筛选方法及其应用

本发明涉及改进的筛选方法以及，具体地，涉及筛选抗配体文库的方法，以鉴定对 差 异化表达的和/或不经常表达的配体特异的抗配体。

基于蛋白质或多肽的文库经常用于对某些配体具有特异性的抗配体分子的选择。

此类文库的构造，使蛋白质分子，以某种方式，物理地连接到(physically linked to) 编码特定蛋白质分子的遗传信息。因此，该蛋白分子与其基因一起被展示。

常用的展示形式依赖于细胞或病毒宿主颗粒来提呈所述蛋白分子；并且包括细菌 展示 (Francisco等，1993)和噬菌体展示(Smith，1985；Smith和Scott，1993；Winter等， 1994)。 这些系统在宿主颗粒的表面展示潜在的抗配体分子，同时所展示分子的遗传信息 藏于颗粒 内部并且所述方法已被成功应用于基于特异性蛋白质的抗配体的筛选。

存在依赖于体外翻译的其他展示形式；包括各种形式的依赖于遗传信息与蛋白质 分子 的非共价连接的核糖体展示(Mattheakis等，1994；Hanes和Pluckthun，1997；He和 Taussig， 1997)；并且其他展示形式也依赖于体外翻译，借此，在遗传信息和潜在抗配体蛋 白质分子 之间存在共价连接，例如Profusion(Weng等，2002)或共价展示技术(Gao等， 1997)。

所展示的肽或蛋白质类抗配体库可以是完全随机化的，例如，当使用肽文库时，或 它 们可以基于插入赋予变异性的其他结构的恒定区的支架结构(constant region scaffold structure)。

通常使用的支架结构基于抗体重链和轻链可变结构域(McCafferty等，1990)，但 还可 以基于其它支架例如纤维连接蛋白(fibronectin)(Jacobsson和Frykberg，1995； Koide等， 1998)、蛋白A结构域(Stahl等，1989)或小的稳定蛋白结构域，例如BPTI (Markland等， 1991)。

从展示文库选择显示一定的结合特异性的抗配体通常通过使用所谓“生物淘选 (biopanning)”的方法来进行。

靶配体可以固定于固相表面并且文库的特异性抗配体成员暴露给固定的靶配体 以使感 兴趣的抗配体与靶配体结合。未结合的文库成员随后被洗去并且感兴趣的抗配体 被回收并 扩增。

除了抗配体文库成员之外的蛋白质类颗粒，例如表达抗体片段的噬菌体，可能是 “粘 性的(sticky)”，导致一些非靶特异性分子的结合与分离。非特异性结合可以通过以下 方式 最小化：加入某些化合物至抗配体展示构建体/配体混合物中以用作阻断剂从而减少 非特异 性抗配体的背景结合，例如牛奶、牛血清白蛋白、血清(人/胎牛)、明胶以及对于某 些(非 细胞)应用，去污剂(detergent)。

许多洗涤程序已经被设计用来减少文库成员与细胞的非特异性结合，并帮助细胞 从污 染和/或非特异性结合的文库成员上分离。

此类方法包括洗涤通过磁力固定于柱子上的细胞(Siegel等，1997)，以最小化剪 切力 并允许解离的噬菌体的重新结合。洗涤细胞的另一个方法是在更高密度介质例如 Ficoll或 Percoll中离心，以选择性去除非特异性和低亲和力抗配体，并且进一步在空间 上从游离抗 配体和非特异性结合的抗配体中分离细胞和细胞结合的抗配体(Carlsson等， 1988；Williams 和Sharon，2002)。

取决于筛选方法(selection process)的有效性，可能需要几轮淘选来去除或至 少充分 减少非特异性抗配体至期望的水平(Dower等，1991)。

在另一个筛选方法(selection method)中，靶配体结合同处于溶液中的特异性抗 配体 文库成员。然后结合的抗配体通过采用例如可回收的标签而分离，所述标签附加至靶 配体。 最常使用的标签是生物素，其允许靶分子和所展示的特异性文库成员之间的复合体 (complex)通过采用结合至固相支持物例如珠子上的亲和素而得到回收(Siegel等，1997)。

当靶配体是公知的且以纯化的形式提供时采用这些方法。一次针对一个单独靶配 体的 筛选是常规的。针对几种限定的靶配体的筛选可同时进行。靶配体可以是一种或更多 种的 小的半抗原、蛋白质、碳水化合物、DNA和脂类。

对于许多应用，针对差异表达的配体的特异性抗配体是感兴趣的。例如，当与那些 健 康对照相比，蛋白质可在源自患有疾病的患者的细胞和组织上差异表达。这些疾病包括 微 生物、病毒或寄生虫感染，哮喘，慢性炎症和自身免疫性疾病，癌症，神经、心血管或胃 肠道疾病。相似的，体液的蛋白质组成，例如，血浆、脑脊液、尿液、精液、唾液和粘液， 可能 在健康对照和患有疾病的患者之间存在差异。

