926位点发生突变的RanBP9突变基因及其应用

著录项

申请号 CN201711177392.9
申请日 20171123
公开（公告）号 CN107653248A
公开日 20180202
申请（专利权）人黄志清
发明人黄志清;其他发明人请求不公开姓名
主分类号 C12N15/12
分类号
C12N15/12 C12Q1/6883 C12Q1/6869
地址福建省泉州市南安市溪美街道阳光优家5号楼
国省代码福建(35)

摘要

本发明提供了一种发生了c.926delC突变的RanBP9突变基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:6所示，它是人类男性生精障碍的致病基因。本发明还提供了基于多重PCR捕获联合二代DNA测序的RanBP9致病基因外显子突变筛选方法，最后利用Sanger测序对突变进行验证；其中PCR捕获引物组包含扩增引物序列SEQ?ID?NO:7?12，用于Sanger测序的RanBP9基因c.926delC突变片段的扩增引物序列如SEQ?ID?NO:11?12所示。本发明提供的RanBP9致病基因形式尚未被报道，可以为该病致病机理的解析和检测方法的构建等提供依据和奠定基础。

权利要求



1. 一种RanBP9突变基因，其特征在于RanBP9基因第926位点的C核苷酸缺失即发生了 c.926delC缺失突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。



2.权利要求1所述的RanBP9突变基因在构建人类男性生精障碍基因检测方法以及制备人类男性生精障碍基因诊断芯片、基因检测试剂盒和药物中的应用。



3. 如权利要求2所述的人类男性生精障碍的基因检测方法,其特征在于检测靶标为 RanBP9基因，主要步骤如下:

（1）RanBP9基因的PCR捕获

提取待测患者样本基因组DNA，利用设计合成的PCR捕获引物组进行多重PCR扩增；

（2）二代DNA测序解析基因突变谱

将（1）中的多重PCR扩增产物进行二代DNA测序，并通过信息分析出突变位点；

（3）突变位点的验证

对于结果是RanBP9基因c.926delC致病突变的，则直接进行Sanger测序验证；对于结果是新发现的RanBP9基因突变的，则进行Sanger测序验证后，再通过Sanger测序分析患者家系相关成员样本的遗传信息进行验证。

4.根据权利要求3所述的人类男性生精障碍基因检测方法,其特征在于步骤(1)中样本为血液或口腔粘膜。

5. 根据权利要求3所述的人类男性生精障碍基因检测方法,其特征在于步骤(1)中所述的PCR捕获引物组包含SEQ ID NO:7-12这6条序列。

6. 根据权利要求3所述的人类男性生精障碍基因检测方法,其特征在于步骤(3)中用于Sanger测序的RanBP9基因c.926delC突变片段，其扩增引物对为SEQ ID NO:11-12。

说明书

技术领域

本发明涉及突变基因及其检测方法，特别涉及人类男性生精障碍致病基因RanBP9 及其检测方法。

生育年龄的男性中约有5%有不育问题，其中大部分的原因不明。男性生育能力依赖于有功能的精子，精子在睾丸内产生和发育的过程是由数个基因控制，这些基因的表达过程若受到干扰，就会影响精子的形成从而造成男性不育。研究（Jianqiang Bao, et al., RAN-Binding Protein 9 is Involved in Alternative Splicing and is Critical for Male Germ Cell Development and Male Fertility. PLoS Genetics. 2014，10(12):1- 14.）表明，RanBP9基因即RAN binding protein 9编码基因在老鼠睾丸中可以调控生育相关基因的表达，以保证精子的正常生成，因此RanBP9基因是目前精子形成过程中的关键调控因素之一。RanBP9基因编码RanBP9蛋白，RanBP9蛋白是在细胞内多个区域调节不同功能的多种蛋白复合体的关键组成部分，发挥支架蛋白的角。RanBP9蛋白功能的发挥与多种生物过程相关，例如细胞增殖和凋亡、性腺的生长和发育等。如果RanBP9基因失去功能，精子的生成过程就会受到干扰，从而严重减低男性生育力造成男性出现少精、弱精等生精障碍。然而目前RanBP9基因在人类男性生精障碍中的遗传变异特征尚未得到解析，限制了该基因的研究和应用。

