促肝细胞生长素

本发明涉及的是一种用于肝炎、肝硬化等疾病的药物-促肝细胞生长素，具体的讲，它是一种从幼龄动物的新鲜肝脏中提取的分子量约为一万的肝细胞刺激因子，属于一类生化药物。本发明也是本申请人的CN    89107217的后续专利。

多年来，研究人员一直在研究能阻止肝细胞坏死和能促进肝细胞再生的物质，所述的研究集中在肝脏本身所产生的肝再生刺激因子的上，并已证明它们具有刺激肝细胞再生的作用。

申请人CN    89107217中已公开了一种采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法，该制备方法简单方便，易于推广应用，便于大批量生产；但由于没有给出该方法所生产出的制品的物化参数或没有给出测试的条件，因此无法确定该多肽化合物的具体结构或无法用已公开的参数来确定该多肽化合物，这样就使所生产出的产品没有重现性。

本发明的目的在于提供一种以幼龄哺乳动物的新鲜肝脏为原料，制备一种用于肝炎、肝硬化等疾病并且具有高度重现性和更高的相对活性的药物-促肝细胞生长素。

本发明地目的可以通过以下方法实现：采集幼龄哺乳动物的新鲜肝脏，除去肝膜及韧带后切碎，加入蒸馏水在 高速捣碎机中高速捣碎并制成匀浆，离心沉淀去沉渣，取上清液装入透析装置中进行透析将透析物用Sephadex    LH20柱层析分离后得到本发明所述的促肝细胞生长素。

本发明与现有技术中所述的类似产品相比具有无过敏反应、降酶幅度大、速度快、退黄显著等优点，并能明显改善患者肝区疼痛、乏力、腹胀等症状。

本发明的附图说明如下：

图一是本发明采用小于60天乳猪的新鲜肝脏制备的促肝细胞生长素在波长为λ=254nm下的高效液相谱；

图二是本发明采用乳猪的新鲜肝脏制备的促肝细胞生长素在波长为λ=230nm下的高效液相谱；

图三是本发明采用乳猪的新鲜肝脏制备的促肝细胞生长素在波长为λ=280nm下的高效液相谱；

图四是本发明所述的促肝细胞生长素的红外光谱图；

下面结合附图和各种表格所列数据对本发明所述的促肝细胞生长素作进一部的说明：

本发明的详细的制备工艺是采集猪龄（或其它动物，如乳牛、大鼠等）小于60天乳猪的新鲜肝脏，要求离体6小时以内，去肝膜及韧带切碎；按1克肝加2～5克蒸馏水的比例加入蒸馏水后打碎制成匀浆；离心沉淀去沉渣，用透析装置截取数均分子量为10685D，重均分子量为11350D的透析液，低温浓缩，调整多肽量高于5mg/ml。然护用现有技术中的除菌方法，如正压超滤除菌。

对再生肝细胞有丝分裂的影响的实验按如下步骤进行：

促肝细胞生长素的分离Sephadex    LH20柱，直径9mm，柱长100cm，将20mg的促肝细胞生长素溶于0.5ml0.05MPBS(PH7.4)加于层析柱上，采用0.05MPBS（PH7.4）淋洗，流速为1.1ml/5min，收集样品，测光密度值，样品收集后冻干低温保存。

体内实验雄性Wistar大鼠，135～190g，于上午9∶00～11∶30在钠（4mg/100g体重）麻醉下进行32%的肝 部分切除，术后4-6小时经腹腔分别注射生理盐水4ml，促肝细胞生长素20ml，促肝细胞生长素经层析柱后的分离组分，于30小时固定于肝右叶中下1/3处取材，Bouin's液固定，包埋切片6u，H.E染，有丝分裂计数。

体外实验，雄性豚鼠200-300G，经心脏采血致死，无菌取出肝脏，冲洗后剪碎于100目尼龙网上轻研，过滤，用含10%胎牛血清1640培养液制备肝细胞悬液，细胞计数为5-7*10的5次方个/ml,0.2%台盘蓝染活率为81%。当活率大于70%时进行24孔板培养，每孔加1ml含血清1640培养液，37度，5%CO2，培育4小时，吸取各孔的上清液，正常对照组不加促肝细胞生长素，实验组每孔加含40ug促肝细胞生长素的无血清1640培养液，24小时每孔加2uci的3H-dTR，37度，5%CO2，2.5小时，分别收集各孔的细胞，用0.01MPBS冲洗3次，涂于玻璃纤维滤纸片上，37度干燥过夜，将纸片放入闪烁杯中，加闪烁液5ml，闪烁计数器测各样品的CPM值。

