EMS诱变W64A花粉高效获得分蘖突变体的方法

EMS诱变W64A花粉高效获得分蘖突变体的方法 

技术领域

本发明涉及一种EMS诱变玉米花粉的方法，特别是涉及到一种甲基磺酸乙酯EMS诱变W64A花粉高效获得分蘖突变体的方法。 

背景技术

玉米是世界上仅次于小麦和水稻的农作物。通过杂交手段培育的新品种的发展空间较小，品种的抗逆性不全面。利用诱变技术培育玉米新品种，其变异范围广，可产生自然突变难以出现的新基因突变体。所以，玉米诱变技术是一种高效快速培育新品种的方法。目前，玉米诱变技术有化学诱变、电离辐射诱变以及空间诱变方法等。 

甲基磺酸乙酯EMS(Ethyl methanesulfonate)是目前在玉米上使用最广和使用效果最好的化学诱变剂。用EMS‑石蜡油处理花粉，平均单个基因的显隐性突变率可达1/1000‑1/10000，可以在较大的诱变后代体中筛选出目标突变体。利用EMS处理玉米花粉的诱变技术不存在转基因产品的安全性问题，所以EMS化学诱变在2个世代(M1、M2)就可创造迄今为止所积累的所有特用玉米类型，包括白玉米、甜玉米、糯玉米、超甜玉米、抗除草剂玉米、高油酸玉米和高直链淀粉玉米。利用EMS处理玉米花粉的诱变技术，不仅可以创造新型实用的具有经济价值的突变体种质资源，而且为玉米生长发育等基础性研究提供较高学术价值的玉米突变体。 

玉米分蘖突变体有3‑10根独立的分蘖，可形成独立的根系、节点、内部节点、叶、玉米雌穗(玉米棒子)和雄穗。分蘖可增加产量和生物质，在农业生产和生物能源等领域有着重大的经济和社会效益。 

通过EMS诱变技术产生的玉米分蘖突变体比率较小，且遗传不稳定，主要原因是对EMS诱变溶液浓度和玉米自交品系的掌握。不同自交系对EMS的敏感程度不同，而且不同玉米自交系中的特定基因不尽相同，甚至一些重要的基因在某些玉米自交系中根本不存在，这就给重要突变体的筛选造成了障碍。目前，国际上通用的(如《玉米突变体手册Mutants of Maize》)EMS玉米花粉诱变使用的浓度为9.99X 10^‑3(体积比v/v)，国内公认的EMS玉米花 粉诱变浓度为6.67X 10^‑4(体积比v/v)。本发明测试了不同EMS诱变溶液浓度(6.67X 10^‑4～9.99X 10^‑3)以及不同玉米自交品系(W64A、B73、Mo17)对获得玉米分蘖突变体比率的影响。本发明获得了在玉米自交系W64A中可作为EMS诱发分蘖突变体的参考浓度9.99X10^‑4(体积比，v/v)。 

发明内容

EMS花粉诱变在玉米自交系W64A中高效获得分蘖玉米突变体的方法，其特征在于以下操作： 

‑下午(晴天)选取30株处于散粉早中期的W64A玉米自交系，给雄穗套袋； 

‑下午(晴天)选取100株处于玉米授粉期的W64A玉米自交系，减去雌穗花丝顶端并套袋； 

‑次日上午8时(晴天)，取50毫升石蜡油倒入200毫升量筒内，加入0.05毫升甲基磺酸乙酯EMS，制备成EMS诱变溶液，加入磁力搅拌子，在搅拌器上以1000rpm连续搅拌混匀； 

