发试管中的溶剂1.5h，70-80℃烘箱烘干至恒重，计为W2。计算藻细胞的总脂含量C（%）：C=100×(W2-W1)/m。淀粉检测方法取藻粉（W）经600 W超声破碎，超声时间1s，间歇时间2s，超声60次，得到完全破碎的藻液；调节pH到6.5，分别加入0.20 μl Liquozyme Supra 85-95℃保温液化1 h；调节pH到4.5，分别加入0.4 μl Dextrozyme DX 60℃保温液化10h，水解完全后离心弃沉淀，上清液定容100mL，检测水解液中葡萄糖含量C；以去离子水加等量酶水解为对照；淀粉含量(g/g)=C(g/L)×V(L)×0.9/W(g)。

实施例4 单针藻SS-06在生产淀粉中的应用

挑取平板单藻落在50mL摇瓶中光照培养至对数期，以5v%接种到富含N元素的微藻培养基中培养，通气量0.25vvm，CO₂含量为1v%-3v%，光照强度5000-10000lux，光暗比14:10，培养至对数期，更换无氮微藻培养基，并在培养基中添加20mmol/L的3-磷酸甘油酸，连续光照培养至稳定期。所述的富含N元素的微藻培养基是指在BG11培养基中加入3.0g/L NaNO₃；无N微藻培养基是指采用常规的BG11培养基。

表3 不同培养条件下淀粉含量

序号 CO ₂含量 光照强度/lux 光暗比 温度/℃ pH 淀粉产量/%占细胞干重

1 1v% 5000 14:10 15 6 15.3

2 2v% 8500 14:10 25 8 29.5

3 3v% 10000 14:10 35 11 20.1

实施例5 单针藻SS-06在生产油脂中的应用

挑取平板单藻落在50mL摇瓶中光照培养至对数期，以5v%接种到富含N元素的微藻培养基中培养，通气量0.25vvm，CO₂含量为1v%-3v%，光照强度5000-10000lux，光暗比14:10，培养至对数期，更换低氮微藻培养基；并在培养基中添加3mmol/L的焦磷酸钠，连续光照培养至稳定期。所述的富含N元素的微藻培养基是指在BG11培养基中加入3g/L NaNO₃；低N微藻培养基是指在BG11培养基中加入0.2g/L NaNO₃。

表4 不同培养条件下油脂含量表

序号 CO ₂含量 光照强度/lux 光暗比 温度/℃ pH 油脂产量/%占细胞干重

1 1v% 5000 14:10 15 6 28.7

2 2v% 7000 14:10 25 8 32.5

3 3v% 9000 14:10 35 11 27.4

综上可知，本发明筛选的单针藻SS-06可根据不同需求改变培养条件，从而获得高产量的油脂或淀粉。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国石油化工股份有限公司

中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院

<120> 一株高产淀粉和油脂的单针藻及其培养应用

<130> 新专利申请

<170> PatentIn version 3.5

<211> 1418

<212> DNA

<213> Monoraphidium sp.

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa ctgcttatac 60

tgtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagttta tttgatggta cctctacacg 120

gataaccgta gtaattctag agctaatacg tgcgtaaatc ccgacttctg gaagggacgt 180

atttattaga taaaaggccg accgagcttt gctcgacccg cggtgaatca tgataacttc 240

acgaatcgca tagccttgtg ctggcgatgt ttcattcaaa tttctgccct atcaactttc 300

gatggtagga tagaggccta ccatggtggt aacgggtgac ggaggattag ggttcgattc 360

cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc gcgcaaatta 420

cccaatcctg atacggggag gtagtgacaa taaataacaa taccgggcat ttaatgtctg 480

gtaattggaa tgagtacaat ctaaatccct taacgaggat caattggagg gcaagtctgg 540

tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat ctaagttgtt gcagttaaaa 600

agctcgtagt tggatttcgg gtgggttcca gcggtccgcc tatggtgagt actgctgtgg 660

ccctcctttt tgtcggggac gggctcctgg gcttcattgt ccgggactcg gagtcgacga 720

tgatactttg agtaaattag agtgttcaaa gcaagcctac gctctgaata ctttagcatg 780

gaatatcgcg ataggactct ggcctatctc gttggtctgt aggaccggag taatgattaa 840

gagggacagt cgggggcatt cgtatttcat tgtcagaggt gaaattcttg gatttatgaa 900

agacgaacta ctgcgaaagc atttgccaag gatgttttca ttaatcaaga acgaaagttg 960

ggggctcgaa gacgattaga taccgtcgaa gtctcaacca taaacgatgc cgactaggga 1020

ttggaggatg ttcttttgat gacttctcca gcaccttatg agaaatcaaa gtttttgggt 1080

tccgggggga gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca 1140

ggcgtggagc ctgcggctta atttgactca acacgggaaa acttaccagg tccagacata 1200

gtgaggattg acagattgag agctctttct tgattctatg ggtggtggtg catggccgtt 1260

cttagttggt gggttgcctt gtcaggttga ttccggtaac gaacgagacc tcagcctgct 1320

aaatatgtca cattcgcttt ttgcggatgg ccgacttctt agagggacta ttggcgttta 1380

gtcaatggaa gtatgaggca ataacaggtc tgtgatgc 1418