一种制备具有确定15N丰度的N2O及基于15N同位素示踪法测量氮循环的方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用微紫青霉菌制备具有确定15N丰度的N2O 及基于15N同位素示踪法测量氮循环的方法。

15N同位素示踪技术是我们开展氮素循环的研究最有效方法，它能区分氮素各周转 过程(矿化、硝化、反硝化等)的速率和通量。目前对于15NO3--N和15NO2--N的检测，是通过添加 化学试剂 (如盐酸羟胺)，将硝态氮和亚硝态氮还原成15N2O气体进行测定。在此方法中，需 要用标准的15N2O气体进行校准。而目前15N2O 的制备方法主要是将以15N标记的亚硝酸盐为 原料通过化学还原反应生成。但是此方法存在较大问题：一是亚硝酸盐不稳定，储存过程中 极易被氧化成硝酸盐，影响15N2O的含量及丰度；二是产生的15N2O气体不易保存，只能现配现 用。

通过微生物的反硝化作用也可以产生N2O，长期以来，人类一直认为只有细菌才能 进行反硝化反应，细菌反硝化作用的产物主要是N2，然而在1972年，人类首次发现担子菌门 和子囊菌门中也存在反硝化活性，还发现一些以前被认为严格好氧的尖孢镰刀菌等多种真 菌也能进行反硝化作用。真菌是一种真核生物，与细菌相比具有更为复杂的结构，是土壤氮 循环过程中的重要参与者之一。相比细菌的反硝化作用，这些真菌的独特之处就在于真菌 中存在P450(细胞素P450，一氧化氮还原酶)，可利用NADH (还原性辅酶I)或NADPH(还原 性辅酶II)作为直接电子供体将NO还原为N2O。目前关于真菌反硝化作用的研究多集中于真 菌对土壤N2O释放的贡献，还未见有利用真菌生产制备具有确定丰度的15N2O的研究。

本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种利用微紫青霉菌，通 过添加具有确定15N丰度的NaNO3为底物，从而快速、准确的制备具有确定15N丰度的N2O气体， 操作简便，成本经济。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：

一种微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)菌株，已于2017 年8月7日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保存编号为CGMCC No.14146(保藏地 址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101， 电话： 010-64807355，：cgmcc@sun.im.ac)。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述的微紫青霉菌制备具有确定15N丰度的 N2O的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、菌种筛选：采集土壤样品，稀释后进行菌株的培养、测气筛选和鉴定；

S2、菌种确认：将筛选得到的微紫青霉菌菌株分别接种到具有一系列不同15N丰度 NaNO3的察氏液体培养基中，振荡培养后收集产生的N2O，加入碱液吸收除去其中的CO2，使用 同位素质谱仪测定N2O的15N丰度，并绘制标准曲线，标准曲线线性良好，表明步骤S1中的微 紫青霉菌可以用于制备具有确定15N丰度的 N2O；

S3、具有确定15N丰度的N2O的制备：使用具有确定15N丰度的NaNO3配置察氏液体培 养基，并接种步骤S2中的微紫青霉菌菌株，振荡培养后收集产生的N2O，加入碱液吸收除去 其中的CO2，即得到具有确定15N丰度的N2O。

作为优选，所述土壤样品来自杭州龙井茶园。

作为优选，所述稀释为将土壤样品使用去离子水分级稀释至 10-5倍。

作为优选，所述分级稀释的具体过程为，采取杭州龙井茶园土壤样品5g至灭菌后 的100mL三角瓶中，加入45mL灭菌去离子水，旋涡震荡1min得到土壤混悬液即为10-1倍稀释 液；然后分别将盛有9mL灭菌去离子水的4支试管按10-2到10-5的顺序进行编号，用移液试管 吸取1ml 10-1倍稀释液至编号为10-2的试管中，轻轻吹吸三次，使悬液充分混匀，得到10-2倍 稀释液；以此类推，重复转移、混匀操作，完成编号10-3到10-5的试管的稀释，得到10-5倍稀释 液。

作为优选，所述步骤S1中菌株的培养为将稀释后的土壤样品涂布于察氏固体培养 基上，分离出真菌单菌落并接种到察氏液体培养基中，振荡培养。

作为优选，所述步骤S1中振荡培养的温度为28～32℃，转速为150～200rpm。

作为优选，所述步骤S1中测气筛选的具体过程为，分别在振荡培养1、3、7天后，使 用温室气体测定仪器测定产生N2O气体的含量，筛选得到N2O气体含量较高的菌株。

作为优选，所述鉴定为根据平板菌落形态和ITS测序对筛选得到的菌种进行鉴定。

本发明利用从土壤中筛选得到的微紫青霉菌，通过添加具有确定15N丰度的NaNO3 为底物，可快速、准确的制备具有确定15N 丰度的N2O气体，操作简便，成本经济。本发明中的 微紫青霉菌 (Penicillium janthinellum)是一种产N2O真菌，来源于杭州龙井茶园土壤样 品，通过分离、测气、纯化筛选得到，菌落表面有褶皱，菌丝初为白逐渐变为淡紫，分生 孢子梗顶端形成扫帚状的分支，分生孢子椭圆形，表面光滑，能以硝酸钠为氮源底物，通过 反硝化作用生成N2O，且具有较高的产气量。本发明采用标准曲线法确认筛选得到的菌种在 不同15N丰度下是否能够完全将 NaNO3中的15N完全转化为15N2O，经测定，标准曲线线性良好， 筛选得到的微紫青霉菌适于生产具有确定15N丰度的N2O。

