一种联合提取蛋白和多糖的方法

一种联合提取蛋白和多糖的方法

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体而言，涉及一种联合提取蛋白和多糖的方法。

背景技术

裸藻是一种单细胞真核生物，其营养物质含量非常丰富，被称为水中的“冬虫夏草”。裸藻中含有丰富的多糖、蛋白、不饱和脂肪酸、维生素、氨基酸等营养物质。其中，蛋白和多糖的总含量占其干重的50%以上。裸藻多糖是裸藻中最重要的产物，主要由β-1，3-葡萄糖构成，具有抗病毒、增强免疫力、消炎、降尿酸、降血脂、降血糖、降血压、保护生殖系统等功能；裸藻蛋白又称为裸藻活性蛋白，能够促进裸藻内能量合成与电子传递，具备调节细胞活性和免疫功能等功效，并对肿瘤细胞以及某些有害细胞具有杀灭作用。因此，裸藻多糖和裸藻蛋白在功能性食品、生物医药、临床、水产等领域均有广阔的研究前景和应用前途。然而，国内关于裸藻产品及其开发利用的研究目前尚处于起步阶段，现有的技术大都集中在裸藻多糖这种单一性物质的提取工艺且提取率较低。

发明内容

鉴于此，本发明提出了一种联合提取蛋白和多糖的方法，旨在解决现有技术中裸藻中的多种营养物质难以同时提取且提取率较低的问题。

本发明提供了一种联合提取蛋白和多糖的方法，包括以下步骤：包括以下步骤：

步骤1，称取一定量的裸藻干粉，以预设质量比向其中加入碱性溶液，在第一预设温度下水浴提取第一预设时长，降至室温；

步骤2， 对步骤1得到的混合物进行离心分离，收集第一上清液，向分离的固体中加入适量水，在第二预设温度下水浴提取第二预设时长，降至室温；

步骤3， 对步骤2得到的产物进行离心分离，收集第二上清液，并与第一上清液混合，调节混合溶液的 pH至中性，并将混合溶液的体积浓缩至初始体积的1/15-1/30；

步骤4，在室温搅拌状态下，向上述浓缩液中加入无水乙醇，至无水乙醇在溶液中的占比达到第一体积分数，静置一段时间后，对该混合物进行离心分离，收集第一沉淀，并对所述第一沉淀依次进行脱水和烘干，得到主要成分为裸藻蛋白的第一产物；

步骤5，向步骤4中离心分离后得到的上清液中加入无水乙醇，至无水乙醇在溶液中的占比达到第二体积分数，静置一段时间后，对该混合物进行离心分离，收集第二沉淀，并对第二沉淀依次进行脱水和烘干，得到主要成分为裸藻多糖的第二产物。

进一步地，上述方法中，所述步骤1中的质量比为1:15-25。

进一步地，上述方法中，所述步骤2中，加入的水的体积为分离的固体体积的10-30倍。

进一步地，上述方法中，所述步骤2中，水浴提取的同时，采用超声波进行辅助提取。

进一步地，上述方法中，所述第一预设温度为60-90℃；和/或所述第二预设温度为55-85℃。

进一步地，上述方法中，所述第一体积分数为30-50%。

进一步地，上述方法中，所述第二体积分数为50-70%。

进一步地，上述方法中，所述步骤4中，采用无水乙醇对所述第一沉淀进行脱水处理。

进一步地，上述方法中，所述步骤5中，采用无水乙醇对所述第二沉淀进行脱水处理。

进一步地，上述方法中，所述步骤2中的离心分离的转速为3000-5000rpm；所述步骤3中的离心分离的转速为3000-5000rpm；所述步骤4中的离心分离的转速为3000-5000rpm；所述步骤5中的离心分离的转速为3000-5000rpm。

本发明提供的联合提取蛋白和多糖的方法，通过选用安全无毒的无水乙醇对裸藻干粉中的水提物进行多次分离，一方面能够快速实现裸藻中蛋白和多糖的分离，提高裸藻中营养物质的利用效率；另一方面，使得提取得到的蛋白和多糖能够安全的应用在食品、保健品相关领域；工艺路线简单，流程短，设备投入小，生产成本低，能够快速实现工业化生产。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也视为本发明的保护范围。

本发明提供了一种联合提取蛋白和多糖的方法，包括以下步骤：

步骤1，称取一定量的裸藻干粉，以预设质量比向其中加入碱性溶液，在第一预设温度下水浴提取第一预设时长，降至室温。

具体而言，碱性溶液可以为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸钾溶液等。裸藻干粉与碱性溶液的质量比为1:15-25。碱性溶液的质量浓度为0.5-2.5%。该步骤中，采用碱性溶液使得裸藻中的多糖和蛋白快速溶出。

