一种海蛇毒的质控方法及其应用

本发明属于生物制药领域，涉及一种海蛇毒的质控方法，特别涉及一种用蛇毒蛋白分析技术监控蛇毒质量的方法；此外，本发明还涉及该质控方法的应用，有利于免疫马匹的海蛇毒的质量稳定性和批次一致性，保证抗海蛇毒血清产品的质量稳定和安全有效。

毒蛇咬伤常见于亚热带和热带地区。在亚洲、非洲、拉丁美洲和大洋洲的农村地区，毒蛇咬伤是特别突出的公共卫生问题，我国的蛇伤发病呈现出逐年增多的趋势。

毒液多为淡黄或乳白半透明黏稠状液体，成分达100多种。每种蛇毒含有多种不同的毒性成分，各种毒性组分在不同蛇毒中含量有较大差异，同种毒蛇的毒性组分可因地域分布、季节性、蛇龄等不同而异。蛇毒组分由酶、多肽、糖蛋白和金属离子等组成，其中毒性蛋白质达数十种，蛋白类占蛇毒总量的90％～95％以上。蛇毒可对机体神经系统、血液系统、肌肉组织、循环系统、泌尿系统、内分泌系统、消化系统等产生损害作用。

本研究的对象为海蛇毒，其成分复杂，含有多种蛋白，主要包括磷脂酶A2、三指毒素、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、血管内皮生长因子、蛇毒因子、蛋白酶抑制剂、磷脂酶B等。海蛇毒的组成成分与海蛇咬伤后的临床症状有直接关系，包括肌肉麻痹、呼吸麻痹、肌肉损伤等。

世界卫生组织(WHO)强调抗蛇毒血清是蛇伤的唯一有效的解毒药（WHO:Guidelines for the management of snakebites）。抗蛇毒血清是毒蛇咬伤的高效、特效药物，一般认为在被毒蛇咬伤后应立即注射同种蛇毒抗血清以达到最佳中和效果。在明确毒蛇种类后，采取相应的救治措施，迅速使用抗蛇毒血清中和体内蛇毒，防治可能发生的并发症。由于毒蛇咬伤如不及时有效救治常致人死亡，针对本文所述海蛇毒，应用抗海蛇毒血清进行。

抗海蛇毒血清是利用脱毒的海蛇毒素免疫马匹，所得血浆经胃蛋白酶消化、硫酸铵沉淀、明矾沉淀、超滤等纯化步骤得到的马抗海蛇毒免疫球蛋白。为了生产出海蛇毒中毒的特效药抗海蛇毒血清，需要对海蛇毒进行检测分析，以便更好的对海蛇毒进行质控。

目前研究蛇毒分析或鉴定的技术包括凝集测试法、酶联免疫吸附法、适配子技术、聚合酶链反应等。凝集试验属于免疫学检测方法，需要将抗原与抗血清混合，使二者发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物。但是，凝集测试法存在检测灵敏度不高、正确检出率偏低和交叉反应明显的问题。有学者揭示了酶联免疫法鉴定蛇毒蛋白时存在严重的交叉反应，对于蛇毒的质控或鉴定非常不利。适配子技术存在操作过程十分复杂繁琐的缺点，如《一种利用适配子技术检测鉴定蛇毒种类的方法》（中国发明专利申请CN102323400A）。聚合酶链反应是从DNA的角度去鉴定，但是相关研究较少报道。目前还未有简单、有效、可靠的方法对海蛇毒进行质量控制，保证海蛇毒的质量和批次一致性。

发明专利申请CN 110426522 A公开了一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法及其应用，采用SDS-PAGE电泳结合质谱法的方法进行圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定，该鉴定方法可明确鉴定蛋白的种类，但是仪器设备昂贵，测试时间较长。

因此，本领域亟需研发一种新的方法来克服上述传统方法的缺陷，本发明提供一种更为简便且有效的方法，即高效液相谱法，更加快速对蛇毒的蛋白进行对比和鉴别。

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种海蛇毒的质控方法，该方法更为简便且有效，更加快速对蛇毒的蛋白进行对比和鉴别，且成本低、可操作性强。

本发明要解决的技术问题之二在于提供该海蛇毒的质控方法在制备海蛇毒中毒的抗海蛇毒血清中的应用。本发明可对海蛇毒进行质控，进而生产出海蛇毒中毒的特效药抗海蛇毒血清，对保证抗海蛇毒血清产品安全有效、质量可控，具有十分重要的意义。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供一种海蛇毒的质控方法，包括如下步骤：

（1）选择产地为中国的海蛇毒素（含平颏海蛇毒和青环海蛇毒）冻干粉，溶解后配制成蛋白质溶液；海蛇毒素也可称为海蛇蛇毒；

（2）进行不同波长的高效液相谱分析。

作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述溶解后配制成蛋白质溶液的配方为：2.8-3.6g 氯化钠，4.2-4.5g硼酸，0.40-0.50g四硼酸钠，加注射用水定容至1L，pH值为6.0-8.0。