从小于60天的乳猪或其它附合上述条件的哺乳动物的肝脏中提取出来的提取物经Sephadex    LH20柱层析后得6个活性峰，其中第一峰占相对面积为27%，第二峰为23.3%，第三峰为14.2%，第四峰为19.4%，第五峰为10.6%，第六峰为5.5%。然后将促肝细胞生长素及各活性峰进行对再生肝细胞有丝分裂的影响的实验。

实验结果表明，除第2峰外，其余各峰均能明显促进再生肝细胞的有丝分裂。各活性峰的使用剂量均为20mg；所述的提取物经分离后的组份尽管蛋白含量减少，但活性并未见明显降低，尤其是第6峰和第3峰，其活性分别为对照组的3.3倍和3.1倍（见表一），与20mgHGF的活性相似（3.6倍）。并使体外培养肝细胞的DNA合成增加到原来的3.24 倍（表二），表明本发明所述的促肝细胞生长素能够促进细胞的DNA合成和有丝分裂。说明从乳猪中提取出来的提取物经提纯后，其产物虽蛋白含量减少，而相对活性有所提高。

促肝细胞生长素及其组分对再生肝细胞有丝分裂百分率的作用影响见下表1；各活性峰的使用剂量均为20mg促肝细胞生长素经SephadexlLH20柱层析分离后的组分：

表1.促肝细胞生长素及各活性峰对再生肝细胞有丝分裂的影响

动物数        有丝分裂百分率        倍数        P值

对照组        8        0.944        0.166

HGF(20mg)        10        3.416        0.434        3.6        <0.001

峰1        3        2.421        0.625        2.6        <0.001

峰2        5        0.460        0.311        0.5        >0.05

峰3        4        2.925        0.605        3.1        <0.001

峰4        4        2.394        0.930        2.5        <0.05

峰5        6        1.860        0.581        2.0        <0.05

峰6        3        3.130        0.640        3.3        <0.001

从表一可知，从小于60天的乳猪中提取出来的提取物的第2峰有丝分裂百分率为0.460±0.311，比盐水对照组0.944±0.166还低，但没有显著性差异（P＞0.55），因此，第2峰具有抑制肝细胞增生的作用或第2峰就是所谓的肝抑制因子。

表2    本发明促肝细胞生长素对体外肝细胞

DNA3H-dTR掺入量的影响

孔数        CPM值        倍数        P值

对照组        4        6565.3        1579.2

实研组        4        21275.5        7683.3        3.24        <0.05

本实验结果表明，从乳猪中提取出来的提取物的分子量在10，000左右，经Sephadex    LH20柱层析分离后得6个峰，5个峰具有促进肝细胞增生的活性，说明HGF的分子量在1万左右呈连续性分布（表一）。因此，促进肝细胞增生的生物因子并不是单一分子，而是许多不同分子量的蛋白和核酸共同作用的结果。

现有技术所述的肝细胞生长因子有两种来源：1.肝外来源：包括血清中肝特异性的生长因子，PDGF、胰岛素，胰高血糖素等；2.肝脏来源：即本发明所述的促肝细胞生长素。而对于上述1所述的因子能否促进肝细胞的有丝分裂没有文献报道。本发明所述的促肝细胞生长素的研究结果表明：促肝细胞生长素能促进肝细胞的DNA合成，和促进再生肝细胞的有丝分裂，证实促肝细胞生长素可做为肝细胞的有丝分裂原而存在。

将本发明所述的促肝细胞生长素不进行Sephadex    LH20柱层析分离，而用高效液相谱进行分析，在λ=280下测定本发明所述的促肝细胞生长素主要峰保留时间（tr）和峰的面积（A%）

表三    λ=280本发明所述的促肝细胞生长素主要峰保留时间（tr）和峰的面积（A%）

设定方法如下，在分离较完全的条件下：

1、可用（2+3）及4号峰表示促肝细胞生长素的主成份峰，其面积和占总峰面积的27%；

2、可用6、7、9、10号峰表征第二类峰，其面积约占总峰面积的35%；

3、其它可看作第三类表征峰；

4、所有峰的保留时间（tr）是在上述特定的谱条件下测定的，除谱分离的流动相外，也会受到使用不同厂家生产的柱而有所变化（均为反相碳十八柱）。这样，上数述批号的试样的平均数为：

峰号        1        2+3        4        5        6        7        8        9        10        11        12