为了系统解析RanBP9基因在人类男性生精障碍中的致病突变，本发明设计和合成了覆盖RanBP9基因全部外显子的PCR捕获引物组，再结合二代DNA测序技术对25个男性生精障碍患者样本进行捕获测序，最终解析出了RanBP9基因的6种候选致病突变形式，所发现的突变均经Sanger测序确证；之后针对这6种致病基因突变，利用Sanger测序分析对应家系中其它成员的样本，发现携带致病基因突变的男性均存在生精障碍从而致病基因突变得到了确证。进一步的，采用同样的方法在另外37个人类男性生精障碍患者和100个生精正常的健康男性样本中进行了验证。本发明提供的男性生精障碍致病基因RanBP9突变均尚未见报道，其对于该病的解析和检测均具有潜在的重要价值。

本发明提供了RanBP9基因引起的人类男性生精障碍的6种突变基因形式，同时提供了基于PCR捕获测序的RanBP9致病基因检测方法；这些可以为RanBP9基因引起的男性生精障碍致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测等提供依据和奠定基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明提供了RanBP9基因的6种突变基因形式（图1），其序列分别如SEQ ID NO:1-6所示，对应的突变分别为c.126C>T突变、c.133C>T突变、c.702T>G突变、c.912G>T突变、c.921A >G突变和c.926delC突变。RanBP9基因的这6种突变形式经检测和验证，均为人类男性生精障碍致病基因，可以被应用于构建人类男性生精障碍基因检测方法以及制备人类男性生精障碍基因诊断芯片、基因检测试剂盒和药物中。

其中，所述SEQ ID NO:1-6展现的只是发生了突变的RanBP9基因外显子序列，不含内含子序列。参照野生型RanBP9基因序列（NCBI登录号为NM_005493.2），所述c.126C>T突变是指RanBP9基因第126位点的C核苷酸突变成了T核苷酸，该突变发生在外显子1中；所述 c.133C>T突变是指RanBP9基因第133位点的C核苷酸突变成了T核苷酸，该突变发生在外显子1中；所述c.702T>G突变是指RanBP9基因第702位点的T核苷酸突变成了G核苷酸，该突变发生在外显子2中；所述c.912G>T突变是指RanBP9基因第912位点的G核苷酸突变成了T核苷酸，该突变发生在外显子4中；所述c.921A>G突变是指RanBP9基因第921位点的A核苷酸突变成了G核苷酸，该突变发生在外显子4中；所述c.926delC突变是指RanBP9基因第926位点发生了C核苷酸的缺失，该突变发生在外显子4中。

此外，本发明还提供了RanBP9基因引起的人类男性生精障碍的致病基因检测方法，该方法包括如下主要步骤：

（1）RanBP9基因的PCR捕获

提取待测患者样本基因组DNA，利用设计合成的PCR捕获引物组进行多重PCR扩增；

（2）二代DNA测序解析基因突变谱

将（1）中的多重PCR扩增产物进行二代DNA测序，并通过信息分析出突变位点；

（3）突变位点的验证

对于结果是已发现的6种RanBP9基因致病突变的，则直接进行Sanger测序验证；对于结果是新发现的RanBP9基因突变的，则进行Sanger测序验证后，再通过Sanger测序分析患者家系相关成员样本的遗传信息进行验证。

其中，（1）中所述样本为人体正常组织，优选血液或口腔粘膜。

其中，（1）中所述PCR捕获引物组是针对RanBP9基因外显子区设计的，共需要15对引物（其序列如表1所示），在美国Thermo Fisher公司处定制，这15对引物对构成的PCR捕获引物组可以覆盖RanBP9基因所有外显子。SEQ ID NO:7-12也包含在这15对引物对中。