第一预设温度优选为60-90℃。例如第一预设温度可以为60℃、70℃、80℃、90℃。第一预设时长可以为1-3小时。

优选的，在第一次水浴提取时采用超声波搅拌进行辅助提取，以促进蛋白和多糖的溶出。

步骤2， 对步骤1得到的混合物进行离心分离，收集第一上清液，向分离的固体中加入适量水，在第二预设温度下水浴提取第二预设时长，降至室温。

具体而言，加入的水的体积为分离的固体体积的10-30倍。

第二预设温度优选为55-85℃。例如第二预设温度可以为55℃、65℃、70℃、80℃、85℃。第二预设时长可以为1-3小时。

优选的，在第二次水浴提取时采用超声波搅拌进行辅助提取，以促进剩余固体中的蛋白和多糖的溶出。

该步骤中，离心分离的转速为3000-5000rpm，优选为4000rpm。

步骤3， 对所述步骤2得到的产物进行离心分离，收集第二上清液，并与第一上清液混合，调节混合溶液的 pH至中性，并将混合溶液的体积浓缩至初始体积的1/15-1/30。其中，调节pH的作用是使整个溶液处于中性，避免蛋白质和多糖长期处于碱性环境而变性，中性也有利于后续产品的直接利用。浓缩的目的是提高固形物含量，减少后续处理过程中的乙醇使用量，提高产品的收率。

具体而言，可以选用磷酸、硼酸等调节混合溶液的pH。

该步骤中，离心分离的转速为3000-5000rpm，优选为4000rpm。该步骤中，可以选用旋转蒸发仪对混合溶液进行浓缩。

步骤4，在室温搅拌状态下，向上述浓缩液中加入无水乙醇，至无水乙醇在溶液中的占比达到第一体积分数，静置一段时间后，对该混合物进行离心分离，收集第一沉淀，并对所述第一沉淀依次进行脱水和烘干，得到主要成分为裸藻蛋白的第一产物。

具体而言，第一体积分数为30-50%。向浓缩液中加入无水乙醇后，可以静置30-60min。

原理：在水中，多数多糖的溶解度要远高于多数蛋白，当加入乙醇之后，乙醇将与蛋白和多糖竞争性的与水分子结合，由于乙醇的竞争能力更强，所以水分子优先和乙醇结合，而与蛋白和多糖结合的水分子会相应减少，所以，随着乙醇的加入，溶解度更低的蛋白质由于与之结合的水减少将会率先析出，而多糖的析出会需要更高浓度的乙醇。在整个溶液中，由于蛋白质和多糖是相互均匀混合的，所以，当蛋白质率先析出时，少量的多糖也会被蛋白质沉淀裹挟而一同沉淀出来。同时，少量溶解度较低的多糖也会在这个乙醇浓度中沉淀出来，所以第一次的沉淀中会含有少量多糖，但大部分的多糖仍处于溶解状态。

本实施例中，优选的，采用无水乙醇对所述第一沉淀进行脱水处理；为了保证脱水效果，可以采用无水乙醇对第一沉淀进行多次脱水。例如选用无水乙醇对第一沉淀脱水三次。

该步骤中，离心分离的转速为3000-5000rpm，优选为4000rpm。

步骤5，向所述步骤4中离心分离后得到的上清液中加入无水乙醇，至无水乙醇在溶液中的占比达到第二体积分数，静置一段时间后，对该混合物进行离心分离，收集第二沉淀，并对第二沉淀依次进行脱水和烘干，得到主要成分为裸藻多糖的第二产物。

具体而言，第二体积分数为50-70%。向上清液中加入无水乙醇后，可以静置30-60min。

该步骤中，离心分离的转速为3000-5000rpm，优选为4000rpm。

优选的，采用无水乙醇对所述第二沉淀进行脱水处理；为了保证脱水效果，可以采用无水乙醇对第二沉淀进行多次脱水。例如选用无水乙醇对第二沉淀脱

水三次。

下面以几个具体的实施例详细描述本发明。

实施例1

称取15g裸藻干粉，按质量比1:15加入浓度为0.5%的氢氧化钠溶液，超声波辅助下，60℃水浴下提取1小时，降温至室温；

4000rpm下离心5min，收集上清液，向剩余固体中加入15倍体积的水，超声波辅助下，80℃水浴下提取1小时，降温至室温；

4000rpm下离心5min，收集上清液，与步骤2中的上清液合并，调节pH至中性，旋转蒸发浓缩至体积为原来的1/15；

上述浓缩液分两次加入无水乙醇，第一次在室温搅拌下加入无水乙醇，至无水乙醇体积分数达到45%，静置30min后，4000rpm下离心5min，收集沉淀，沉淀用无水乙醇脱水三次，烘干，即为裸藻蛋白，共收集裸藻蛋白固体粉末0.83g。采用凯氏定氮法和苯酚硫酸法对得到的裸藻蛋白固体粉末进行检测，蛋白含量为78.8%，多糖含量为18.6%。

上清液中第二次加入无水乙醇，至无水乙醇体积分数达到65%，静置30min后，4000rpm下离心5min，收集沉淀，沉淀用无水乙醇脱水三次，烘干，即为裸藻粗多糖，共收集裸藻多糖体粉末3.76g。采用凯氏定氮法和苯酚硫酸法对得到的裸藻多糖固体粉末进行检测，蛋白含量为19.4%，多糖含量为76.3%。