A%    5.5    10.02    17.19    3.76    7.13    8.90    6.24    9.82    9.126    4.81    4.27

在λ=230nm下测定本发明所述的促肝细胞生长素主要 峰保留时间（tr）和峰面积（A%）

表四    在λ=230nm本发明所述的促肝细胞生长素主要峰保留时间（tr）和峰面积（A%）

RECALC

TITLE:HPLC    ANALYSIS    OF    HGF    PRODUCTS        11:47        6    JUL        93

CHANNEL    NO:1        SAMPLE:930504,λ=230nm    METHOD:HGF

PEAK        PEAK        RESULT        TIME        AREA        SEP

NO        NAME        A%        (MIN)        COUNTS        CODE

1        14.57        1.847        1058320        BV

2        1.17            1.975        295812        VV

3        2.42        2.026        175749        VV

4        7.39        2.121        536837        VV

5        11.30        2.404        820881        VV

6        2.59        2.697        187853        VV

7        1.80        2.837        130449        VV

8        4.07        2.917        295518        VV

9        6.86        3.121        498003        VV

10        3.82        3.573        277642        VV

11        16.46        3.852        1195300        VV

12        7.88        4.131        572303        VV

13        2.52        4.662        183398        VV

14        3.59        5.377        260895        VV

15        2.03        6.986        147232        VV

16        5.36        7.974        389223        VV

17        1.71        8.446        124053        VV

18        1.57        9.334        113865        VV

TOTALS:        100.01        7263330

MULTIPLIER:1.00000

具体的谱图见图二；

本发明制备出来的促肝细胞生长素，经高效液相谱组份分析证明，促肝细胞生长素的数均分子量为10685D，重均分子量为11350D的小分子物质；并排除促肝细胞生长素中含有胰岛素、胰高糖素的存在；活性测定表明有明显的刺激肝细胞DNA合成的作用，与盐水对照有显著的差异。

本发明所束述的促肝细胞生长素还含有多种微量元素和多种氨基酸。

表五：促肝细胞生长素的氨基酸含量的分析测定结果

表5说明：采用本发明的方法制备的促肝细胞生长素含有18种氨基酸，总量点25.06。

表六促肝细胞生长素微量元素分析测定平均值（μg/ml)

Fe        Se        Mg        Zn        Ca        Mn        Co        Cu        K

7-8        <0.05        100-150        13-16        35.0        0.40        <0.005        0.76        >2000

表6表明，促肝细胞生长素中除含有K、Na、Ca、Mg外，还存在着比正常人血清高15倍的Zn和微量的Se。

实施例一

按前述方法制备促肝细胞生长素，所述样品的数均分子量为10685D，重均分子量为11350D；以表七的表头所列条件进行谱分析，结果如表七。

实施例二

和实施例一同样的方法制备样品，在λ=280nm的波长下对本发明所述的促肝细胞生长素进行高效液相谱分析，相应的图是图三，具体的结果见表八。

实施例三

和实施例一同样的方法制备样品，在表九所列的条件下对本发明所述的促肝细胞生长素进行谱分析，相应的图是图一，具体的结果如表九列出：

实施例四

和实施例一同样的方法制备样品，对本发明所述的促肝细胞生长素进行红外光谱分析，见图四；

表七

SAMPLE:        DATA    FJLE:-57.BFF        DATE:07/28/93

METHOD:        METHOD    FJLE:-05.MTH        TIME:08:09:00

ANALYST:        SYSTEM    FILE:1

TYPE:AREA    PERCENT        RUN    NUMBER:4        JNDEX:1

WAVELENGTH:254nm

PEAK#        AREA%        RT        AREA        BC

1        0.058        0.37        20523        02

2        0.229        0.67        81398        02

3        0.058        0.69        20634        02

4        0.229        0.93        81152        02

5        0.407        0.97        144363        02

6        0.105        1.25        37126        02

7        0.096        1.31        34182        02

8        0.087        1.37        30791        02

9        0.078        1.44        27597        02

10        0.079        1.47        28088        02

11        0.626        1.65        222148        02

12        3.737        2.11        1325509        02

13        5.03        2.54        1784302        02

14        70.657        2.67        25064159        08

15        3.46        3.17        1227501        05

16        4.297        3.7        1524113        01

17        0.064        3.88        22789        01

18        2.773        4.41        983652        01

19        0.078        5.04        27440        62

20        0.063        5.25        22371        62

21        0.211        5.67        74896        62

22        1.931        5.88        685214        02

23        0.062        6.2        21836        02

24        1.099        6.41        390033        02

25        0.144        6.72        50889        02

26        0.356        7.6        126410        02

27        1.268        9.07        449748        02

28        0.193        9.97        68480        02

29        0.557        10.09        197559        02

30        0.111        10.97        39440        02

31        0.092        11.49        32485        02

32        0.132        12.04        46970        02

33        0.088        12.1        31185        02

34        0.086        12.16        30314        02

35        0.161        12.25        57239        02

36        0.068        12.37        24198        02

37        0.067        12.42        23552        02

38        0.072        12.47        25795        02

39        0.071        12.53        24923        02

40        0.103        12.65        36570        02

41        0.056        12.73        20005        02

42        0.279        12.82        99026        02

43        0.2        13.12        70894        02

44        0.08        13.45        28336        02

45        0.178        13.77        63086        02

46        0.056        14.01        20068        02

47        0.068        14.16        23983        03

TOTAL        100.        35472972