表1 PCR捕获扩增引物组

扩增子编号引物上游序列（5’-3’）引物下游序列（5’-3’）

Amplicon1 GAAGCAGAGGAGGAAGGAGA TTGTAGTGCACCCGCAGG

Amplicon2 GTCATGGCAAAACCCCAA CCATCTCTTCCCTTACTGAC

Amplicon3 TTACATGGGAATTGGTCTT CTGGTAGTCTATTCATGTTC

Amplicon4 GTTGGGATAAGCATTCATAT CTAAACTATGTCCATTCTTG

Amplicon5 GTATTGCTTTCACTGACCT GCGCGGTGGCTCACGCC

Amplicon6 CCAAATTTGTATCCTACTGT TTGTATCATGGTCTGCCA

Amplicon7 AATGGTTTCATCTTATTTA TGTCTATTCTTAATGGAA

Amplicon8 GAATTCAGAAATTGGTAT TTTAATGTGAAAAGGAGATT

Amplicon9 AGTGCGTCAGTTTATAGAAA TGAAAAATGTGCGGTGCTT

Amplicon10 GTTTTGAAAGTTGTAGTA CTGGTGAAGTTATTAACTTG

Amplicon11 TAATGATGTAGACATGGAAA CATTTCGGTGTCACAATCT

Amplicon12 AAGTTGATTCAAGTCAGTT CTTCAACATTTTTTTGTTTG

Amplicon13 GATGCATTCAGTCTACTAG CTAATATTGCACTGTTAAGA

Amplicon14 AAACCCACAATCTGCCAAAG TGTGATGATCAATTTGAAC

Amplicon15 ATCCTTTAAAACAATTACC CTGTAGAAGTAAATTTTTAA

其中，（1）中所述的多重PCR扩增其体系（20μL）如表2所示。5×Ion AmpliSeq™HiFi Mix、2×Ion AmpliSeq™ 引物组、20×Ion AmpliSeq™ Sample ID Panel和灭菌的 Nuclease-free Water均购置于美国Thermo Fisher公司。

表2 PCR捕获扩增体系

成分添加量（μL）

5×Ion AmpliSeq™HiFi Mix 4.0

2×Ion AmpliSeq™ 引物组 10.0

20×Ion AmpliSeq™ Sample ID Panel 1.0

样本基因组DNA（>20 ng/μL） 0.5

灭菌的Nuclease-free Water 4.5

总体积 20.0

表2中的2×Ion AmpliSeq™ 引物组是指表1中的15对引物对，每对引物的浓度均为10 μM。

其中，（1）中所述的多重PCR扩增其扩增阶段和条件如表3所示：

表3 PCR捕获扩增阶段和条件

其中，（2）中所述的PCR扩增捕获产物进行的二代DNA测序和信息分析，可由商业化的二代DNA测序公司完成，最终需得到所检测样本的RanBP9基因所有外显子的突变信息。

其中，（3）中所述的对已发现的6种RanBP9基因致病突变直接进行Sanger测序验证，是指单独采用特定突变所在扩增子的引物对进行扩增和Sanger测序，以验证是否同二代测序检出的突变结果一致，扩增产物可送商业化的DNA测序公司进行Sanger测序，最终需得到对应的扩增子序列。用于直接Sanger测序的突变片段的扩增引物对具体是：对于 RanBP9基因的c.126C>T突变，扩增引物对为SEQ ID NO:7-8；对于c.133C>T突变，扩增引物对为SEQ ID NO:7-8；对于c.702T>G突变，扩增引物对为SEQ ID NO:9-10；对于c.912G>T突变，扩增引物对为SEQ ID NO:11-12；对于c.921A>G突变，扩增引物对为SEQ ID NO:11-12；对于c.926delC突变，扩增引物对为SEQ ID NO:11-12。新发现的RanBP9基因突变则另行设计引物。

本发明提供的人类男性生精障碍相关基因RanBP9的6种致病突变形式，可以为该病致病机理的解析和致病基因检测等提供依据和奠定基础；此外本发明提供的基于PCR捕获联合二代测序的RanBP9致病基因检测方法，覆盖了致病基因的所有外显子，可以高效全面、快速准确地获取突变信息。

图1是RanBP9基因6种致病突变形式的位置示意图。黑方框代表外显子，白方块代表内含子，独立数字1、2、3和4代表所对应的外显子序号，箭头所指向处为突变位点，对应突变标注于箭头平末端处。

图2是实施例1中的S1号患者其RanBP9基因的c.126C>T突变测序图谱。箭头指向处为突变位点。S1号患者为图8家系的III1，I2、II2、II3和III2的突变测序结果与III1类似， S2号患者的突变测序结果也与III1类似，均可参见图2。

图3是实施例1中的S3号患者其RanBP9基因的c.133C>T突变测序图谱。箭头指向处为突变位点。S3号患者为图9家系的II1，I2的突变测序结果与II1类似，可参见图3。

图4是实施例1中的S4号患者其RanBP9基因的c.702T>G突变测序图谱。箭头指向处为突变位点。S4号患者为图10家系的II1，I2的突变测序结果与II1类似，可参见图4。

