甲酸基单细胞蛋白菌株MA5及其应用

本发明属于微生物和发酵技术领域，涉及甲酸基单细胞蛋白菌株MA5及其应用。

作为人口大国的中国，蛋白质的需求量非常巨大。中国作为全世界最大的蛋白质进口国，每年花费在蛋白质进口方面的费用高达1500亿元，其中主要包括进口大豆蛋白和动物蛋白。但由于植物和动物具有较长的生长周期，这无疑大大增加了动物蛋白和植物蛋白的生产成本。而单细胞蛋白的应用则避免了这个问题，单细胞蛋白即利用微生物代谢生产蛋白，然后将微生物菌体制成干粉添加在饲料或其他可食用物质里。单细胞蛋白具有丰富的氨基酸种类，营养丰富，而且微生物能够将无机氮转化为有机氮，这相较于植物和动物蛋白来说，即降低了生产成本又环保。

甲酸是重要的一碳化合物，可以通过物理化学方法固定二氧化碳获得，属于廉价碳源，其途径包括电化学还原和氢化。另外，甲酸作为一种食品添加可以用于食品生产。

目前尚未见以甲酸作为碳源以生产蛋白的微生物菌种。

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供甲酸基单细胞蛋白菌株MA5。

本发明另有一个目的是提供一种用于生产单细胞蛋白质的方法。

本发明另有一个目的是提供一种单细胞蛋白质产品。

本发明另有一个目的是提供一种食物或饲料产品。

本发明再有一个目的是提供所述的甲酸基单细胞蛋白菌株MA5于利用甲酸或甲酸钠生产食物或饲料中的应用。

为此，本发明提供的技术方案为：

甲酸基单细胞蛋白菌株MA5，包括：该甲酸基单细胞蛋白菌株MA5，其分类命名：副球菌Paracoccus communis，菌株副球菌Paracoccus communis MA5被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.21106，保藏时间为：2020年11月05日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明称为甲酸基单细胞蛋白菌株MA5及其应用。MA5菌株菌体呈短杆状，多数情况下成对出现，属于革兰氏阴性菌，兼性厌氧型，在甲酸培养基上培养24h后菌落形态呈现淡黄，表面光滑湿润，周围呈辐射状。

用于生产单细胞蛋白质的方法，包括如下步骤：

1)将甲酸基单细胞蛋白菌株MA5于接种于培养基中进行培养；

2)以步骤1)中生长的副球菌的生物质的形式从培养基中收获单细胞蛋白质。

优选的是，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法中，所述培养于温度26℃～40℃和pH6.5～8.5条件下，培养6～168h。更优选的是，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法中，所述培养于温度37℃和pH7条件下，培养24h。

优选的是，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法中，所述培养中，采用的所述培养基仅以甲酸或甲酸钠作为唯一碳源，或其他甲酸基化合物也可。

优选的是，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法中，所述培养中，所述培养基中碳源和氮源的比例为6.8～10.6:1。

优选的是，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法中，所述培养中，采用的所述培养基以有机氮源或者无机氮源作为氮源，所述有机氮源包括但不限于牛肉膏、蛋白胨或酵母粉或者其不同组合，所述无机氮源包括但不限于氨水、硫酸铵、氯化铵、尿素等及其组合。

优选的是，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法中，所述培养中，培养基包含：甲酸钠或甲酸5g/L，酵母粉8g/L，氯化钠0.5g/L，六水氯化镁0.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化钾0.5g/L和磷酸二氢钾0.2g/L。

单细胞蛋白质产品，其包含来自所述的甲酸基单细胞蛋白菌株MA5的蛋白质。

食物或饲料产品，其包含来自所述的甲酸基单细胞蛋白菌株MA5的蛋白质。

所述的甲酸基单细胞蛋白菌株MA5于利用甲酸或甲酸钠生产食物或饲料中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明中，采用5L发酵体系对甲酸基单细胞蛋白菌株MA5进行发酵，结果表明在酵母粉存在条件下菌株MA5的生物量达到14.1g/L，蛋白含量达到49.1％，甲酸的消耗速率最高时达到了0.84g/L/h。甲酸基单细胞蛋白菌株MA5可高效利用甲酸产蛋白质，可作为候选菌株以期为利用甲酸或甲酸基化合物生产动物饲料提供理论基础。

本发明以甲酸或甲酸基化合物为唯一碳源的高效转化甲酸生产蛋白的微生物菌种MA5，在利用甲酸的基础上生产高附加值的蛋白，为绿、低成本生产单细胞蛋白提供技术支撑。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