‑9‑10时(晴天)从30个雄穗中采集5毫升花粉，放入干燥的15ml塑料管中； 

‑30分钟内将塑料管中的花粉倒入EMS诱变溶液，在搅拌器上以1000rpm连续搅拌混匀50分钟，分装至新的50毫升的塑料管； 

‑20分钟内，用毛笔刷蘸着EMS处理的花粉，均匀刷在100株玉米雌蕊的花丝上，并套袋。整个授粉过程控制在30分钟内。 

EMS诱变溶液的配方： 

甲基磺酸乙酯EMS 0.05毫升 

石蜡油 50毫升 

本发明EMS花粉诱变在玉米自交系W64A中高效获得分蘖玉米突变体的方法，有以下优点： 

1.显性诱变率高 

EMS花粉诱变玉米自交系W64A M1代26498植株中，除获得8株显性分蘖玉米突变体，突变率达0.03％。此外，还获得其他显性突变体包括29株雄性不育、15株黄化苗、12株抽雄期提早、15株早熟、9株晚熟、59株矮杆、33株细杆、9株斑马条纹、17株带状条纹、2株顶端雌蕊、卷叶片7株等。平均显性诱变率高达0.8％。 

2.特异性较强 

EMS诱变浓度9.99X 10^‑4在玉米自交系W64A中，可高效获得8株分蘖显性突变体，获得率高达0.03％。而相同浓度(9.99X 10^‑4)在不同的玉米自交系(B73、Mo17)中，获得率仅有0.0038％。其他浓度(6.67X 10^‑4～9.99X 10^‑3)在相同玉米自交系W64A中，分蘖显性突变体的获得率仅有0.0035％。 

3.稳定遗传 

在玉米自交系W64A中M1代检测到的8株分蘖显性突变体，经与其他玉米自交系品种(B73、Mo17)杂交后，7株M1F1代均遵循分蘖性状：正常性状＝1∶1的分离规律，稳定遗传率达87.5％。然而，在玉米自交系B73中代检测到的2株分蘖显性突变体，经与其他玉米自交系品种(W64A、Mo17)杂交后，只有1株在其M1F1代遵循分蘖性状：正常性状＝1∶1的分离规律，稳定遗传率达50％。 

4.简单易行 

设备要求简单，整个EMS处理花粉和授粉过程不足2小时。 

5.成本低 

试剂仅需甲基磺酸乙酯EMS(Ethyl methanesulfonate)化学诱变剂和石蜡油(paraffinoil)。 

具体实施方式

下面详细说明本发明实施例： 

本发明测试了不同EMS诱变溶液浓度(6.67X 10^‑4～9.99X 10^‑3)以及不同玉米自交品系(W64A、B73、Mo17)对获得玉米分蘖突变体比率的影响。试验重复5次。本发明获得了在玉米自交系W64A中可作为EMS诱发分蘖突变体的参考浓度9.99X 10^‑4(体积比，v/v)。 

表1.相同玉米自交系W64A中不同EMS浓度对产生分蘖显性突变体的影响 

  EMS浓度(EMS：石蜡油)体积比(v/v)   M1代分蘖显性突变体数目   M1代体数目   自交品系   分蘖显性突变体频率

  6.67X10 ^‑4   0   1823   W64A   0

  6.67X10 ^‑4   0   2159   W64A   0

  6.67X10 ^‑4   1   6732   W64A   0.01％

  6.67X10 ^‑4   0   1445   W64A   0

  6.67X10 ^‑4   1   5824   W64A   0.02％

  9.99X10 ^‑4   1   3508   W64A   0.03％

  9.99X10 ^‑4   2   6793   W64A   0.03％

  9.99X10 ^‑4   2   6205   W64A   0.03％

  9.99X10 ^‑4   1   3986   W64A   0.03％

  9.99X10 ^‑4   2   6006   W64A   0.03％

  4.99X10 ^‑3   0   4129   W64A   0

  4.99X10 ^‑3   0   3923   W64A   0

  4.99X10 ^‑3   0   4726   W64A   0

  4.99X10 ^‑3   0   3392   W64A   0

  4.99X10 ^‑3   0   3573   W64A   0

  9.99X10 ^‑3   0   3794   W64A   0

  9.99X10 ^‑3   0   3842   W64A   0

  9.99X10 ^‑3   0   4032   W64A   0

  9.99X10 ^‑3   0   3623   W64A   0

  9.99X10 ^‑3   0   3421   W64A   0

我们对相邻的浓度梯度的突变频率(表1)检测差异的显著性(Welch Two Sample t‑test，df＝4)，只有梯度一(6.67X10^‑4)与梯度二(9.99X10^‑4)和梯度二(9.99X10^‑4)与梯度三(9.99X10^‑3)之间可检测显著性差异(p值分别为0.0024和0.00004，显著水平阈值设为0.01)。统计分析显示浓度梯度二(9.99X10^‑4)的突变频率显著高于其他浓度梯度。 