图5是实施例1中的S5号患者其RanBP9基因的c.912G>T突变测序图谱。箭头指向处为突变位点。S5号患者为图11家系的III1，II2和II3的突变测序结果都与III1类似，S6号患者的突变测序结果也与III1类似，均可参见图5。

图6是实施例1中的S7号患者其RanBP9基因的c.921A>G突变测序图谱。箭头指向处为突变位点。S7号患者为图12家系的II1，I2和II3的突变测序结果与II1类似，可参见图6。

图7是实施例1中的S8号患者其RanBP9基因的c.926delC突变测序图谱。箭头指向处为缺失突变位点。S8号患者为图13家系的III1，II2的突变测序结果与III1类似，可参见图7。

图8是S1号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S1号患者为图中III1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示RanBP9 基因检出c.126C>T突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.126C>T突变；I、II和III分别代表第 1、2和3代，数字为成员编号。

图9是S3号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S3号患者为图中II1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示RanBP9 基因检出c.133C>T突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.133C>T突变；I和II分别代表第1和2 代，数字为成员编号。

图10是S4号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S4号患者为图中II1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示RanBP9 基因检出c.702T>G突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.702T>G突变；I和II分别代表第1和2 代，数字为成员编号。

图11是S5号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S5号患者为图中III1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示 RanBP9基因检出c.912G>T突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.912G>T突变，“\”表示个体死亡；I、II和III分别代表第1、2和3代，数字为成员编号。

图12是S7号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S7号患者为图中II1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示RanBP9 基因检出c.921A>G突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.921A>G突变；I和II分别代表第1和2 代，数字为成员编号。

图13是S8号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，S8号患者为图中III1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑填充表示生精障碍，空心表示非生精障碍；“+”表示 RanBP9基因检出c.926delC突变，“-”表示RanBP9基因未检出c.926delC突变；I、II和III分别代表第1、2和3代，数字为成员编号。

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

选择临床检查确诊的25名男性生精障碍患者在其签署了知情同意书的情况下，进行 RanBP9基因的检测和分析。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克等编著，第三版，科学出版社）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。此外，实施例涉及的生精障碍主要是指少精和弱精，生精障碍患者的诊断依据现有的常规临床标准。

（1）RanBP9基因的PCR捕获

取患者肘静脉血5ml（EDTA抗凝），用中国北京天根公司的血液基因组提取试剂盒进行基因组DNA提取，以其为模板采用表1的PCR捕获引物组按照表2配制多重PCR扩增体系，并在美国ABI公司的2720型PCR仪上按照表3条件进行扩增反应。

（2）二代DNA测序解析基因突变谱

将（1）中的多重PCR扩增产物送深圳华大基因公司进行二代DNA测序，采用的二代DNA测序仪是美国ABI公司的Ion Proton，平均测序深度达到5000×；结果显示有8例患者（编号 S1-8）检出RanBP9基因突变，结果如表4所示，共计有6种突变。

表4 8例人类男性生精障碍患者RanBP9基因检测及验证结果

样本编号突变情况验证时的扩增引物对 Sanger测序结果家系遗传序列

S1 c.126C>T SEQ ID NO:7-8 参见图2，一致符合 SEQ ID NO:1

S2 c.126C>T SEQ ID NO:7-8 参见图2，一致符合 SEQ ID NO:1

S3 c.133C>T SEQ ID NO:7-8 参见图3，一致符合 SEQ ID NO:2

S4 c.702T>G SEQ ID NO:9-10 参见图4，一致符合 SEQ ID NO:3

S5 c.912G>T SEQ ID NO:11-12 参见图5，一致符合 SEQ ID NO:4

S6 c.912G>T SEQ ID NO:11-12 参见图5，一致符合 SEQ ID NO:4

S7 c.921A>G SEQ ID NO:11-12 参见图6，一致符合 SEQ ID NO:5

S8 c.926delC SEQ ID NO:11-12 参见图7，一致符合 SEQ ID NO:6

（3）突变位点的验证

根据所检出的突变，利用特定引物对将原样本突变所在扩增子片段扩增后直接进行 Sanger测序验证。采用上海生工生物工程有限公司的rTaq聚合酶试剂盒进行扩增，其扩增体系均详见表5，对应扩增引物对详见表4。扩增条件均为：94℃预变性4min；32个循环：94℃ 变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s；72℃终延伸7min。Sanger测序结果发现均与二代DNA 测序结果一致（图2-7，表4）。