因此，除了它们作为鉴定差异表达的配体的研究工具的常规应用，特异性针对差 异表 达的配体的抗配体可以用作诊断、预防和/或疾病的工具。

基因组学和蛋白质组学领域中的最新进展已经表明了许多至今尚未确定为差异 表达的 分子的存在，强调了用于针对这些潜在的靶配体产生特异性的抗配体的方法的重 要性。

许多这些差异表达的分子被期望着表达在细胞表面上，借此组成采用例如特异性 抗体 的靶向的潜在靶标，所述特异性抗体可以偶联至生物活性(例如细胞毒性)试剂 上。

巨大并且高度多样性的抗配体展示文库提供特异性针对碳水化合物、蛋白质、脂 类或 其组合作用的未知细胞配体的抗配体的分离方法。

原则上，当前可用的生物淘选过程包括基于全细胞、细胞部分和细胞膜的方法，其 允 许显示特异性针对天然构型的细胞膜配体的抗配体的展示构建体的分离。

人类和人源化的性抗体日益被用于各种疾病，包括急性和慢性炎症性疾 病、 免疫和中枢神经系统疾病以及癌症。人类性抗体被认为是人类疾病最吸引人 的方 式，这是由于它们完全的人类来源以及相关的免疫原性的缺乏，参与抗体Fc依赖的宿 主免 疫效应机制的优化能力，以及它们与其鼠源、嵌合和人源化的相似抗体相比优异的体 内半 衰期。现在人类抗体通常通过不同的技术产生，包括人源化小鼠和高度多样性的噬菌 体抗 体文库。

大的(>105独特的(unique)抗体克隆)人类抗体文库足够多样性，包含特异性针对 显 著数量的抗原的高亲和力抗体，所述抗原包括几乎所有种类的自体抗原。在自体免疫疾 病 中，自体抗原是除了作为正常组织成分之外还是体液或细胞介导的免疫反应的靶标，代 表 了突出的意义上的抗原种类。

人类抗体文库还被认为与携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠相比，当选择结 合人 类和小鼠之间结构上保守的受体表位的抗体时，提供了优势，因为这类抗体在体内是 通过 自身耐受机制负向选择的。这些保守的区域尤其具有意义，因为保守区域经常是 功能 相关的(例如结合所必须的配体结合结构域并且赋予配体/受体诱导的细胞反应)，并 且靶 向这些保守表位的抗体可被筛选为协同实验疾病模型系统内的体内活性。

特异性针对几乎所有种类人类可溶性抗原(例如细胞因子、趋化因子、生长因子、 脂 类、碳水化合物和缀合分子等)，以及细胞表面受体(例如1TM、4TM、7TM和多TM跨膜 受体 等)的高亲和力抗体已经成功从高度多样性人类抗体文库中分离出来。

细胞表面受体组成了一类具有突出的意义的靶标，并且结合不同癌症细胞相 关受 体的几种抗体已被证实用于癌症，包括利妥昔单抗(rituximab)(抗CD20)、曲妥 珠单 抗(trastuzumab)(抗Her2)和西妥昔单抗(cetuximab)(抗EGFR)。

但是，从抗体受体特异性并不能很容易地预测的有效性；针对相同靶受体的 抗体 可能在有效性上差别很大，不依赖于它们的结合亲和力(Beers等，2008；Cragg和 Glennie，2004)，并且针对替代的分子靶标的抗体可能显示是有希望的，并且有时是意想不 到的潜力(Beck等，2010；Cheson和Leonard，2008)。例如，不同CD20特异性抗体克 隆与 CD20抗原具有相似的结合亲和力并携带相同的小鼠IgG2a恒定区，但在体内消耗B细胞 的 能力根本上不同(Beers等，2008；Cragg和Glennie，2004)，并且针对其他不是CD20的 肿瘤 相关细胞表面受体的抗体可能具有针对B细胞癌症的显著抗肿瘤活性(综述请参见 Cheson 和Leonard，2008)。

因此，在高度多样性的抗体文库中，对任何给定类型的癌症最具有效性的、强 力 的和最耐受的抗体很可能是特异性针对几种不同受体的任何一种，并且在高度多样性 的文 库中鉴定性优化的抗体克隆需要对多个并且理想状况下所有的特异性针对不同 疾病细 胞相关的受体的文库成员进行功能筛选。

申请人之前已经开发了能够从人类噬菌体抗体文库回收结合至不同表面受体的 抗体克 隆的筛选技术(生物淘选方法)，与其他细胞体(非靶细胞)相比所述受体在一种 细胞 体(靶细胞)上差异表达(WO2004/023140，Fransson等，2006；Frendéus，2006)(在下 文中被称为差异生物淘选)。WO2004/023140的公开内容(和其所有国家阶段递交的衍生内 容)全文作为参考引入本发明。

