景天根际铅抗性菌株普罗维登斯菌,筛选方法及其应用

本发明涉及一株从景天根际分离的铅抗性菌株普罗维登斯菌 (Providencia sp.)BPb7及其在植物-微生物联合修复铅重金属污染土壤 中的应用。

土壤是人类获取食物和其它再生资源的物质基础，是人类赖以生 存的自然环境和农业生产的重要资源。

环境污染物的排放量与日俱增，环境污染和生态破坏给土壤带来 了严重的污染，其中重金属污染的面积在不断增加，这不仅退化土壤 肥力，降低农产品的产量和品质，而且恶化水环境，并通过食物链危 及人类的生命健康。据粗略统计，过去50年中全球排放到环境中的铅， 达到7.83×105吨。目前，全球平均每天排放铅约500万吨，其中有相 当部分进入了土壤，从而使部分地区的土壤遭到污染，破坏了生态系 统的正常功能，也对人体健康造成了危害。铅在人体内和蛋白质及各 种酶发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器 官中累积，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体急性中毒、亚 急性中毒、慢性中毒等危害。对重金属污染土壤的治理和修复是一项 十分紧迫的任务。

20世纪90年代以后，许多学者注意到了植物和微生物共存体系对 重金属超积累的重要性，植物根系-微生物系统的相互促进作用将是提 高污染土壤生物修复能力的一个活跃领域。微生物是土壤的重要组成 部分，参与土壤生态系统的物质循环与能量转换过程，对提高土壤肥 力和维持土壤生态平衡具有重要意义。在污染土壤中接种微生物能够 促进植物对营养元素与重金属的吸收，同时微生物能够分泌一些生长 调节剂和保护植物的抗生素、抑菌剂和螯合剂等，这些物质都能增强 植物对环境的适应能力。

因此，分离具有较强铅耐受性和促进植物修复铅污染土壤的细菌 对植物-微生物联合修复铅重金属污染土壤具有现实意义和重要的工程 应用价值。

本发明的技术目的在于筛选景天根际具有较强铅耐受性的细菌。

因此，本发明的第一方面涉及一株从景天根际分离的铅抗性菌株 普罗维登斯菌(Providencia sp.)BPb7，其于2014年12月1日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.10085。

优选地，所述景天根际铅抗性菌株Providencia sp.BPb7的16S  rDNA基因序列如SEQ ID NO：3所示，GenBank数据库中没有与其一 致的序列，且本菌株16S rDNA基因序列并未提交GenBank数据库。

本发明的第二方面涉及上述的景天根际铅抗性菌株Providencia sp. BPb7的筛选方法，其包括步骤：

(1)选择生长状况良好的景天植株进行处理：取铅(Pb)溶液母 液2.5ml，稀释定容至40ml，均匀浇灌在生长供试植物的土壤中，使土 壤的铅含量达到1000mg·kg-1；在胁迫的条件下继续培养30d，每间隔 4d浇水40ml；

(2)菌种的分离、纯化与筛选：在经过处理的植物根际取10g土 样，置于90ml装有玻璃珠的细菌培养基中，在37℃恒温振荡器上150×g 振荡20-30min后取下，静止5min，使土壤沉淀；在沉淀以上的各个层 面进行多次取样，接入新的细菌培养基中，37℃培养24h；取富集后的 菌悬液，用倍数稀释法将其涂布于筛选培养基的平板上，倒置于37℃ 恒温培养箱中，培养48h；肉眼观察，分别挑选不同形态的典型单菌落， 在培养皿底做好标记，并挑取单菌落在新的筛选培养基上划线分离； 反复进行以上步骤，直至得到菌落特征一致的纯菌种；

(3)对于筛选出的已纯化菌种进行保存：将分离纯化得到的菌种 接种于细菌培养基，培养后加入60％(v/v)甘油，使甘油的终浓度为10％ (v/v)，置于-80℃进行保存。

其中所述细菌培养基为:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏 水1000mL，pH7.0；

所述筛选培养基的配制方法如下：基础培养基为细菌培养基 1000ml，添加微量元素液和维生素液各10ml，121℃灭菌20min，冷却 至70℃，加入铅溶液母液，使培养基中铅含量为1000mg·L-1，37℃培 养。

其中微量元素液为：MnSO40.01g，ZnSO40.05g，H3BO30.01g， CaCl20.01g，定容至1L，4℃避光保存；维生素液为：肌酸0.025g， 抗坏血酸0.025g，核黄素0.025g，柠檬酸0.02g，定容至1L，4℃避 光保存；铅溶液母液为：Pb(CH3COOH)2·3H2O配制成Pb2+浓度为 200mg·ml-1的母液，过滤除菌后，室温保存。