表5 扩增体系

编号组份添加量

1 10×PCR buffer(Mg 2+) 2.5μL

2 dNTP Mix 0.5μL

3 Primer(50uM)F 0.25μL

4 Primer(50uM)R 0.25μL

5 rTaq 0.25μL

6 Template DNA(30ng/μL) 1.25μL

7 灭菌去离子水 20.0μL

由于这6种突变均未被报道，因此收集这8例生精障碍患者家系相关成员样本，再通过 Sanger测序突变片段确证遗传关系，具体如下：

对于S1号患者，如图8所示其为家系先证者III1，该患者28岁，结婚4年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1500万个诊断为少精。根据二代测序数据可知，S1号患者即III1的RanBP9基因发生了c.126C>T突变；利用引物对SEQ ID NO:7-8扩增突变片段，其直接Sanger测序结果（如图2所示），与二代测序结果一致。收集该家系中的其他8名成员资料并做相关检查，还发现III2也为少精个体（如图8中所示），II1 和II4并无既往生精障碍史，然而谨慎起见也和III2一起做了相关检查，确诊只有III2为少精个体，而II1和II4生精正常。由于I1和I2为III1的外公外婆年纪大因此只做基因检测而不做生精障碍性状分析。采集这8个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO:7-8扩增RanBP9基因c.126C>T突变所在外显子片段，Sanger测序显示I2、II2、II3和 III2这4个家系成员均也存在RanBP9基因的c.126C>T突变。由此可知，携带RanBP9基因 c.126C>T突变的男性成员即III1和III2均为生精障碍患者，而不携带RanBP9基因c.126C>T 突变的男性成员即II1和II4均不存在生精障碍问题；而携带RanBP9基因c.126C>T突变的女性成员即II2和II3，由于是女性不存在生精问题。III1的RanBP9基因c.126C>T突变是由其外婆I2遗传先给其母亲II2再由其母亲II2遗传给他的，而III1的母亲II2和外婆I2由于是女性因此不显示生精障碍。表4中S2号患者，经过同样的分析发现该患者也存在RanBP9基因的c.126C>T突变（参见图2，表4），并且也出现家系中男性成员携带RanBP9基因的c.126C>T 突变即出现生精障碍性状。由此证明了RanBP9基因的c.126C>T突变（突变基因序列如SEQ ID NO:1所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。

对于S3号患者，如图9所示其为家系先证者II1，该患者30岁，结婚5年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1500万个诊断为少精。根据二代测序数据可知，S3号患者即II1的RanBP9基因发生了c.133C>T突变；利用引物对 SEQ ID NO:7-8扩增突变片段，其直接Sanger测序结果（如图3所示），与二代测序结果一致。收集该家系中的其他2名成员资料并做相关检查，获知男性成员中I1并无既往生精障碍史， I1经检查也确诊不存在生精障碍（如图9中所示）。采集这2个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO:7-8扩增RanBP9基因c.133C>T突变所在外显子片段，Sanger 测序显示只有I2存在RanBP9基因的c.133C>T突变。由此可知，携带RanBP9基因c.133C>T突变的男性成员即II1为生精障碍患者，而不携带RanBP9基因c.133C>T突变的男性成员即I1 不存在生精障碍，II1的RanBP9基因c.133C>T突变是遗传自其母亲I2，而II1的母亲I2由于是女性不显示生精障碍，由此证明了RanBP9基因c.133C>T突变（突变基因序列如SEQ ID NO:2所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。

对于S4号患者，如图10所示其为家系先证者II1，该患者29岁，结婚3年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1500万个诊断为少精。根据二代测序数据可知，S4号患者即II1的RanBP9基因发生了c.702T>G突变；利用引物对 SEQ ID NO:9-10扩增突变片段，其直接Sanger测序结果（如图4所示），与二代测序结果一致。收集该家系中的其他3名成员资料并做相关检查，获知男性成员中I1未有既往生精障碍史，进一步做精液常规分析也确定了I1不存在生精障碍，II2经检查也不存在生精障碍（如图10中所示）。采集这3个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO:9-10 扩增RanBP9基因c.702T>G突变所在外显子片段，Sanger测序显示I2存在RanBP9基因的 c.702T>G突变。由此可知，携带RanBP9基因c.702T>G突变的男性成员即II1为生精障碍患者，而不携带RanBP9基因c.702T>G突变的男性成员即I1和II2均不存在生精障碍，II1的 RanBP9基因c.702T>G突变遗传自其母亲I2，而II1的母亲I2由于是女性不显示生精障碍，由此证明了RanBP9基因c.702T>G突变（突变基因序列如SEQ ID NO:3所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。