所述溶液A的配方优选为：3.5g 氯化钠，4.2g硼酸，0.49g四硼酸钠，加注射用水定容至1L，pH值为 7.2。

作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所配制成蛋白质溶液的浓度为5-25mg/mL，更优选为10-15mg/mL的蛋白质溶液。

作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述高效液相谱分析，紫外吸收波长为215nm、280nm。

作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述高效液相谱分析，上样量为20 μl。

作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述高效液相谱分析，高效液相谱分析柱为G3000SWxl。

作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述高效液相谱分析，高效液相谱分析流速为0.4-0.8 ml/min。更优选为0.5-0.6 ml/min。

此外，本发明还提供所述的一种海蛇毒的质控方法在制备海蛇毒中毒的抗海蛇毒血清中的应用。通过不同批次来源的海蛇毒进行高效液相谱分析，对海蛇毒进行质量控制。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明可对海蛇毒进行实验室质量控制和对比，准确地对海蛇毒进行质控，进而生产出海蛇毒中毒的特效药抗海蛇毒血清，对保证抗海蛇毒血清产品安全有效、质量可控，具有十分重要的意义。

本发明相比于传统的凝集测试法、酶联免疫法等，创新点在于：

（1）首次用两种波长高效液相谱的方法检测和分析了产地中国的海蛇蛇毒。

（2）通过检测和分析，平颏海蛇毒在215nm和280nm出峰分别为13个和7个，青环海蛇毒在215nm和280nm出峰分别为12个和9个，通过这种检测方法能够简单有效地对蛇毒进行质控。

（3）相比发明专利申请CN 110426522 A公开了一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法及其应用，采用SDS-PAGE电泳结合质谱法的方法进行圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定，该鉴定方法可明确鉴定蛋白的种类，但是仪器设备昂贵，测试时间较长。本发明提供一种更为简便且有效的方法，即高效液相谱法，更加快速对蛇毒的蛋白进行对比和鉴别，且成本低、可操作性强。

图1A为本发明实施例1中平颏海蛇毒在波长为215nm的高效液相谱分析图谱。

图1B为本发明实施例1中平颏海蛇毒在波长为280nm的高效液相谱分析图谱。

图1C为本发明实施例1中青环海蛇毒在波长为215nm的高效液相谱分析图谱。

图1D为本发明实施例1中青环海蛇毒在波长为280nm的高效液相谱分析图谱。

图2A为本发明实施例2中平颏海蛇毒在波长为215nm的高效液相谱分析图谱。

图2B为本发明实施例2中平颏海蛇毒在波长为280nm的高效液相谱分析图谱。

图2C为本发明实施例2中青环海蛇毒在波长为215nm的高效液相谱分析图谱。

图2D为本发明实施例2中青环海蛇毒在波长为280nm的高效液相谱分析图谱。

本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。

实施例1 一种海蛇毒的质控方法

步骤如下：

（1）配制海蛇毒溶解液A（简称溶液A），即3.5g 氯化钠，4.2g硼酸，0.49g四硼酸钠，加注射用水定容至1L，pH值调整为 7.2；

（2）用上述溶液A溶解海蛇毒素（包括平颏海蛇毒和青环海蛇毒）冻干粉，配制成蛋白浓度为13mg/ml的蛋白质溶液；

（3）选择分析柱G3000SWxl，调节流速0.6 ml/min，平衡40-60 min至基线平稳不再波动；

（4）溶解后的蛋白质溶液经0.22 μm滤膜过滤后，放入样品架，设置上样体积20 μl。

（5）读取吸光度的波长，设定为双波长215 nm、280 nm。

（6）开始运行序列，进行海蛇毒样品的高效液相谱分析。

结果如图1A、图1B、图1C、图1D所示，通过检测和分析，平颏海蛇毒在215nm和280nm出峰分别为13个和7个，青环海蛇毒在215nm和280nm出峰分别为12个和9个。

实施例2 一种海蛇毒的质控方法在制备海蛇毒中毒的抗海蛇毒血清中的应用

步骤如下：

（1）海蛇蛇毒（包括平颏海蛇毒和青环海蛇毒）冻干粉，采用实施例1制备的溶液A溶解后，进行高效液相谱分析；

（2）将高效液相谱分析结果（图2A、图2B、图2C、图2D）与已有的图谱（图1A、图1B、图1C、图1D）比对，确认蛋白在215 nm和280 nm的出峰个数，平颏海蛇毒在215nm和280nm出峰分别为13个和7个，青环海蛇毒在215nm和280nm出峰分别为12个和9个。；

（3）将已经进行质控分析的海蛇蛇毒经甲醛脱毒后，免疫马匹；

（4）免疫海蛇蛇毒的马匹，经单采血浆机采血后，转移至生产部进行抗海蛇蛇毒血清的生产，得到抗海蛇蛇毒血清原液和产品。

以上抗海蛇蛇毒血清的生产流程，从源头上进行蛇毒种类的鉴别，控制海蛇蛇毒的质量和类型，为生产合格的抗海蛇蛇毒提供有力的保证。