图1为本发明MA5 16SrDNA系统进化树图；

图2为本发明中pH值对MA5单细胞蛋白产量的影响图；

图3为本发明中温度对MA5单细胞蛋白产量的影响图；

图4为本发明中不同碳源浓度对MA5单细胞生物量和蛋白产量的影响图；

图5为本发明中不同氮源对MA5单细胞生物量和蛋白产量的影响图；

图6为本发明中不同碳氮比对MA5单细胞蛋白产量的影响图。

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供的甲酸基单细胞蛋白菌株MA5，该甲酸基单细胞蛋白菌株MA5，其分类命名：副球菌Paracoccus communis，菌株副球菌Paracoccus communis MA5被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.21106，保藏时间为：2020年11月05日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。MA5菌株菌体呈短杆状，多数情况下成对出现，属于革兰氏阴性菌，兼性厌氧型，在甲酸培养基上培养24h后菌落形态呈现淡黄，表面光滑湿润，周围呈辐射状。

本发明还提供用于生产单细胞蛋白质的方法，包括如下步骤：

1)将甲酸基单细胞蛋白菌株MA5于接种于培养基中进行培养；

2)以步骤1)中生长的副球菌的生物质的形式从培养基中收获单细胞蛋白质。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法，所述培养于温度26℃～40℃和pH6.5～8.5条件下，培养6～144h。在上述方案中，作为优选，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法，所述培养于温度37℃和pH7条件下，培养24h。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法，所述培养中，采用的所述培养基仅以甲酸或甲酸钠作为唯一碳源，或其他甲酸基化合物也可，所述甲酸钠或甲酸的浓度为0.5g/L～25g/L。更优选的是，甲酸钠或甲酸的浓度为2g/L～14g/L。最优选的是甲酸钠或甲酸的浓度为5g/L。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法，所述培养基中，碳源和氮源的比例为6.8～10.6:1。更优选的是，培养基中的碳氮比为7～7.9。最优选的是，培养基中碳氮比为7.20:1。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法，采用的所述培养基以有机氮源或者无机氮源作为氮源，所述有机氮源包括但不限于牛肉膏、蛋白胨或酵母粉或者其不同组合，所述无机氮源包括但不限于氨水、硫酸铵、氯化铵、尿素等及其组合。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述的用于生产单细胞蛋白质的方法，所述培养中，培养基包含：甲酸钠或甲酸5g/L，酵母粉8g/L，氯化钠0.5g/L，六水氯化镁0.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化钾0.5g/L和磷酸二氢钾0.2g/L。

单细胞蛋白质产品，其包含来自所述的甲酸基单细胞蛋白菌株MA5的蛋白质。

食物或饲料产品，其包含来自所述的甲酸基单细胞蛋白菌株MA5的蛋白质。

本发明还提供所述的甲酸基单细胞蛋白菌株MA5于利用甲酸或甲酸钠生产食物或饲料中的应用。

本发明以甲酸钠作为碳源从东寨港红树林自然保护区土样中筛选获得一株高效利用甲酸的菌株。采用16SrDNA序列分析方法，该菌株鉴定为副球菌(Paracoccus communisMA5)。采用5L发酵体系对MA5的进行发酵，结果表明在菌株MA5的生物量达到14.1g/L，蛋白含量达到49.1％，甲酸的消耗速率最高时达到了0.84g/L/h。MA5可高效利用甲酸产蛋白质，可作为候选菌株以期为利用甲酸生产动物饲料提供理论基础。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

本发明将以甲酸或甲酸钠为唯一碳源筛选高效转化甲酸生产蛋白的微生物菌种，并优化其发酵条件，在利用甲酸或甲酸钠的基础上生产高附加值的蛋白，为绿、低成本生产单细胞蛋白提供技术支撑。

1材料与方法

1.1样品来源

土样来自海南东寨港红树林自然保护区和中国科学院天津工业生物技术研究所。

1.2培养基

筛选培养基：甲酸钠或甲酸5g/L，氯化钠0.5g/L，六水氯化镁0.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，氯化铵0.2g/L，自然pH。

种子培养基

LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。

发酵培养基

甲酸发酵培养基：甲酸钠或甲酸5g/L，氯化钠0.5g/L，六水氯化镁0.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，酵母粉2g/L。