对于S5号患者，如图11所示其为家系先证者III1，该患者32岁，结婚3年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1500万个诊断为少精。根据二代测序数据可知，S5号患者即III1的RanBP9基因发生了c.912G>T突变；利用引物对SEQ ID NO:11-12扩增c.912G>T突变所在外显子片段，其直接Sanger测序结果（如图5所示），与二代测序结果一致。收集该家系中的其他4名在世成员资料并做相关检查（I1和I2已离世），获知男性成员中II3结婚21年未生育既往检查诊断为少精，此次再做精液常规分析也确定了II3存在生精障碍（如图11中所示），而II1经检查生精正常。采集这4个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO:11-12扩增RanBP9基因c.912G>T突变所在外显子片段，Sanger测序显示II2和II3均也存在RanBP9基因的c.912G>T突变。由此可知，携带RanBP9基因c.912G>T突变的男性成员即II3和III1均为生精障碍患者，而不携带RanBP9 基因c.912G>T突变的男性成员即II1不存在生精障碍，III1的RanBP9基因c.912G>T突变是由其母亲II2遗传给他的，而III1的母亲II2由于是女性不显示生精障碍。表4中S6号患者，经过同样的分析发现该患者也存在RanBP9基因的c.912G>T突变（参见图5，表4），并且也出现家系中男性成员携带RanBP9基因的c.912G>T突变即出现生精障碍性状。由此证明了 RanBP9基因c.912G>T突变（突变基因序列如SEQ ID NO:4所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。

对于S7号患者，如图12所示其为家系先证者II1，该患者30岁，结婚4年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1500万个诊断为少精。根据二代测序数据可知，S7号患者即II1的RanBP9基因发生了c.921A>G突变；利用引物对 SEQ ID NO:11-12扩增c.921A>G突变所在外显子片段，其直接Sanger测序结果（如图6所示），与二代测序结果一致。收集该家系中的其他4名成员资料并做相关检查，获知男性成员中I1未有既往生精障碍史，此次再做精液常规分析也确定了I1不存在生精障碍（如图12中所示）。采集这4个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO:11-12扩增 RanBP9基因c.921A>G突变所在外显子片段，Sanger测序显示I2和II3均也存在RanBP9基因的c.921A>G突变。由此可知，携带RanBP9基因c.921A>G突变的男性成员即II1为生精障碍患者，而不携带RanBP9基因c.921A>G突变的男性成员即I1不存在生精障碍，II1的RanBP9基因 c.921A>G突变是由其母亲I2遗传给他的，同时也遗传给其妹妹之一II3，而II1的母亲I2和妹妹II3由于是女性不显示生精障碍，由此证明了RanBP9基因c.921A>G突变（突变基因序列如SEQ ID NO:5所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。

对于S8号患者，如图13所示其为家系先证者III1，该患者29岁，结婚3年妻子未孕就诊，经精液常规分析显示其a级和b级这两级精子数量比例大于30%但小于50%诊断为中度弱精子症。根据二代测序数据可知，S8号患者即III1的RanBP9基因发生了c.926delC突变；利用引物对SEQ ID NO:11-12扩增c.926delC突变所在外显子片段，其直接Sanger测序结果（如图7所示），与二代测序结果一致。收集到了该家系中的其他5名成员II1、II2、II3、II4和 III2的资料（I1和II2未收集到）并做相关检查，获知男性成员中II2有生精障碍史既往检查诊断为轻度弱精子症，进一步做精液常规分析也确定了II2存在弱精症状供此次参考；而 II3和III2经检查生精正常（如图13中所示）。采集这5个家系成员的血液样本提取基因组 DNA，利用引物对SEQ ID NO:11-12扩增RanBP9基因c.926delC突变所在外显子片段，Sanger 测序显示只有II2存在RanBP9基因的c.926delC突变。由此可知，携带RanBP9基因c.926delC 突变的男性成员即II2和III1均为生精障碍患者，而不携带RanBP9基因c.926delC突变的男性成员即II3和III2均不存在生精障碍，III1的RanBP9基因c.926delC突变是由其父亲II2 遗传给他的，由此证明了RanBP9基因c.926delC突变（突变基因序列如SEQ ID NO:6所示）是男性生精障碍患者的致病性突变。