表2.相同EMS浓度9.99X10^‑4在不同的玉米自交系中对产生分蘖显性突变体的影响 

  EMS浓度(EMS：石蜡油)体积比(v/v)   M1代分蘖显性突变体数目   M1代体数目   自交品系   分蘖显性突变体频率

  9.99X10 ^‑4   1   3508   W64A   0.03％

  9.99X10 ^‑4   2   6793   W64A   0.03％

  9.99X10 ^‑4   2   6205   W64A   0.03％

  9.99X10 ^‑4   1   3986   W64A   0.03％

  9.99X10 ^‑4   2   6006   W64A   0.03％

  9.99X10 ^‑4   0   5028   Mo17   0

  9.99X10 ^‑4   0   5328   Mo17   0

  9.99X10 ^‑4   0   4987   Mo17   0

  9.99X10 ^‑4   0   5520   Mo17   0

  9.99X10 ^‑4   0   5134   Mo17   0

  9.99X10 ^‑4   1   7371   B73   0.01％

  9.99X10 ^‑4   0   3909   B73   0

  9.99X10 ^‑4   0   3895   B73   0

  9.99X10 ^‑4   1   6929   B73   0.01％

  9.99X10 ^‑4   0   4008   B73   0

我们对不同的自交品系的突变频率(表2)检测差异的显著性(Welch Two Sample t‑test，df＝4)，自交品系W64A与自交品系Mo17、自交品系B73之间均显示显著性差异(p值均为0.00004，显著水平阈值设为0.01)，自交品系Mo17与自交品系B73之间未显示显著性差异(p值为0.1781，显著水平阈值设为0.01)。统计分析显示在自交品系W64A中获得分蘖突变体的突变频率显著高于其他自交品系。 

我们研究了分蘖显性突变体杂交M1F1代分蘖突变体分离比率及遗传稳定性(表3)。在W64A中用浓度为9.99X 10^‑4的EMS获得的8株玉米分蘖突变体Tlh(Tillers and leafy husk)，分别命名为Tlh1、Tlh2、Tlh3、Tlh4、Tlh5、Tlh6、Tlh7和Tlh8，经与其他玉米自交系品种(B73、Mo17)杂交后，除Tlh3是遗传不稳定以外，其余7株在其M1F1代均遵循分蘖性状∶正常性状＝1∶1的分离规律，稳定遗传。其中Tlh2(图1.分蘖显性突变体Tlh2)和Tlh7为强玉米分蘖突变体，Tlh1、Tlh4和Tlh6为中等玉米分蘖突变体，Tlh5和Tlh8为弱玉米分蘖突变体。在W64A中用浓度为6.67X 10^‑4的EMS获得的2株玉米分蘖突变体Tlh9和Thl10，经与其他玉米自交系品种(B73、Mo17)杂交后，Tlh9和Thl10在M1F1代均呈现正常性状，遗传均不稳定，稳定遗传率为0。在B73中用浓度为9.99X10^‑4的EMS获得的2株玉米分蘖突变体Tlh11和Thl12，经与其他玉米自交系品种(W64A、Mo17)杂交后，只有Thl11在其M1F1代遵循分蘖性状∶正常性状＝1∶1的分离规律，且表现为弱玉米分蘖性状。Tlh12遗传不稳定，稳定遗传率仅有50％。 

表3.分蘖显性突变体杂交M1F1代分蘖突变体分离比率及遗传稳定性 

数据结果显示，采用低浓度9.99X 10^‑4(体积比v/v)，将0.05毫升EMS与50毫升石蜡油混合，处理玉米自交系W64A花粉，可高效获得稳定遗传的分蘖玉米突变体，突变率达0.03％，稳定遗传率高达87.5％，其他显性突变体平均获得率高达0.8％。 

说明书附图说明 

图1是分蘖显性突变体Tlh2图。