本发明的第三方面涉及含有上述的景天根际铅抗性菌株 Providencia sp.BPb7的组合物。

优选地，所述组合物具有较强的铅耐受性。

本发明的第四方面涉及上述的景天根际铅抗性菌株Providencia sp. BPb7及所述组合物在植物-微生物联合修复铅重金属污染土壤中的用 途。

本发明的第五方面涉及上述的景天根际铅抗性菌株Providencia sp. BPb7及所述组合物在处理含重金属铅的污染物中的用途。优选地，所 述污染物为被污染的土壤。

利用本发明的筛选方法从铅胁迫的景天植物根际土壤中分离筛选 出的铅抗性菌株Providencia sp.BPb7，其于2014年12月1日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号 为CGMCC No.10085；其建议的分类命名为普罗维登斯菌属 Providencia sp.；其为革兰氏阴性菌，需氧杆菌，无鞭毛、无荚膜。该 菌株对重金属铅有较强的耐性，对植物-微生物联合修复铅重金属污染 土壤具有现实意义和重要的工程应用价值。

本领域技术人员公知，在本发明所获得的上述景天根际铅抗性菌 株Providencia sp.BPb7新种的基础上，本领域技术人员可以对所述细 菌进行适当的诱变而继续提高其耐受重金属铅的能力，这样的诱变后 的基于本发明所述菌种的突变株也落入本发明保护的范围。所述诱变 包括辐射、化学诱变等。同时，本领域技术人员也可能将本发明获得 的上述菌株与其他植物共同使用，以达到最佳植物-微生物联合修复重 金属铅污染土壤的目的。

图1：菌株Providencia sp.BPb7的16S rDNA序列。

图2：菌株Providencia sp.BPb7的透射电镜照片。

图3：菌株Providencia sp.BPb7生长曲线图。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术 人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修 改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料 如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例1景天根际铅抗性菌株Providencia sp.BPb7的分离

材料与方法

1、培养基

细菌培养基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL， pH7.0。

配制筛选培养基：基础培养基为细菌培养基1000ml，添加微量元 素液和维生素液各10mL，121℃灭菌20min，冷却至70℃左右，加入 铅溶液母液，使培养基中铅含量为1000mg·L-1；37℃培养。

其中微量元素液为：MnSO40.01g，ZnSO40.05g，H3BO30.01g， CaCl20.01g，定容至1L，4℃避光保存。维生素液为：肌酸0.025g， 抗坏血酸0.025g，核黄素0.025g，柠檬酸0.02g，定容至1L，4℃避 光保存。铅溶液母液：Pb(CH3COOH)2·3H2O配制成Pb2+浓度为 200mg·mL-1的母液，过滤除菌后，室温保存。

2、样品采集和菌株分离

选择生长状况良好的景天植株进行处理。取重金属Pb溶液母液 2.5mL,稀释定容至40mL，均匀浇灌在供试植物的土壤中，使土壤的铅 含量达到1000mg·kg-1。在胁迫的条件下继续培养30d，每间隔4d浇水 40mL。在经过处理的植物根际取10g土样，置于90mL装有玻璃珠的 细菌培养基中，在37℃恒温振荡器上150×g振荡20-30min后取下，静 止5min，使土壤沉淀。在沉淀以上的各个层面进行多次取样，接入新 的细菌培养基中，37℃培养24h。取富集培养后的菌悬液，用倍数稀释 法将其涂布于筛选培养基的平板上，倒置于37℃恒温培养箱中，培养 48h。肉眼观察，分别挑选不同形态的典型单菌落，在培养皿底做好标 记，并挑取单菌落在新的筛选培养基上划线分离。反复进行以上步骤， 直至得到菌落特征一致的纯菌种，至此完成菌种的分离、纯化与筛选 工作。对于筛选出的已纯化菌种进行保存：将分离纯化得到的菌种接 种于细菌培养基，培养后加入60％(v/v)甘油，使甘油的终浓度为10％ (v/v)，置于-80℃进行保存。分离获得一株对重金属铅有较强的耐性的 细菌，命名为BPb7。

实施例2菌株BPb7的菌种鉴定

1、基因组DNA提取

按照常规技术手段大量培养上述菌株BPb7，然后获取其基因组 DNA。

2、菌株BPb7的16S rDNA的鉴定方法

2.1菌株BPb7的16S rDNA的PCR扩增、测序及系统发育树的构建

2.1.116S rDNA基因序列的PCR扩增

扩增16S rDNA基因序列的两端引物选用通用引物：正向引物 BSF8/20：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO：1)和反 向引物BSR1541/20：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(SEQ ID  NO：2)。PCR反应体系为50μL，反应条件为94℃变性5min；接下来 进行35个循环反应：94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸90s；然后 72℃再延伸10min，最后于4℃保存。