这个筛选方法实质上包括六个步骤，如图1所示。重要的是，这个方法包括以下顺 序的 筛选步骤：

1)差异生物淘选，然后

2)筛选靶标对非靶标的特异性，然后

3)更小量的克隆通过Sanger技术进行常规测序

采用这个技术，使得产生显示针对差异表达表面受体的靶细胞对非靶细胞的高特 异性 的抗体池成为可能。

Sanger测序是当前用于在“低通量”方式下鉴定独特结合物的技术的一个例子。其 他 例子包括在限制性酶消化之前和之后跑抗体基因DNA的胶，并通过对不同的限制性酶 (间 接地，不同的序列)不同的敏感性揭示独特大小。

当用于分离靶向癌症B细胞(靶标)对T细胞(非靶标)差异表达的表面受体的抗体 时 (“B非T”(BnonT)差异淘选)，该方法鉴定了针对不同靶细胞差异表达的表面受体的抗 体， 包括HLA-DR、表面Ig和ICAM-1(表1)。

表1.通过现有筛选方法分离的抗体的频率和特异性，例如连续差异生物淘选、结 合筛 选和Sanger测序，靶向癌症B细胞对T细胞差异表达的表面受体(“B非T”差异淘选)

抗体序号 克隆数(检测81个) 特异性

现在申请人已经设计了改善用于检测针对感兴趣的配体的多个不同抗配体的差 异 生物淘选方法的精确性的方法。因此，本发明公开了能够从人类抗体文库(和其他分 子 文库)回收高亲和力抗配体库的方法，例如与其他细胞相比，特异性针对以其天 然细胞 表面构型、在靶细胞体中从低到高水平差异表达的不同配体(例如受体)的 人类抗体。

本发明在几个方面与之前设计的筛选方法不同(图8)。首先，通过将独一无二 的 强大的差异生物淘选方法与下一代深入测序技术和随后的特异性针对靶细胞差异表 达的 表面受体的抗体的验证筛选-“反向筛选”组合，本发明使得1)定性和2)定量独 特的抗体池 的产生成为可能。

重要的是，通过该方法鉴定的抗配体，例如抗体克隆，可以都具有潜力，因 为 基于以下原因：首先，它们与受体高亲和力结合，所述受体是a)在靶细胞对非靶细 胞上差 异表达的，以及b)在靶细胞上以其天然细胞表面构型表达；其次，文献记载了 在相关体外 和体内实验疾病模型系统中具有这些性质的抗体介导作用的能力 (Beck等，2010； Fransson等，2006)。

因此，总之，本发明使以下内容成为可能：

1.通过差异生物淘选产生抗体池使含有特异性针对以高、中和低水平表达的差异 表达的表面受体的抗体

2.存在测序抗体克隆数量的更低阈值，为了鉴定特异性针对中和低表达的表面受 体的抗体其必须被超过

3.在该更低的阈值之上，越来越多数目的抗体克隆的测序提高了所鉴定的特异性 针对中和低表达的表面受体的抗体的数量

4.在差异表达的抗体池中的特异性针对中和低表达的表面受体的抗体的广泛鉴 定 需要深度测序

因此，本发明的第一方面提供一种分离针对至少一种差异表达的靶配体的至少一 种抗配体的方法，包括以下步骤：

(a)对抗配体的文库进行差异生物淘选以分离至少一种抗配体；以及

(b)对步骤(a)中分离的抗配体进行高通量测序。

所述方法还可以包括以下步骤：

(c)对特异性针对差异表达的配体的抗体进行验证筛选

本发明方法的差异生物淘选步骤可以包括以下子步骤：

(i)提供抗配体的文库；

(ii)提供含有固定至或整合入减法(subtractor)配体构建体的配体的第一配体 ；

(iii)提供含有与步骤(ii)的配体相同并固定至或整合入靶配体构建体的配体的 第二配体；

(iv)采用从质量作用的普遍规律得出的一个或多个方程确定所述中所述减法 配体构建体和所述靶配体构建体的量：

其中：

A,B,C&D＝在该反应中的参与者(反应物和产物)

a,b,c,&d＝平衡化学方程所需的系数

从而允许针对差异表达的靶配体的抗配体的分离；

(v)提供步骤(iv)中确定的减法配体构建体的量；

(vi)提供步骤(iv)中确定的靶配体构建体的量；

(vii)提供从结合至减法配体构建体的抗配体中分离结合至靶配体构建体的抗配 体的分离装置(means)；

(viii)将(i)的文库暴露给由(v)和(vi)提供的配体构建体以允许抗配体与配 体 的结合；以及

(ix)采用所述分离装置分离结合固定至或整合入靶配体构建体的配体的抗配 体。

本发明的步骤并不意味着一定要以任何特定的顺序执行。

“提供确定的量”是指提供已知的配体的量，使得本发明的方程已被用于验证提 供的已知量适于分离所期望的抗配体。

用于给定筛选方法的反应参数可以根据本发明进行优化，通过应用质量作用定律 和由其衍生的方程的计算，并考虑如下参数，例如分子文库多样性、抗配体拷贝数、 期望的 上调的检测限、期望的抗配体亲和力以及配体浓度。