作为优选，将步骤S1和S2中筛选得到的微紫青霉菌菌株于 0～5℃下斜面冷藏保 存。使用时，将冷藏保存的微紫青霉菌菌株接种到固体平板上活化生长，在28～32℃下扩大 培养2.5～3.5天。

作为优选，所述察氏固体培养基包括以下含量的成分：NaNO3 1.8～2.2g，K2HPO4 0.8～1.3g，KCl 0.4～0.6g，MgSO4 0.4～0.6g，FeSO4 0.01g，蔗糖27～32g，琼脂15～20g，水 1000ml，察氏固体培养基配制完成后在115～126℃下灭菌17～23min。

作为优选，所述察氏液体培养基包括以下含量的成分：NaNO3 1.8～2.2g，K2HPO4 0.8～1.2g，KCl 0.4～0.6g，MgSO4 0.4～0.6g，FeSO4 0.01g，蔗糖27～32g，水1000ml，察氏 液体培养基配制完成后在 115～126℃下灭菌17～23min。

作为优选，所述步骤S2和步骤S3中的振荡培养的过程为，在25～32℃下以150～ 200rpm转速振荡培养2.5～3.5天。

作为优选，所述步骤S2和步骤S3中的碱液为1.5～2.5mol/L 的NaOH溶液。

本发明的第三目的在于提供一种基于15N同位素示踪法测量氮循环的方法，对氮循 环过程中的15NO3--N和15NO2--N进行检测，使用如权利要求2～8中任一权利要求所述的方法 制备的具有确定15N丰度的N2O为标准气体对检测结果进行校准。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：利用筛选得到的微紫青霉菌，以具有 确定15N丰度的NaNO3为底物，获得具有确定15N丰度的N2O气体，产气快速、准确，且操作简便、 成本低，产气真菌可以重复利用，耗能低，减少了气体保存和运输成本，可根据需要制备具 有确定15N丰度的N2O气体；采用本发明制备的确定15N丰度的N2O气体作为标准气体用于氮素 循环的研究，对氮素循环过程中15NO3-和15NO2-中的氮元素进行定性和定量检测，避免了传统 使用氧化还原法制备15N2O原料不稳定影响15N2O的含量及丰度的问题，其结果准确度和精确 度高。

图1为不同15N丰度NaNO3产生的N2O的15N丰度的标准曲线。

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并 不限于这些实施例。

实施例1

(1)、按照以下成分组成配制查式固体培养基：NaNO3 2g， K2HPO4 1g，KCl 0.5g， MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖30g，琼脂18g，水1000ml，配制完成后在121℃下灭菌20min；

按照以下成分组成配制查式液体培养基：NaNO3 2g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖30g，水1000ml，配制完成后在121℃下灭菌20min。

(2)菌种筛选：

采集杭州龙井茶园土壤样品5g至灭菌后的100mL三角瓶中，加入45mL灭菌去离子 水，旋涡震荡1min得到土壤混悬液即为 10-1倍稀释液；然后分别将盛有9mL灭菌去离子水的 4支试管按 10-2到10-5的顺序进行编号，用移液试管吸取1ml 10-1倍稀释液至编号为10-2的 试管中，轻轻吹吸三次，使悬液充分混匀，得到 10-2倍稀释液；以此类推，重复转移混匀操 作，完成编号10-3到 10-5的试管的稀释，得到10-5倍稀释液；

将10-5倍稀释液涂布于察氏固体培养基上，分离出真菌单菌落并接种到察氏液体 培养基中，在30℃下以150～200rpm转速振荡培养，分别在振荡培养1、3、7天后，使用温室气 体测定仪器测定产生N2O气体的含量，筛选得到N2O气体含量较高的菌种，再根据平板菌落形 态和ITS测序对筛选得到的菌种进行鉴定，经鉴定为微紫青霉菌；

将筛选得到的微紫青霉菌于4℃下斜面冷藏保存。

(3)、菌种确认：

将冷藏保存的微紫青霉菌接种到固体平板上活化生长，在 30℃下扩大培养3天， 然后将微紫青霉菌分别接种到具有0％、 1％、2％、5％15N丰度NaNO3的察氏液体培养基中， 在28℃下以 180rpm转速振荡培养3天后收集产生的N2O，加入5mL 2.0mol/L 的NaOH溶液。 吸收除去其中的CO2，使用同位素质谱仪测定N2O 的15N丰度，测定结果如表1所示，并绘制标 准曲线(如图1所示)，由图1可知，标准曲线线性良好(R2＝1)，说明步骤S1中的微紫青霉菌 能够制备具有确定15N丰度的N2O，由于大自然中存在微量的15N，因此当NaNO3的15N丰度为0 时，产生的N2O 的15N丰度并不为0。