2.1.2扩增产物的克隆及序列测定

PCR产物用TAKARA公司生产的Vector克隆试剂盒进
行克隆，先将16S rDNA基因片段纯化，连接到Vector载体
上，5μL连接反应液转化感受态细胞DH5α，并用菌落PCR进行鉴定。
重组子的基因序列由上海生工生物工程技术服务有限公司测定。

2.2菌株BPb7的16S rDNA的鉴定结果

2.2.1菌株BPb7的16S rDNA基因序列

扩增菌株BPb7的16S rDNA基因序列，得到了长度约1.5kb的扩增 片段。扩增片段经胶回收、连接、克隆后测序，测得菌株BPb7的16S  rDNA为1624bp(SEQ ID NO：3，同时请见图1)，该序列未提交NCBI 数据库。

2.2.2BPb716S rDNA基因序列的相似性比较

将BPb716S rDNA的序列输入到NCBI数据库中，运用Blast程序 将这株细菌的16S rDNA和数据库中的16S rDNA基因序列进行比对， 从数据库中挑选与BPb7的16S rDNA基因序列具有较高相似性的菌 株，见表1。

从表1中可以得出，菌株BPb7的16S rDNA与和Providencia  vermicola strain FFA6、Providencia vermicola strain CICR-SPBB、 Providencia vermicola strain OP1、Enterobacteriaceae bacterium MB6-1 和Providencia sp.XW16菌株的相似性都比较高，均可以达到99％以上， 且多数为Providencia属的成员。这说明菌株BPb7为Providencia  vermicola的一个新亚种。

表1菌株BPb716S rDNA序列NCBI同源性检索结果

3.菌株Providencia sp.BPb7生理生化分析

3.1形态特征

采用日本日立公司H-7650型号透射电子显微镜对菌株BPb7进行了 电镜观察。该透射电镜分辨率为0.2nm，加速电压为40kV～120kV，放 大倍率(连续放大模式为×200～×600000；低倍模式为×50～×1000)。 菌株BPb7的透射电镜观察照片见图2。菌株BPb7呈革兰氏染阴性， 需氧杆菌，有菌毛、无荚膜，直径约0.6μm，长度约1.3-1.8μm，其菌 落的形态特征见表2。

表2 BPb7菌株菌落的形态特征

菌种 形状 直径(mm) 颜 边缘 表面 粘稠度 透明度

BPb7 圆形 1-2mm 黄 整齐 光滑 不粘稠 不透明

3.2生理生化分析

对菌株BPb7进行了生理生化分析，其分析结果见表3。糖酵解试 验分析结果见表4。

表3 Providencia sp.BPb7的生理生化试验分析

注：“+”阴性“-”阴性

表4 Providencia sp.BPb7的糖酵解分析

糖酵解分析 Providencia sp.BPb7 糖酵解分析 Providencia sp.BPb7

葡萄糖 + 蔗糖 +

乳糖 - 麦芽糖 +

半乳糖 + 果糖 +

木糖 -    

注：“+”表示产酸，“—”表示不产酸。

3.3Providencia sp.BPb7生长曲线

将Providencia sp.BPb7菌株接种于LB液体培养基中活化24h，取 500μL接种于100mLLB液体培养基中，将三角瓶置于37℃恒温振荡器 150×g进行培养。每隔2h取样一次，以未接菌的LB液体培养基为空 白对照，用分光光度计比法测定600nm波长下细菌悬浮液的吸光值， 连续测定36h。以培养时间为横坐标，OD600为纵坐标，绘制细菌生 长曲线(见图3)。

从图3可知，菌株BPb7从接种后4小时内处于迟缓期，4-22小时 为对数生长期，22小时后进入平台期。

4.Providencia sp.BPb7菌株促进景天吸收重金属铅的能力

通过菌剂盆栽实验测定菌株对植物吸收铅的促进作用。实验结果如表5所示。

表5不同铅浓度处理对景天叶片铅含量的影响

从表5可以看出，在景天根部添加了JPb5菌剂后，植株对铅的吸收量明显增 加。在不同的铅处理浓度(200，400，600，800，1000mg/kg-1)下，投加BPb7 菌剂后，景天植物叶片铅含量均比未投加时高，分别提高铅含量百分比为1.6％， 4.82％，3.66％，4.81％，15.16％。说明BPb7菌剂可以提高景天吸收铅的能力。

景天根际铅抗性菌株或含有景天根际铅抗性菌株的组合物在处理 含重金属铅的污染物或植物-微生物联合修复铅重金属污染土壤中的应 用。