第一方面的所述方法的高通量测序步骤可以通过454测序、Illumina、SOLiD方 法、Helicos系统或那些来自Complete Genomics和Pacific Biosciences的系统进行。

下一代测序的出现使得大量(1,000s至1,000,000s)候选基因以高通量方式进行 测序成为可能(从这里开始被称为“深度测序”)。

454测序由Margulies等(2005)公开(并作为参考引入本发明)。在454方法中， 要 测序的DNA是任意分级的并带有接头(adaptor)或DNA的片段能被使用含有所述 接头的引 物进行PCR扩增。所述接头是25-mers的核苷酸，其是结合至DNA捕获珠子 并退火PCR扩增引 物和测序引物乳液所需的。所述DNA片段制备为单链并以仅允许 一个DNA片段被附加到一 个珠子的方式附加到DNA捕获珠子上。接下来，含有DNA 的珠子在油包水混合物中乳化得到 仅含有一个珠子的微反应器。

在微反应器里，所述片段被PCR扩增，每个珠子得到几百万拷贝数。PCR后，破 乳， 珠子被加载到微微滴定板(a pico titer plate)上。微微滴定板的每个孔可以仅含有 一 个珠子。测序酶加到孔里，核苷酸以固定的顺序流过孔。核苷酸的掺入导致焦磷酸 盐的释 放，其催化反应带来化学发光信号。该信号由CCD相机记录，使用软件将该信 号翻译成DNA 序列。

在Illumina方法中(Bentley(2008))，单链、带有接头的片段附加至光学透明 表 面并进行“桥式扩增”。这个过程结果带来几百万簇，每个均包含一个独特的DNA 片段的拷 贝。加入DNA聚合酶、引物和四个标记的可逆终止核苷酸并且表面通过激光 荧光成像以确 定标记的位置和性质。然后去除保护基团并且该过程重复几个循环。

SOLiD方法(Shendure(2005))与454测序类似，在珠子的表面扩增DNA片 段。测序 包括连接和标记探针的检测的循环。

目前正在开发几种其它用于高通量测序的技术。此类技术的例子有Helicos系统 (Harris(2008))、Complete Genomics(Drmanac(2010))和Pacific Biosciences (Lundquist (2008))。由于这是一个极其快速发展的技术领域，适用于本发明的高通量测 序方 法对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

尽管能够对长片段DNA，例如那些编码抗体可变结构域(Fv)、scFv或Fab序 列的 DNA测序的仪器只处于原型阶段，当前可用的仪器确实使较短DNA片段，例如 编码并跨越 scFv CDRH1至CDRH3结构域的序列的测序成为可能。但是，当测序技术 得以改进以允许长 片段DNA测序时，这些技术也将在本发明的方法中工作良好。

本发明方法的验证筛选步骤可以通过检查所分离的抗配体池和/或个体抗配体克 隆与靶构建体对减法构建体的特异性配体结合而完成，可以采用任何能够检查配体/抗 配 体结合的方法，例如流式细胞术、FAMT(Fluorescent Microvolumetric Assay Technology，荧光微体积测定技术)、ELISA(酶联免疫吸附法)、MSD(Meso Scale Discovery，中尺度发现)和CBA(Cytometric Bead Array，流式微珠阵列)。

在一个实施方案中，方法的配体不表达于无论是靶构建体或减法构建体之一之 上， 即，它仅表达于靶构建体或减法构建体的一个之上。

在另一个实施方案中，方法的配体以较高水平表达于无论是靶构建体或减法构建 体的一个之上。

差异生物淘选方法可以进一步包括从配体释放抗配体的子步骤。

优选地，差异生物淘选步骤的步骤(ii)至(ix)平行进行，以分离多个抗配体至 多 个不同配体。

差异生物淘选步骤的步骤(ii)至(ix)重复一次或多次。

优选地，减法构建体或靶构建体之一的差异生物淘选步骤中的量以过量于减法构 建体或靶构建体的另一个的方式提供。配体过量可以是在10和100倍之间，但也还可 以是 在2和10倍或1000和100,000倍之间。

减法配体过量的幅度决定了能够检测的最高可能的“分辨率”(即能在特异性 针对低上调、中上调、高上调或独特表达的配体的抗配体之间分辨得如何好)，以及 能在不 同表达的配体之间分辨得如何好。例如，如果使用具有100个靶配体特异性的 抗配体的文 库并且加入足够大浓度的阳性配体以使得所有抗配体都结合配体达到平衡 状态，然后10 倍过量的减法配体将会允许降低90％特异性针对常规表达的配体的抗 配体的频率，而 200倍过量(抗配体特异性结合物数量的两倍)将会允许去除常规结 合物(参见WO 2004/ 023140，图5以及实施例4的最后一段的数据显示了这一点)。

