抗虫蛋白Cry 3Bb杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用

本发明涉及生物工程领域，抗虫蛋白Cry 3Bb杂交瘤细胞株1G4 2D1及其产生的抗体和应用。

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药；分泌的抗虫蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：Cry和Cryδ-内毒素。其中Cry蛋白对多种有害昆虫(如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，线虫类和原生生物等)幼虫具有毒性。Cry毒素已经被转入农作物使其具有抗虫性。Cry 3Bb蛋白是Cry毒素中的一种。目前转Cry基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。

转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因作物及其衍生物中Cry 3Bb蛋白进行快速分析，研究并得到抗Cry 3Bb蛋白的单克隆抗体具有非常大的意义。。

本发明的目的在于提供一种杂交瘤细胞株1G4 2D1及其产生的抗体和制备方法，其分泌的单抗为实现抗虫蛋白Cry 3Bb在转基因作物中的检测奠定基础。

为实现上述目的，本发明提供了杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的生物保藏编号为CGMCC No.22343。

具体的，杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：

a)通过原核表达得到Cry 3Bb重组蛋白；

b)免疫动物：将Cry 3Bb重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；

c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；

d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。

其中，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比例为1:5-1:10。

本发明还提供一种前述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。

具体的，杂交瘤细胞株1G4 2D1所产生的单克隆抗体通过间接ELISA检测所得到的效价为1:2800000。

杂交瘤细胞株1G4 2D1所产生的单克隆抗体可变区重链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示序列，轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示序列，所示序列为：

本发明还提供了上述单克隆抗体在Cry 3Bb抗虫蛋白定性、定量Western检测中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请利用工程菌株表达、纯化得到的高纯度抗虫蛋白Cry 3Bb作为抗原，通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗Cry 3Bb的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株1G4 2D1，所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价分别为1:2800000，所述单抗可以特异识别原核表达的重组Cry 3Bb蛋白及转基因玉米中的内源Cry 3Bb蛋白，分泌抗Cry 3Bb抗虫蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因作物中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。

保藏信息

本发明提供的杂交瘤细胞株1G4 2D1，已于2021年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.22343。

图1是根据本发明的杂交瘤细胞株1G4 2D1纯化的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳结果图；

图2是根据本发明的杂交瘤细胞株1G4 2D1所产生的单克隆抗体滴度；

图3是根据本发明的杂交瘤细胞株1G4 2D1所产生的单克隆抗体特异性检测转基因玉米中的Cry 3Bb Western结果图。

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。

实施例1杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫抗原的制备

1.1重组蛋白Cry 3Bb片段表达菌株构建、菌体培养及裂解

Cry 3Bb片段编码基因扩增：以转基因玉米基因组DNA为模板，用高保真Fastpfu进行PCR扩增，以下列的引物：

扩增到的PCR产物经(1.0％)琼脂糖凝胶电泳鉴定后，酶切、连接到pET28a质粒，转化Trans10感受态细胞(北京全式金)，挑取克隆，进行菌落PCR鉴定，阳性克隆由北京六合华大基因公司进行测序。

将鉴定正确的重组表达载体pET28a-Cry3Bb转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养。次日在平板上挑取单克隆接种含相同浓度卡那霉素的液体LB培养基中，于37℃过夜培养。所得的表达菌株菌液与50％的甘油溶液等体积混匀，于-80℃冻藏。

将保存的重组蛋白Cry 3Bb表达菌株复苏培养，菌液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养。挑取单克隆接种液体LB(含卡那霉素)培养基中37℃过夜培养。第二天以1％接种量接种，于37℃培养至OD600为0.8左右，加入IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白。诱导结束将菌液冰浴，于4℃，4000rpm，10min离心收集菌体，弃上清，菌体经PBS洗涤后用裂解液悬浮；超声破碎(2s on/4s off，Amp：45％，Time：3min)；4℃15000rpm离心1hr，收集上清。

1.2重组蛋白纯化

菌体裂解液上清与经裂解液平衡的Ni Sepharose 6FF Beads(GE Healthcare)混合，于4℃结合2-3hrs，3000rpm离心3min弃上清；已结合蛋白的Ni Sepharose 6FF beads经清洗液洗2-3次；再用洗脱液洗脱。收集洗脱液即为蛋白粗纯溶液。

将亲和纯化得到的蛋白样品透析至蛋白储存溶液，并用经相同溶液平衡的Superdex 200Increase 10/30GL(GE Healthcare)进一步纯化，收集蛋白峰组分并经SDS-PAGE检测蛋白样品的纯度，经过凝胶过滤最后获得电泳纯的Cry3Bb蛋白片段，分子量约为43kDa。

2.免疫动物

用步骤1.2质控合格的Cry 3Bb重组蛋白片段作为抗原免疫8只8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠(购置于湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018)，抗原与等体积完全弗氏佐剂(首免)和不完全弗氏佐剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫，2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期2周，之后进行效价检测，高于>1:10000后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于250μL的PBS中，具体免疫次数及免疫剂量如表1所示：