综上可知，通过本实施例获得了RanBP9基因的6种致病突变均满足家系遗传规律，实施例2将在人样本中做进一步验证。

实施例2

另取与实施例1中不同的人类男性生精障碍临床确诊患者37例以及100例临床确诊无生精障碍的健康男性血样进行分析，方法同实施例1，结果11例患者样本检出RanBP9基因突变，相关数据如表6所示。

表6 11例人类男性生精障碍患者RanBP9基因检测及验证结果

样本编号突变情况 Sanger测序家系分离序列

s1 c.912G>T 一致是 SEQ ID NO:4

s2 c.133C>T 一致是 SEQ ID NO:2

s3 c.126C>T 一致是 SEQ ID NO:1

s4 c.912G>T 一致是 SEQ ID NO:4

s5 c.126C>T 一致是 SEQ ID NO:1

s6 c.702T>G 一致是 SEQ ID NO:3

s7 c.126C>T 一致是 SEQ ID NO:1

s8 c.702T>G 一致是 SEQ ID NO:3

s9 c.133C>T 一致是 SEQ ID NO:2

s10 c.921A>G 一致是 SEQ ID NO:5

s11 c.926delC 一致是 SEQ ID NO:6

对于表6中生精障碍患者的突变均经过Sanger测序验证了，所有突变基因均属于所述6 种基因突变形式，对此11个患者进一步做家系遗传分析也确证了这6中基因突变形式符合家系遗传规律；而在100例健康男性中，均不存在所述的突变，从而从正反两方面再次验证了本发明提供的RanBP9基因突变形式的致男性生精障碍性，以及本发明提供的检测方法具有良好的可靠性和准确性。

基于本发明新鉴定的RanBP9基因的6种致病突变基因形式，申请人将突变所在的扩增子进行纯化，将其克隆到商业化质粒等载体中，之后将其导入大肠杆菌等宿主菌中，置于-80℃冰箱中保存。另一方面，由于本发明对于致病基因序列的公布，可以采用定点突变的方式由野生型基因制备得到，或通过序列合成的方式获取。

序列表

<110> 黄志清

<120> 926位点发生突变的RanBP9突变基因及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3132