在一个实施方案中，差异生物淘选步骤的步骤(iv)的方程是：

其中

bA＝结合的抗配体

A＝抗配体的总数

T＝配体的总数

C＝阿伏伽德罗常数(6.022x 1023颗粒/摩尔)

V＝反应体积(升)

Kd＝平衡解离常数

在一个可选实施方案中，差异生物淘选步骤的步骤(iv)的方程是：

其中

bAp＝结合的抗配体

Tp＝Cp上的配体数量

Ts＝Cs上的配体数量

Cp＝靶配体构建体的数量

Cs＝减法配体构建体的数量

A＝抗配体的总数

T＝配体的总数

C＝阿伏伽德罗常数(6.022x 1023颗粒/摩尔)

V＝反应体积(升)

Kd＝平衡解离常数

差异生物淘选步骤的分离装置可以选自至少一种固相支持、细胞膜和/或其部分、 合成膜、珠子、化学标签和自由配体。减法和靶构建体的分离装置可以具有不同的密 度。减 法构建体的分离装置可以优选膜囊或全细胞膜。

差异生物淘选方法的步骤(ix)可以通过至少一种分离方法进行，所述分离方法 是密度离心(Williams和Sharon，2002)、固相支持封存(solid support sequestration)、 磁珠封存(Siegel等，1997)、化学标签结合(chemical tag binding)和水相分割(aqueous phase partitioning)之一。

更优选地，分离方法是密度梯度例如Ficoll、Percoll、碘化密度介质上进行的密 度 离心，其中在离心过程中，第一和第二靶配体通过Ficoll梯度移动至不同程度，借此 第 一和第二靶配体可以从它们不同的终点分离。

最优选地，分离方法采用蔗糖聚合物梯度，例如Ficoll。

步骤(a)的文库优选包含多个展示抗配体的文库成员的展示文库。此类文库的例 子是噬菌体展示文库，其中抗配体展示于噬菌体的表面。

在噬菌体(phage)表面的融合至噬菌体外壳蛋白之一的蛋白质和多肽的展示提供 了选择特异性配体的强大工具。该“噬菌体展示”技术最初是由Smith在1985年使用， 为了 创建大的抗体文库已筛选对特定抗原具有高亲和力的抗体。最近，为了鉴定具有 期望性质 的配体，该方法已被用于在噬菌体表面提呈肽、蛋白结构域和完整蛋白。

噬菌体展示技术背后的原理如下：

(i)编码用于展示的蛋白或多肽的核酸被克隆入噬菌体；

(ii)所克隆的核酸表达融合至噬菌体外壳蛋白之一的外壳锚定部分(在丝状噬 菌体的情况下，通常为p3或p8外壳蛋白)，这样外源蛋白或多肽被展示在噬菌体的 表面上；

(iii)然后，筛选出展示具有期望性质的蛋白或多肽的噬菌体(例如通过亲和层 析)，从而提供可被测序、扩增并转移到其他表达系统的基因型(连接到表型)。

另外，外源蛋白或多肽可以采用可包装成噬菌体外壳中的单链核酸的噬菌粒载体 (即含有源自噬菌体和质粒的复制起点的载体)表达。当采用噬菌粒载体时，“辅助 噬菌体” 用于提供噬菌粒核酸的复制和包装功能。所得到的噬菌体会同时表达野生型 外壳蛋白(由 辅助噬菌体编码)和修改过的外壳蛋白(由噬菌粒编码)，而当使用噬 菌体载体时仅修改过 的外壳蛋白表达。

采用噬菌体展示分离结合生物相关分子的配体已被综述在Felici等(1995)、Katz (1997)和Hoogenboom等(1998)。已经建成多个随机组合肽文库以筛选结合不同 靶标(例如 细胞表面受体或DNA)的多肽(Kay和Paul，(1996))。

蛋白质和多聚体蛋白已成功通过噬菌体展示为功能性分子(参见Chiswell和 McCafferty，(1992))。此外，功能性抗体片段(例如Fab、单链Fv[scFv])已被表 达 (McCafferty等(1990)；Barbas等(1991)；Clackson等，(1991))，并且某 些人单克隆抗体技 术的缺点已被取代，因为人高亲和性抗体片段已被分离(Marks等， (1991)以及Hoogenboom 和Winter(1992))。

关于噬菌体展示的原理和实践的进一步信息提供在Phage display of peptides and proteins:a laboratory manual Ed Kay,Winter和McCafferty(1996)，其内容通过引 用 并入本文。