实施例2

称取15g裸藻干粉，按质量比1:20加入浓度为1.0%的氢氧化钠溶液，超声波辅助下，70℃水浴下提取2小时，降温至室温；

用磷酸调节溶液的pH至7.0，4000rpm下离心5min，收集上清液，向剩余固体中加入20倍体积的水，超声波辅助下，80℃水浴下提取2小时，降温至室温；

4000rpm下离心5min，收集上清液，与步骤2中的上清液合并，调节pH至中性，旋转蒸发浓缩至体积为原来的1/15；

上述浓缩液分两次加入无水乙醇，第一次在室温搅拌下加入无水乙醇，至无水乙醇体积分数达到50%，静置30min后，4000rpm下离心5min，收集沉淀，沉淀用无水乙醇脱水三次，烘干，即为裸藻蛋白，共收集裸藻蛋白固体粉末0.96g。采用凯氏定氮法和苯酚硫酸法对得到的裸藻蛋白固体粉末进行检测，蛋白含量为73.4%，多糖含量为21.6%。

上清液中第二次加入无水乙醇，至无水乙醇体积分数达到70%，静置30min后，4000rpm下离心5min，收集沉淀，沉淀用无水乙醇脱水三次，烘干，即为裸藻多糖，共收集裸藻多糖体粉末4.15g。采用凯氏定氮法和苯酚硫酸法对得到的裸藻多糖固体粉末进行检测，蛋白含量为14.9%，多糖含量为81.53%。

实施例3

称取10g裸藻干粉，按质量比1:25加入浓度为2.0%的氢氧化钠溶液，超声波辅助下，80℃水浴下提取3小时，降温至室温；

4000rpm下离心5min，收集上清液，剩余固体中加入30倍体积的水，超声波辅助下，80℃水浴下提取3小时，降温至室温；

4000rpm下离心5min，收集上清液，与步骤2中上清液合并，调节pH至中性，旋转蒸发浓缩至体积为原来的1/25；

上述浓缩液分两次加入无水乙醇，第一次在室温搅拌下加入无水乙醇，至无水乙醇体积分数达到45%，静置30min后，4000rpm下离心5min，收集沉淀，沉淀用无水乙醇脱水三次，烘干，即为裸藻蛋白，共收集裸藻蛋白固体粉末0.98g。采用凯氏定氮法和苯酚硫酸法对得到的裸藻蛋白固体粉末进行检测，蛋白含量为78.4%，多糖含量为18.7%。

上清液中第二次加入无水乙醇，至无水乙醇体积分数达到65%，静置30min后，4000rpm下离心5min，收集沉淀，沉淀用无水乙醇脱水三次，烘干，即为裸藻多糖，共收集裸藻多糖体粉末4.36g。采用凯氏定氮法和苯酚硫酸法对得到的裸藻多糖固体粉末进行检测，蛋白含量为8.9%，多糖含量为82.33%。

实施例4

称取10g裸藻干粉，按质量比1:25加入浓度为2.5%的氢氧化钠溶液，超声波辅助下，90℃水浴下提取3小时，降温至室温；

4000rpm下离心5min，收集上清液，向剩余固体中加入30倍体积的水，超声波辅助下，80℃水浴下提取3小时，降温至室温；

4000rpm下离心5min，收集上清液，与步骤2中上清液合并，调节pH至中性，旋转蒸发浓缩至体积为原来的1/30；

上述浓缩液分两次加入无水乙醇，第一次在室温搅拌下加入无水乙醇，至无水乙醇体积分数达到35%，静置30min后，4000rpm下离心5min，收集沉淀，沉淀用无水乙醇脱水三次，烘干，即为裸藻蛋白，共收集裸藻蛋白固体粉末1.15g。采用凯氏定氮法和苯酚硫酸法对得到的裸藻蛋白固体粉末进行检测，蛋白含量为73.4%，多糖含量为22.7%。

上清液中第二次加入无水乙醇，至无水乙醇体积分数达到60%，静置30min后，4000rpm下离心5min，收集沉淀，沉淀用无水乙醇脱水三次，烘干，即为裸藻多糖，共收集裸藻多糖体粉末4.29g。采用凯氏定氮法和苯酚硫酸法对得到的裸藻多糖固体粉末进行检测，蛋白含量为7.6%，多糖含量为85.61%。

综上，本发明提供的联合提取蛋白和多糖的方法，通过在碱性条件下使裸藻中多糖、蛋白快速溶出，然后采用水提醇沉法联合提取裸藻中多糖和蛋白；采用不同浓度乙醇，沉淀分离蛋白和多糖，一步法同时得到裸藻蛋白和裸藻多糖，快速实现了裸藻中蛋白和多糖的分离，且工艺路线简单，流程短，设备投入小，生产成本低，能够快速实现工业化生产。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。