表1免疫次数及免疫剂量

免疫示例：一免中，将50ug的抗原溶于PBS，然后与佐剂按体积1:1混合。

3.细胞融合

末次冲击3天后，收集阳性对照血，取脾脏，制备成单细胞悬液；处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合(1:5-1:10)，50％PEG1450作用1min，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再用含20％胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×107/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5％CO2，37℃下培养。

4.细胞建株

1)融合板检测：

待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测，在ELISA质控合格(即阴性对照OD450<0.2，阳性对照OD450>1.0)后挑选阳性孔(一般OD450≥0.5)作亚克隆。

2)亚克隆方法及检测：

挑出融合板中检测阳性值高(OD450>2.0)的孔进行有限稀释，以每板60％的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，每次亚克隆5-7天即可进行ELISA检测，直到最终筛选出能稳定分泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。

3)细胞株建立：

将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株，扩大培养于24孔板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用ELISA梯度稀释及western-blotting验证其稳定性，Cry 3Bb单抗杂交瘤细胞株1G4 2D1分泌的单抗能特异检测到内源样本和重组蛋白Cry 3Bb，收集细胞扩大于10cm培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出OD450>2.0的1株细胞株培养于细胞瓶中，进行冻存，即杂交瘤细胞株1G4 2D1，已于2021年5月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.22343。

4)细胞株冻存鉴定在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定，鉴定标准：

①复苏活细胞数≥100万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50万/株；③复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细菌.真菌.支原体等)出现；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清也需作ELISA(OD450>2.0)，以确定是否分泌阳性抗体的同时做western-blotting的鉴定，通过图3可知，Cry 3Bb单抗杂交瘤细胞株1G4 2D1分泌的单抗能特异检测到内源样本和重组蛋白Cry 3Bb。

5制备腹水

先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后分别将杂交瘤细胞株1G42D1接种到小鼠腹腔中，细胞定株后扩大培养选用10％胎牛血清培养基，当细胞密度达到以1×106-2×106/mL时，800rpm离心，收集沉淀，并用PBS重悬后，腹腔注入到小鼠(液体石蜡)体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。

6抗体纯化

收集后的腹水经过预处理后选用Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，具体步骤如下：

1)缓冲液：起始缓冲液为pH7.0，20mM磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为pH2.7 0.1mM甘氨酸盐酸。

2)准备收集管：取1.5mL离心管，每支离心管加70μL pH9.0 1M Tris-HCL。

3)样品准备：经50％SAS沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜，并经0.22μm微孔滤膜滤过。

4)纯化过程：用足够的起始缓冲液(8-10mL)平衡Protein A-琼脂糖亲和层析柱(HiTrap Protein A 1mL，Pharmacia Biotech)。取待纯化的样品(每毫升样品含蛋白10.2-21.1mg)15-25mL上柱，流速为0.5mL/min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液7-8mL、洗脱缓冲液6-7mL、起始缓冲液5mL洗涤，每管1mL收集洗脱液。

5)纯度及活性鉴定纯化的单克隆抗体(McAb)用SDS-PAGE鉴定其纯度，详见图1，杂交瘤细胞株1G4 2D1单克隆抗体经纯化去除几乎所有杂蛋白，有2条特异性主条带(55kDa和30kDa)。

7.单克隆抗体的效价测定

以重组蛋白Cry 3Bb为抗原，用间接ELISA方法检测纯化单抗效价，通过图2可知，经ELISA测定，纯化得到的1G4 2D1单抗滴度为1:2800000。

表2杂交瘤细胞株1G4 2D1所产生的单克隆抗体的浓度

单抗杂交瘤细胞编号 抗体(IgG)浓度 1G4 2D1 5.5mg/mL

8.单克隆抗体特异性检测

分别提取转基因玉米及其其转化亲本内源蛋白，跑SDS-PAGE胶，转膜用纯化单抗(1G4 2D1)作为一抗，Alexa FlurorTM 680goat anti-mouse IgG(H+L)(Invitrogen)为二抗，用Odyssey infrared740 imager(9120,Li-COR Biosciences,Lincolin,NE)红外扫描仪western检测结果，通过图3可知，纯化得到的1G42D1单抗能特异识别内源样本中的Cry3Bb。

其中，转基因玉米蛋白提取方法:

组织液氮速冻，磨碎，加1mL(按样品量，一般0.5g加1-2mL)蛋白提取液，4℃混匀30分钟，(12,000rpm 4℃离心15min，取上清)，蛋白提取液配方见表4：

表4蛋白提取液配方

成分 用量 1M Tris,pH 7.5 500uL 1M NaCL 1.5mL 0.5M EDTA 20uL 50％glycerol 2mL 10％SDS 1mL 双蒸水(DDH₂O) 配成10mL 蛋白酶抑制剂(Roche) 用时添加一片 1mM PMSF(苯,Sigma) 用时添加50uL

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 抗虫蛋白Cry 3Bb杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Cys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcagccatat gtggccctcc gacgccgacc cctgg 35

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacacactcg agtcacagct ggacggggat gaactc 36