抗配体文库可构建自至少以下一种：抗体和抗原结合变体、其衍生物或其片段； 具有工程化的可变表面的支架分子(scaffold molecule)；受体和酶。

差异表达的配体可以至少是以下一种：抗原；受体配体；以及含有来自碳水化合 物；蛋白质；肽；脂类；多核苷酸；无机分子和缀合分子(conjugated molecule)的至 少一种 的酶靶标。

本发明的方法还可以包括暴露配体和它的分离装置(从差异生物淘选步骤)至影 响在所述配体构建体上的靶配体的表达的刺激物(stimulus)的其他步骤。

本发明鉴定的所选的抗配体可以随后用于制备用于疾病的、成像、诊断或预 后医学的药物组合物。基于抗体及最重要的人类抗体的抗配体具有很大的潜力。

因此，本发明的第二个方面提供制备药物组合物的方法，其包括，在通过根据前 述任一权利要求所述的方法鉴定具有期望性质的抗配体后，将所述抗配体加至药学上 可 接受的载体。

本发明的第三个方面提供由第二方面的方法制备得到的药物组合物，其用于医 学。 该药物组合物还可以用于制备用于疾病的预防、、成像、诊断或预后的药物。

定义

“生物淘选”是指从期望的抗配体-配体结合对基于其以高亲和力结合另一个成 员的能力筛选一个成员的方法。

“差异生物淘选”是指从期望的抗配体-配体结合对基于其以高亲和力结合另一 个成员的能力筛选一个成员的生物淘选方法，所述抗配体-配体结合对在两种不同来源 (例如减法/对照和靶标)之中或之上以不同量表达。

“高通量测序”是指大量序列平行测序(高达数百万)，使得大量分子的测序速 度 是切实可行的并且变得显著更快和更便宜。

“验证筛选”是指检测所分离的抗配体池和/或个体抗配体克隆与靶构建体对减法 构建体的特异性配体结合，可以采用任何能够检查配体/抗配体结合的方法，例如流式 细 胞术、FAMT、ELISA、MSD和CBA。该术语还指，一旦抗配体被鉴定为结合至差 异表达的配体， 配体的性质和特性以及抗配体与配体之间的结合相互作用就被研究。

“配体”是指配体/抗配体结合对的一个成员。配体可以例如是互补的、杂交的核 酸双螺旋结合对中的一条核酸链；效应子/受体结合对中的效应子分子；或抗原/抗体或 抗 原/抗体片段结合对中的抗原。

“抗配体”是指配体/抗配体结合对的另一个成员。抗配体可以分别是互补的、杂 交的核酸双螺旋结合对中的另一条核酸链；效应子/受体结合对中的受体分子；或抗原/ 抗 体或抗原/抗体片段结合对中的抗体或抗体片段分子。

“抗原”是指一种分子或化合物，其能够与抗体相互作用但不必然产生免疫反应。 这些抗原包括，但不限于，蛋白、肽、核苷酸、碳水化合物、脂类或其缀合物的分子。

“差异表达的配体”是指在靶和减法来源之间以不同水平表达的配体，包括那些 仅在某种条件/位置而不在其他条件/位置表达的；或其中靶标或减法配体是来自靶标和 减法配体的另一个的修改过的版本。例如，某些抗原在疾病细胞(例如癌症细胞)的 细胞表 面高表达而在相应的健康细胞(例如非癌性细胞)上低水平表达或根本不表达。

“低表达配体”是指那些以低水平表达的配体，即每个细胞低于20,000拷贝，例 如 在5,000和20,000(这包括大多数野生型表达的细胞表面受体)之间，或发生频率小 于在阳 性配体样品中的任何其他、更高表达的配体的1％的配体。

“配体构建体”是指包括与分离装置相连的靶标和/或减法配体的系统。

术语“抗体变体”应当被用来指任何合成抗体、重组抗体或抗体杂交体，例如， 但 不限于，免疫球蛋白轻和/或重链可变和/或恒定区的噬菌体展示制得的单链抗体分 子，或 是能够与本领域技术人员已知的免疫分析形式中的抗原结合的其他免疫相互作 用分子。

术语“抗体衍生物”是指任何修改过的抗体分子，其能够以本领域技术人员已知 的免疫分析形式与抗原结合，例如抗体的片段(例如Fab或Fv片段)，或是通过插入 一个或 多个氨基酸或其他分子以促进抗体偶联至另一肽或多肽、至大的载体蛋白或至 固相支持 物(例如氨基酸酪氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸及其衍生物， NH2-乙酰基团或 COOH-端酰胺基团以及其他分子)而修改的抗体分子。

“密度离心”是指物品例如细胞、细胞器和大分子根据它们的密度的不同的分离。 该分离通过采用合适溶液的密度梯度离心获得，通过该分离方式，被分离的物品基于 它们 的密度而移动。