甲酸固体培养基为甲酸发酵培养基中添加：琼脂18g/L。

1.3耐甲酸菌株初筛

分别称取1g土样、2片叶子、1mL海水加入到甲酸筛选培养基中，摇瓶培养48h后，取50μL菌液接种在固体筛选培养基中，37℃培养至长出单菌落为止。

1.4耐甲酸菌复筛

将初筛得到的菌株连续转接三次甲酸固体培养基，最后得到的菌落接种到液体的甲酸发酵培养基中，摇瓶培养48h后保存菌株。

1.5培养基优化

1.5.1pH值对MA5单细胞蛋白产量的影响

本发明所有液液转接都按照1％接种量操作，将MA5从种子培养基转接到甲酸发酵培养基中，设定初始的pH值为6.5、7、7.5、8、8.5，在摇床培养24h后，600nm处测定菌液浓度。

1.5.2温度对MA5单细胞蛋白产量的影响

转接MA5于pH为7的甲酸发酵培养基中，温度设计五个梯度，分别为26℃、30℃、35℃、37℃、40℃，在摇床培养24h后，600nm测定菌液浓度。

1.5.3不同碳源浓度对MA5单细胞蛋白产量的影响

MA5接种于pH为7甲酸发酵培养基中，培养温度设为37℃的，碳源浓度设为5个梯度，分别为2g/L、5g/L、8g/L、11g/L、14g/L，在摇床培养24h后，600nm处测定菌液浓度并离心收集菌体，利用考马斯亮蓝法在595nm处测定蛋白含量。

1.5.4不同氮源对MA5的生长和蛋白产量的影响

将MA5接种于pH为7，甲酸钠浓度为5g/L的发酵培养基中，培养温度设为37℃，分别用氯化铵、硝酸钠、硫酸铵、尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉作为氮源培养目的菌株，在摇床培养24h后，600nm处测定菌液浓度，595nm处测定蛋白含量。

1.5.5不同碳氮比对MA5单细胞蛋白产量的影响

将MA5接种于pH为7，甲酸钠浓度为5g/L，酵母粉作为氮源的发酵培养基中，培养温度设为37℃，酵母粉照碳氮比(摩尔比)10.53:1、7.86：1、7.20:1、6.98:1、6.79:1的比值分别添加，在摇瓶培养24h后，600nm处测定菌液浓度，595nm测定蛋白含量。

1.6 5升体系发酵

以发酵培养基为基础，接种前手动流加甲酸，使培养基中含有5g/L的甲酸，然后流加氨水调节pH至7，温度保持在37℃，起始转速设为200rpm，发酵培养基为3L，甲酸添加量调为自动，每24h流加一次酵母粉，使培养基中含有8g/L的酵母粉。

1.7 16SrDNA提取及菌种鉴定

利用菌落PCR方法提取16SrDNA，操作方法：挑取单菌落于10μL无菌水中，然后制备25μL的PCR体系，体系包括1μL上游引物，1μL下游引物，12μLtaq mix，11μL无菌水+样本。

PCR程序：95℃预变性10min；35个循环，每个循环参数为：95℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸90s；最后72℃延伸5min。

引物使用的是16SrDNA通用引物，引物序列如下：

27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO:1)

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO:2)

PCR得到的产物交由华大基因测序，在NCBI上将测序得到的结果与Genebank数据库中公开的16SrDNA序列进行同源性比对，然后用MEGA-X软件进行系统发育树分析。

1.8分析检测方法

1.8.1培养基内甲酸含量测定

本发明利用高效液相谱法测定溶液中甲酸的含量。实验方法如下：

流动相：5mmoL/L硫酸

柱子：有机酸柱

流速：0.5mL/min

时间：20min

样品预处理：用10mmoL/L硫酸稀释样品，使样品pH呈酸性，pH＝1-2

1.8.2生物量测定

菌体发酵完成后，将菌液在8000rpm，10min条件下离心收集菌体，收集到的菌体经过生理盐水洗涤三次，蒸馏水洗涤一次后放入冷冻干燥机中处理24h，然后称量菌粉，记录数据。

1.8.3考马斯亮蓝法测定单细胞蛋白质含量

经过多次试验，最终确定操作方法如下：菌体用生理盐水洗涤三次，再用蒸馏水洗涤一次(目的是将发酵液完全洗净)在清洗后的细胞沉淀中加入10mL蒸馏水，然后在超声破碎仪上破碎，破碎方案：破碎功率为270W，超声3s，停7s，超声10min；得到澄清透明的溶液后，取1mL样品与5mL 0.1moL/L的氢氧化钠混匀在沸水中煮沸10min得到反应液，最后进行考马斯亮蓝染反应。严格控制反应时长为3min然后在595nm处测定蛋白含量。

