一株维斯假丝酵母及其应用

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株维斯假丝酵母菌及其在发酵产木糖醇上的应用。

木糖醇是一种五碳糖醇，以玉米芯和甘蔗渣农业废弃物为主要原料生产，可作为功能性甜味剂和高级疗用食品，目前已经广泛应用于食品、医药、口腔保健、工业制造、烟草制品、家庭调味品和化妆品等多个领域。

木糖醇的生产工艺有化学合成法和生物转化法。化学法的基本原理为D-木糖在镍催化剂作用下加氢制得木糖醇。目前国内木糖醇生产企业均采用化学合成法生产木糖醇。但化学合成工艺存在以下缺点：高温高压反应（115-135℃，6.5 Mpa）；易燃易爆高压氢气；镍催化剂对溶剂纯度要求较高，提高了木糖分离纯化的难度；资本性投资较高；高污染。

生物转化法过程温和，能耗低，操作安全，避免重金属催化剂的污染，食品安全性好，是木糖醇生产技术未来发展方向。目前有报导的木糖醇发酵菌株主要包括热带假丝酵母和基因工程重组的酿酒酵母。中国专利201510760091.3公开了一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法，所述构建方法制备的酿酒酵母SEB6菌株木糖发酵生产木糖醇的性能优越，木糖醇的产率高；同时避免了现有酿酒酵母菌株表达时外源基因丢失、表达水平低的问题。中国专利20140612154.6公开了一株产木糖醇的菌株及其产木糖醇的方法，以木糖为唯一碳源的发酵培养基中对热带假丝酵母（Candida tropicalis ）SK36.001进行发酵，以得到含有木糖醇的发酵液；然后从含有木糖醇的发酵液中分离纯化木糖醇。

中国专利200910243239.0公开了一种用于油田采出水处理的维氏假丝酵母，能降解高矿化度采出水中原油和有机物。中国专利201410067073.2公开了一种利用维斯假丝酵母为发酵菌株，通过发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法。目前尚无维斯假丝酵母发酵法生产木糖醇的文献报道。

本发明为现有技术提供一株维斯假丝酵母（Candida viswanathii）菌株用于以木糖为底物通过生物转化法生产木糖醇。

本发明的技术目的通过以下技术方案实现：

本发明第一方面的技术目的是提供一株维斯假丝酵母（Candida viswanathii）FE-T1，已于2008年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 2734。

本发明提供的维斯假丝酵母在显微镜下的形态为椭圆形或圆柱形，牙殖，在液体培养基中成沉淀性生长，固体培养菌落为奶酪，表面粗糙有褶皱，粘湿，边缘整齐。

本发明第二方面的技术目的是提供上述维斯假丝酵母在木糖醇发酵中的应用。

本发明的维斯假丝酵母在液体发酵培养基中好氧生长，以微氧发酵生产木糖醇。

进一步的，利用本发明的维斯假丝酵母生产木糖醇时，以木糖为碳源，浓度为20-80g/L。

进一步的，所述碳源还包括辅助碳源，选自葡萄糖、木糖、半乳糖、麦芽糖和纤维二糖的一种或几种，浓度为1-20g/L。

进一步的，利用本发明的维斯假丝酵母生产木糖醇具体步骤如下：

（1）将所述维斯假丝酵母菌接种在固体培养基斜面上，28-37℃静置培养12-48h；

（2）将步骤（1）培养的维斯假丝酵母菌从斜面上接种到摇瓶种子培养基中，28-37℃培养12-48h；

（3）将步骤（2）摇瓶中振荡培养的种子培养液以2%-20%的接种量接入到液体发酵培养基中，28-37℃，通气1-2vvm，200-600r/min培养12-48h，然后降低通气量为0.1-1vvm，降低转速为50-300r/min进行微氧发酵，发酵过程中控制pH为5.5-8.5。