“质量作用定律”是在任何情况下均适用的自然界的普遍定律。该定律指出，对 于 反应：

aA+bB→cC+dD

并且如果该系统处于给定温度的平衡状态，那么以下比率是一个常数：

其中：

A,B,C&D＝在该反应中的参与者(反应物和产物)

a,b,c,&d＝平衡的化学方程所需的系数

并且其中常数是以浓度(由[]表示)计算的并且K的单位为Mc+d-(a+b)。

现在将描述实施本发明的某些方面的实施例，参考以下附图，其中：

图1Fransson等Int J Canc 2006所描述的差异生物淘选方法的示意图。箭头下面 的数字表示噬菌体-abs或在五个筛选步骤(1-5)和随后的两个合成和鉴定步骤(6)和 (7) 的每一个之后的筛选过程中留下的抗体克隆的数量。步骤是：(1)差异生物淘 选，(2)scFv 转换的克隆的集落挑取，(3)单克隆水平的scFv克隆的表达，(4) 特异性针对靶细胞差异表 达的表面受体的scFv克隆的筛选，(5)独特抗体序列的ID 的测序，(6)IgG合成，以及(7)体 外/体内功能测试

图2计算机计算显示，源自癌症B细胞对Jurkat T细胞(“B非T”)的差异生 物淘选 的抗体池应包含与采用常规方法实验性鉴定的相比多得多的针对几种差异表达 的表面受 体的每一个的抗体。

(1)表示计算按照WO2004/023140所教导的进行

图3源自DU-145前列腺癌对Jurkat T细胞(“D非T”)的差异生物淘选的噬 菌体-抗 体池对靶细胞(DU-145)高度特异。

A)该图显示，如通过FACS分析的，噬菌体池与靶DU145细胞的剂量依赖特异 性结 合，其在两轮差异生物淘选后获得。需要注意的是，没有结合到非靶标Jurkat细 胞的可检 测到的信号。

B)该图显示，如通过FMAT分析的，在DU145细胞对Jurkat细胞的两轮差异生 物淘 选后获得的池的1408个单独的、随机筛选的克隆的每一个特异性结合。

图4靶DU-145细胞表达几种表面受体，其基于它们绝对靶细胞表达水平和它们 在 靶对非靶细胞表面上的相对表达水平可被分类为“高差异表达的”、“中差异表达 的”或“低 差异表达的”。

靶(DU145)和非靶(Jurkat)细胞利用流式细胞术通过使用Zenon Alexa Fluor 647 标记的抗体筛选三个抗原：HER2、CD24和CD130的表达。

A)该图显示用zenon标记的抗体染的靶和非靶细胞的平均荧光强度。

B)该图显示表达HER2、CD24和CD130的细胞的百分比。

图5 Scatchard曲线分析(Scatchard plot analyses)显示由差异生物淘选分离 的抗 体靶向的差异表达的表面受体的表达水平以及每个细胞深度测序范围从6,000-400, 000 受体。

A.饱和曲线

B.Rosenthal曲线(Rosenthal plots)。抗CD130抗体的亲和力(KD)被估计为0.8 nM并且CD130表面受体的数量为6.300/细胞。抗CD24抗体的亲和力被估计为5.6nM 并且表 位的数量为8.400/细胞。抗HER2的亲和力被估计为47nM并且表位的数量为 110,000/细胞。 评估由125I标记的抗体结合至INF-γ刺激的DU145细胞的Rosenthal曲 线来完成。

图6源自DU-145前列腺癌对Jurkat T细胞(“D非T”)的差异生物淘选的抗 体池含 有特异性针对高表达、中表达和低表达的差异表达的表面受体的抗体克隆。

基于scatchard和FACS分析(图4和5)，HER2、CD24和CD130被定性为以不 同水平表 达的受体。

A)该图显示，如通过ELISA分析的，特异性针对所有抗原的抗体克隆存在于 DU- 145对Jurkat细胞的两轮差异生物淘选产生的抗体池中。

B)该图显示，当选中A中靶特异性克隆并重新检测结合时，大多数克隆仍然对靶 抗原是阳性的。回收的靶表面受体特异性抗体克隆的测序证实(至少)12个独特抗体 存在 于差异筛选的抗体池中；八(8)个抗HER2，一(1)个抗CD24以及三(3)个 抗CD130的抗体

图7越来越多的差异筛选的抗体克隆的测序导致鉴定出越来越多的特异性针对低 表达的靶细胞差异表达的表面受体的抗体克隆。

确定了在三个随机选择的规模越来越大的(分别为91克隆、255克隆和813克隆) 结合物池中的抗体克隆序列。此后，在所有三个池中均发现的克隆(“富克隆”)、 仅在两个 较大池中发现的克隆(“较低频克隆”)或仅在最大的池中发现的克隆(“稀 有克隆”)通过 FACS分析其与DU145细胞的结合并比较了富、较低频和稀有克隆的 平均荧光强度。