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

gaagcagagg aggaaggaga gaagaggtgg aggtggccgc aggctgagtc gcggccggga 60

tgtccgggca gccgccgccg ccgccgccgc agcagcagca acagcagcag cagctgtcgc 120

cgccatcgcc ggcggccttg gccccagtct ccggagtcgt cctgccggcg cccccggccg 180

tcagcgccgg ctcttctccg gccggctcgc ccggcggcgg tgcgggcggc gaaggcttag 240

gggccgcggc ggccgccctg ctcctccacc ctccgccgcc gccgcccccg gccaccgcgg 300

ccccgccgcc cccgccgccg cccccgcctc cccctgcctc agcggctgcc cccgccagcg 360

ggccgcccgc tcccccgggc cttgcagcgg gccccggccc ggctggagga gccccgaccc 420

cagctctggt ggcgggcagc agcgccgcgg cccccttccc tcacggggac tcggccctga 480

acgagcagga gaaggagttg cagcggcggc tgaagcgtct ctacccggcc gtggacgaac 540

aagagacgcc gctgcctcgg tcctggagcc cgaaggacaa gttcagctac atcggcctct 600

ctcagaacaa cctgcgggtg cactacaaag gtcatggcaa aaccccaaaa gatgccgcgt 660

cagttcgagc cacgcatcca ataccagcag cctgtgggat ttattatttt gaagtaaaaa 720

ttgtcagtaa gggaagagat ggttacatgg gaattggtct ttctgctcaa ggtgtgaaca 780

tgaatagact accaggttgg gataagcatt catatggtta ccatggggat gatggacatt 840

cgttttgttc ttctggaact ggacaacctt atggaccaac tttcactact ggtgatgtca 900

ttggctgttg tgttaatctt atcaacaata cctgctttta caccaagaat ggacatagtt 960

taggtattgc tttcactgac ctaccgccaa atttgtatcc tactgtgggg cttcaaacac 1020

caggagaagt ggtcgatgcc aattttgggc aacatccttt cgtgtttgat atagaagact 1080

atatgcggga gtggagaacc aaaatccagg cacagataga tcgatttcct atcggagatc 1140

gagaaggaga atggcagacc atgatacaaa aaatggtttc atcttattta gtccaccatg 1200

ggtactgtgc cacagcagag gcctttgcca gatctacaga ccagaccgtt ctagaagaat 1260

tagcttccat taagaataga caaagaattc agaaattggt attagcagga agaatgggag 1320

aagccattga aacaacacaa cagttatacc caagtttact tgaaagaaat cctaatctcc 1380

ttttcacatt aaaagtgcgt cagtttatag aaatggtgaa tggtacagat agtgaagtac 1440

gatgtttggg aggccgaagt ccaaagtctc aagacagtta tcctgttagt cctcgacctt 1500

ttagtagtcc aagtatgagc cccagccatg gaatgaatat ccacaattta gcatcaggca 1560

aaggaagcac cgcacatttt tcaggttttg aaagttgtag taatggtgta atatcaaata 1620

aagcacatca atcatattgc catagtaata aacaccagtc atccaacttg aatgtaccag 1680

aactaaacag tataaatatg tcaagatcac agcaagttaa taacttcacc agtaatgatg 1740

tagacatgga aacagatcac tactccaatg gagttggaga aacttcatcc aatggtttcc 1800

taaatggtag ctctaaacat gaccacgaaa tggaagattg tgacaccgaa atggaagttg 1860

attcaagtca gttgagacgc cagttgtgtg gaggaagtca ggccgccata gaaagaatga 1920

tccactttgg acgagagctg caagcaatga gtgaacagct aaggagagac tgtggcaaga 1980

acactgcaaa caaaaaaatg ttgaaggatg cattcagtct actagcatat tcagatccct 2040

ggaacagccc agttggaaat cagcttgacc cgattcagag agaacctgtg tgctcagctc 2100

ttaacagtgc aatattagaa acccacaatc tgccaaagca acctccactt gccctagcaa 2160

tgggacaggc cacacaatgt ctaggactga tggctcgatc aggaattgga tcctgcgcat 2220

ttgccacagt ggaagactac ctacattagc tatgcatttc aagagctcac acttatattg 2280

tggcatatag tcaacatgga agtagaccag ctctgctgat ttgaaattta gattttttaa 2340

attatgtact ggggacaggt ttttgtcgct ttacattgct tcctagttta cagcatgatg 2400

caaatgattt tctaacttag tgttaggaga aattattttc catctttaac ctcttagttg 2460

tctaagagtt aaatattact gaatttcaga cgttcaaatt gatcatcaca aatcctttaa 2520

aacaattacc taaaagaaac caaaaatcct gccttctttg tgggggaggg gggagagagg 2580

ggaaggaaat ggaacaagtt gtgtttgtgt tagcatgtgg gtgatgtaaa cttcaaattg 2640

ggagatgttc cgacccccac tcccatataa gcattcaatc agtgtaactt gcaaaatgca 2700

taaacatccg acagtttgaa tttatagtgt tgatggaaga aatcattttt aatgtgtact 2760

gtaaaacttg aaatactcag gagctgagtg aatatgtttg ttgctactta caatcccgac 2820

ctgttagtcc cagtagtttt gttttaacat ggtctttttc aactttgttt cctgtttaac 2880

tacagatgac ttctgttgta gactcacaag tttaactgtt gtattataac agtattacat 2940

gtcaacggtg tggttatgac ctttatttat ataaaaacca aatatttagt caatttaccg 3000

tgtcttaatt taatctttgt acaccttcca tttttaagtg cttaaatgag tactatattg 3060

caataaaatg tagtgatata attaaccagc cattaaaaat ttacttctac agaaaaaaaa 3120

aaaaaaaaaa aa 3132

<210> 2

<211> 3132

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

gaagcagagg aggaaggaga gaagaggtgg aggtggccgc aggctgagtc gcggccggga 60

tgtccgggca gccgccgccg ccgccgccgc agcagcagca acagcagcag cagctgtcgc 120

cgccaccgcc ggtggccttg gccccagtct ccggagtcgt cctgccggcg cccccggccg 180