表1：不同15N丰度NaNO3产生的N2O的15N丰度

NaNO 3的 15N丰度 N 2O的 15N丰度

0 0.3645％

1％ 1.3066％

2％ 2.2265％

5％ 5.006％

(4)、具有确定15N丰度的N2O的制备：

根据需要使用具有确定15N丰度的NaNO3配置察氏液体培养基，并接种微紫青霉菌， 在28℃下以180rpm转速振荡培养3天后收集产生的N2O，加入5mL2.0mol/L的NaOH溶液吸收 除去其中的CO2，即得到具有确定15N丰度的N2O。

实施例2

本实施例与实施例1的区别仅在于，查式固体培养基的成分组成为：NaNO3 1.8g， K2HPO4 0.8g，KCl 0.4g，MgSO4 0.4g，FeSO4 0.01g，蔗糖27g，琼脂20g，水1000ml，配制完成 后在126℃下灭菌17min；

查式液体培养基的成分组成为：NaNO3 1.8g，K2HPO4 0.8g， KCl 0.4g，MgSO4 0.4g，FeSO4 0.01g，蔗糖27g，水1000ml，配制完成后在126℃下灭菌17min。

实施例3

本实施例与实施例1的区别仅在于，查式固体培养基的成分组成为：NaNO3 2.2g， K2HPO4 1.3g，KCl 0.6g，MgSO4 0.6g，FeSO4 0.01g，蔗糖32g，琼脂15g，水1000ml，配制完成 后在115℃下灭菌23min；

查式液体培养基的成分组成为：NaNO3 2.2g，K2HPO4 1.3g， KCl 0.6g，MgSO4 0.6g，FeSO4 0.01g，蔗糖32g，水1000ml，配制完成后在115℃下灭菌23min。

实施例4

本实施例与实施例1的区别仅在于，菌种筛选过程中振荡培养的温度为28℃，转速 为200rpm。

实施例5

本实施例与实施例1的区别仅在于，菌种筛选过程中振荡培养的温度为32℃，转速 为150rpm。

实施例6

本实施例与实施例1的区别仅在于，菌种筛选过程中筛选得到的微紫青霉菌冷藏 保存的温度为0℃。

实施例7

本实施例与实施例1的区别仅在于，菌种筛选过程中筛选得到的微紫青霉菌冷藏 保存的温度为5℃。

实施例8

本实施例与实施例1的区别仅在于，菌种确认的步骤中，扩大培养的温度为28℃， 培养时间为3.5天，振荡培养的温度为 25℃，培养时间为3.5天，转速为200rpm。

实施例9

本实施例与实施例1的区别仅在于，菌种确认的步骤中，扩大培养的温度为32℃， 培养时间为2.5天，振荡培养的温度为 32℃，培养时间为2.5天，转速为150rpm。

实施例10

本实施例与实施例1的区别仅在于，具有确定15N丰度的N2O 的制备步骤中，振荡培 养的温度为25℃，时间为3.5天，转速为 150rpm。

实施例11

本实施例与实施例1的区别仅在于，具有确定15N丰度的N2O 的制备步骤中，振荡培 养的温度为32℃，时间为2.5天，转速为 200rpm。

实施例12

本实施例与实施例1的区别仅在于，NaOH溶液的浓度为 1.5mol/L。

实施例13

本实施例与实施例1的区别仅在于，NaOH溶液的浓度为 2.5mol/L。

实施例14

对氮素循环过程中的15NO3--N和15NO2--N进行检测，并使用实施例1中制备的具有确 定15N丰度的N2O为标准气体对检测结果进行校准，分别进行5次平行试验。

对比例1

采用15N标记的亚硝酸盐为原料通过化学还原反应生成的N2O为标准气体对检测结 果进行校准，分别进行5次平行试验。

本发明筛选得到的微紫青霉菌，产气快速、准确，采用的实施例1中的微紫青霉菌， 按照真菌的干重计算为：培养7天每克干重产N2O气体累计为57.2g/L；按照血清瓶计算，接 种微紫青霉菌于液体查氏培养基中，在培养的1,3,7天测定其N2O释放量，结果如下表所示：

培养天数 每瓶N 2O释放量mg/L

0 0

1 34

3 740

7 6858

比较实施例14和对比例1，实施例14中的检测结果与真值之间的偏差均小于0.01μ g，精密度CV小于0.7％，而对比例1的检测结果与真值之间的偏差为0.02-0.06μg，精密度CV 大于0.8％

综上所述，为了避免传统使用化学方法制备15N2O过程中原料不稳定，造成产物含 量和丰度不准确且不易保存的问题，创造性使用筛选出的产N2O量大的微紫青霉菌来进行15N2O的制备，操作简单快速，成本低，制得的N2O具有确定的15N丰度，使用本发明制备的具有 确定15N丰度的N2O作为标准气体对氮素循环过程中的15NO3--N和15NO2--N的检测结果进行校 准，准确度和精确度均较传统氧化还原法制备的标准气体明显提高，有利于在科学研究中 得到准确的结论。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领 域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替 代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。