数据清楚地表明平均受体表达水平：富克隆>中频克隆>稀有克隆。因此，越来越 多的差异筛选的抗体克隆的测序导致鉴定出越来越多的特异性针对低表达的靶细胞差 异 表达的表面受体的抗体克隆。

A)该图显示用各个抗体克隆染的DU-145细胞的平均荧光密度。

B)该图显示个体抗体克隆结合其上的靶细胞的百分比。

由于克隆是随机选择的，它们中的一些是非结合物并且这些在分析之前去除(结 合物定义为在％的阳性染细胞和几何平均值上均给出至少两倍于阴性对照的信号的 克 隆，或，另外可选的，三倍于几何平均值的高信号的克隆)。

*＝p<0,05，**＝p<0,01如利用ANOVA采用用于多重分析的Bonferroni校正所计算 的。

图8该示意图描绘了之前描述的差异生物淘选筛选方法(A.，上图)和新的增强 方 法(B.，下图)的筛选步骤的对比

这两个方法在几个方面不同：第一，在反向筛选方法中，WO2004/023140差异生 物 淘选的结合特异性步骤的噬菌体-ab至scFv的转换、scFv的表达和scFv的筛选已经 被省略 了。第二，在反向筛选方法中，差异生物淘选后面直接跟着(深度)测序，而 在WO2004/ 023140的筛选方法中，池中抗体克隆的测序前面是针对靶细胞差异表达的 表面受体特异 性的个体scFv克隆的筛选。第三以及最重要的是，采用反向筛选方法所 获得的抗体克隆的 数量(数万)和抗体克隆的质量(包括大量产生的特异性针对低表 达的差异表达受体的抗 体)实际上不能采用A的之前描述的差异生物淘选方法获得。

步骤是：(1)差异生物淘选，(2)scFv转换的克隆的集落挑取，(3)单克隆水 平的 scFv克隆的表达，(4)特异性针对靶细胞差异表达的表面受体的scFv克隆的筛 选，(5)独特 抗体序列的ID的测序，(6)IgG合成，以及(7)体外/体内功能测试，

(2’)下一代深度测序，(3’)HT IgG合成，(4’)特异性针对靶细胞差异表达 的表面 受体的IgG克隆的筛选，(5’)体外/体内功能测试

图9源自DU-145前列腺癌症对Jurkat T细胞的两轮差异生物淘选的回收的噬菌 体-抗体池的计算机计算。

实施例1–差异生物淘选结合随后的高通量测序产生数量空前的特异性针对差异 表 达的靶细胞表面受体的独特抗体克隆

通过癌症B细胞对Jurkat T细胞(“B非T”)的差异生物淘选产生抗体池

在该实验中，来自含有大约1010基因型独特的结合物的高多样性的n-CoDeR文库的 2x1013噬菌体颗粒与全B淋巴瘤细胞系Ramos细胞(阳性筛选)以及来自T白血病细胞系 Jurkat的质膜或粗膜囊(阴性筛选)混合。与T细胞白血病细胞系Jurkat相比，特异性针 对 独特表达于B淋巴瘤细胞系Ramos的抗原的结合物被选择性分离。

用于筛选的阳性和阴性细胞数目的计算

用于不同筛选轮次的细胞数量按照WO2004/023140中教导的进行计算。计算所用 的 反应参数如图2所示。

选定阳性和阴性细胞数量，以使三轮筛选后，对B细胞上独特表达的抗原具有特异 性 的结合物能与B和T细胞上以同等密度表达的抗原相比富集10,000倍。

特异性针对在第2和3轮筛选中不同种类抗原(阳性细胞富集的、阳性细胞独特的 或 阳性/阴性细胞常规表达的抗原)的噬菌体结合物的输入数量通过用放大因子 (amplification factor，AF)乘以洗脱的噬菌体(特异性针对第1和2轮筛选后的不同种类 抗原)的计算的 数来计算。

放大因子是用相关筛选轮后得到的洗脱的噬菌体的总数除以相同筛选轮后扩增 的噬 菌体的总数获得。

实验方法

细胞培养

Jurkat T细胞系、克隆E6-1和Ramos B淋巴瘤细胞系，于37℃湿润的空气中，用补 充了10％FCS(仅对Ramos细胞使用热灭活的)、10mM HEPES和1mM丙酮酸钠的RPMI 1640中培 养。细胞以1-2x106细胞/ml保持(Jurkat为<1x106细胞/ml)。

Jurkat T细胞质膜的制备

Jurkat细胞培养

Jurkat E6-1细胞，于37℃湿润的5％CO2空气中，保持在补充10％胎牛血清 (Gibco， 批号1128016)、1mM丙酮酸钠(Gibco)和10mM Hepes缓冲液(Gibco)的带有 Glutamax I(Gibco,