本发明涉及的试验全部设计了三个重复，本发明的数据都是用三个重复的平均值和标准差表示。

2结果

2.1MA5的形态学和16SrDNA鉴定结果分析

通过富集，平板分区划线和转接培养方法，从东寨港红树林自然保护区的环境中筛选出甲酸利用能力最强、生长速度最快的菌株MA5，鉴定为Paracoccus communis。所以本发明选用MA5为目的菌株，用于转化甲酸生产单细胞蛋白的工艺研究。本发明还针对MA5菌株做了系统发育树，结果如图1所示。

在1000倍显微镜下观察MA5菌株，发现菌体呈短杆状，多数情况下成对出现。该菌属于革兰氏阴性菌，兼性厌氧型，在甲酸培养基上培养24h后菌落形态呈现淡黄，表面光滑湿润，周围呈辐射状。

2.2培养基优化

2.2.1初始pH值对MA5单细胞蛋白产量的影响

测定MA5菌株在不同pH条件下的生长情况，结果如图2，从图中可以看出MA5菌株在pH为6.5-7之间时，菌体生长速度差别不大，随着pH升高菌体生物量增加，当pH值增加到7时生物量达到最大值，pH继续增加，菌体生物量开始下降，所以pH＝7是菌体最适生长pH值。

2.2.2培养温度对MA5单细胞蛋白产量的影响

菌株接种于pH＝7的甲酸培养基中，在不同温度培养条件下测定菌株的生长情况，结果如图3所示。从图中可以看出温度范围在26℃-37℃时，菌体生物量随着温度的升高而增加，菌体在37℃培养温度下生物量达到最大值，温度继续升高，菌体生物量开始下降。所以37℃为菌体最适生长温度。

2.2.3甲酸钠浓度对MA5单细胞蛋白产量的影响

测定MA5菌株在不同甲酸钠浓度下的生长情况和蛋白产量，结果如图4所示。从图中可以看出，当甲酸钠浓度小于5g/L时，菌体的生物量和蛋白产量随着甲酸钠浓度的增加而增加呈正相关关系，当甲酸钠浓度增加到5g/L时单细胞蛋白产量达到最高为

1.99×10-3g/L，此时氮源为2g/L氯化铵，但当继续增加甲酸钠浓度时，生物量开始下降，蛋白产量也随之下降。

2.2.4氮源对MA5单细胞蛋白产量的影响

MA5菌株在含有不同氮源培养基中培养24h后，测得单细胞蛋白产量如图5所示。结果显示有机氮源相较无机氮源能够明显促进MA5菌株单细胞蛋白的产量，当氮源为酵母粉时菌株单细胞蛋白产量最高。

2.2.5C/N比对MA5单细胞蛋白产量的影响

本实验选取酵母粉为氮源，实验前测量了所用酵母粉中总碳含量为63.60％，总氮含量为12％，根据该数据计算培养基内的碳氮比。摇瓶培养24h后测量单细胞蛋白产量，结果如图6。从图中可以看出碳氮比为7.20:1时MA5菌株的蛋白含量最高为60.70％，而且在该碳氮比条件下单细胞蛋白的产量也相对较高为1.31g/L。

2.3 5升体系发酵

利用酵母粉作为氮源，按1％的接种量接种300mL种子液，最终得到14.1g/L的生物量，49.1％的蛋白产量。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的甲酸基单细胞蛋白菌株及其应用的修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

本发明以甲酸钠作为碳源从东寨港红树林自然保护区土样中筛选获得一株高效利用甲酸的菌株。采用16SrDNA序列分析方法，该菌株鉴定为副球菌(Paracoccus communisMA5)。采用单因素法对菌株的生长条件及蛋白质得率进行优化，培养基优化结果表明，该菌株的最佳生长温度为37℃，最佳初始pH值为7，最佳碳源甲酸钠浓度为5g/L，最佳氮源酵母粉浓度为8g/L。在此基础上采用5L发酵体系对MA5的发酵工艺进行优化，结果表明在酵母粉存在条件下菌株MA5的生物量达到14.1g/L，蛋白含量达到49.1％，甲酸的消耗速率最高时达到了0.84g/L/h。MA5可高效利用甲酸产蛋白质，可作为候选菌株以期为利用甲酸生产动物饲料提供理论基础。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 甲酸基单细胞蛋白菌株MA5及其应用

<130> 2019

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19