进一步的，所述液体培养基中包括碳源、氮源和无机盐。

进一步的，所述液体培养基中的氮源包括有机氮源和无机氮源。有机氮源选自是酵母膏、蛋白胨、玉米浆，或豆粕水解液中的一种或几种，优选豆粕水解液，浓度0.1-10g/L。无机氮源选自醋酸铵、硝酸钠和硫酸铵中的一种或几种，优选硫酸铵，浓度0.1-10g/L。

进一步的，所述液体培养基中的无机盐包括但不限于磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁和氯化钙中的一种或几种，浓度0.04-4g/L。

进一步的，所述液体培养基的初始pH为5.5-8.5。

进一步的，所述种子培养基和液体发酵培养基成分相同，固体培养基在液体培养基基础上加入1%-2%的琼脂。

进一步的，本发明维斯假丝酵母产木糖醇采用的发酵工艺可以采用现有技术中常用的发酵方法，包括批次发酵、批次补料发酵、连续发酵、固定化细胞发酵和休止细胞发酵等。

进一步的，本发明维斯假丝酵母发酵优选采用通气搅拌发酵，初始阶段好氧培养，该阶段主要为细胞生长阶段，自然pH，控制温度为28-37℃，通气1-2vvm，转速200-600 r/min，培养时间12-48h。

进一步的，本发明维斯假丝酵母微氧发酵阶段控制pH5.5-8.5，通气量为0.1-1vvm，转速为50-300r/min，发酵时间48-96h。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明为现有技术提供一种可利用木糖发酵生产木糖醇的维斯假丝酵母，利用微生物细胞内的木糖还原酶将木糖还原为木糖醇，氢来自细胞内的NAD(P)H和氢离子，与化学合成法相比，无需氢气。

图1是维斯假丝酵母FE-T1的显微镜照片（放大倍数400倍）

图2是维斯假丝酵母FE-T1在固体培养基上的菌落形态照片。

生物材料保藏说明

本发明提供的维斯假丝酵母（ Candida viswanathii）FE-T1菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 2734；保藏日期： 2008年11月10日。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

维斯假丝酵母FE-T1菌株的筛选过程：

从辽宁省抚顺市的森林土壤中采集腐殖质样品，并在消毒试管中加入无菌水悬浮，充分混匀，然后静置1h，取上清接种到含有60g/L木糖，5g/L酵母膏和5g/L蛋白胨的培养基中培养，然后利用液相谱检测发酵产物，选择发酵产物中有木糖醇的培养物涂布上述液体培养基加20g/L琼脂制备的固体平板培养基上，30℃静置培养3d，挑取单菌落在相同液体培养基中培养4d，选择培养液中木糖醇浓度最高的单菌落保藏备用，命名为FE-T1。

筛选得到的维斯假丝酵母在显微镜下的形态为椭圆形或圆柱形，牙殖，在液体培养基中成沉淀性生长，固体培养菌落为奶酪，表面粗糙有褶皱，粘湿，边缘整齐。如图1和图2所示。

实施例2

菌株的鉴定：

通过生理生化鉴定和18S rDNA分析，生理生化鉴定结果见表1，基因序列测定结果见序列表。

表1

注 ：“+”表示阳性反应或能利用 ；“－”表示阴性反应或不能利用。

实施例3-7

利用维斯假丝酵母FE-T1产木糖醇发酵：

发酵培养基成分：酵培养基氮源组成为木糖80g/L，硫酸铵0.5g/L，酵母粉0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.3 g/L和氯化钙0.3g/L，初始pH为5.5，在121℃下灭菌15min。利用5L发酵罐发酵，装液量3L.

改变好氧培养阶段和微氧发酵阶段不同的条件，发酵结果见表2。

表2

序列表

<110> 中国石油化工股份有限公司

中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院

<120> 一株维斯假丝酵母及其应用

<130> 新专利申请

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1560

<212> DNA

<213> Scenedesmus sp.

<400> 1

aaccgtggta attctagagc taatacatgc ttaaaatccc gactgtttgg aagggatgta 60

tttattagat aaaaaatcaa tgccttcggg ctctttgatg attcataata acttttcgaa 120

tcgcatggcc ttgtgctggc gatggttcat tcaaatttct gccctatcaa ctttcgatgg 180

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