一种细菌生化鉴定测试片及其制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体属于微生物快速生化鉴定领域，尤其涉及一种细 菌生化鉴定测试片及其制作方法。

目前，我国细菌生化鉴定主要采用国标法，沿用传统的鉴定技术，这些常规鉴定方 法需要检测者做大量的准备工作，包括准备材料，配制试剂，有些还需要分装、灭菌、处置废 弃物等，增加了检测人员的劳动量，还对操作者的技能、经验有较高要求。由于检测步骤多， 检测结果判断经验性强，结果的准确性不易控制。

测试片以其制作工艺简单，操作简便，结果准确，检测时间短等优点赢得了广大检 测人员的青睐。测试片不需要做实验前的准备工作，节省了劳动力。直接吸取样液滴加于测 试片上培养检测，对操作者要求低，结果重复性好。

目前市场上涉及细菌生化鉴定的产品主要有2种，一种是安瓿瓶装的液体生化鉴 定试剂，使用者打开安瓿瓶直接接种待检菌于安瓿瓶中，或直接观察，或培养后观察，有些 培养后还需要再添加指示剂。此产品因是液体试剂，保质期短；因安瓿瓶是玻璃材质，打开 时存在安全隐患，培养时只能敞开口，无法做到严格的无菌培养，同时水分散失严重，影响 结果的准确性，且操作繁琐；另一种是干制的生化鉴定板，板上有0.2mL-0.5mL的微孔，生化 试剂加到微孔中再烘干，板上设有盖子，此产品保质期长，使用者将待检液菌直接加入相应 的微孔，盖上盖子培养，但产品制作工艺繁琐，成本高，不方便携带。

本发明的一个目的是提供一种生化鉴定测试片及其制作方法。

本发明提供的生化鉴定测试片，该生化鉴定测试片包括覆膜、粘附有冷水可溶性 凝胶的保湿层和位于两者之间的生化鉴定试纸。

所述粘附有冷水可溶性凝胶的保湿层由冷水可溶性凝胶和胶带组成。

粘附有冷水可溶性凝胶的保湿层按照包括如下步骤的方法制备：将冷水可溶性凝 胶粘附于胶带的胶面，形成粘附有冷水可溶性凝胶的保湿层。

所述生化鉴定试纸由生化鉴定试剂和滤纸组成。

生化鉴定试纸按照包括如下步骤的方法制备：将滤纸浸泡于生化鉴定试剂中，达 到饱和后取出，烘干，裁切成大小合适的正方形，形成生化鉴定试纸。

所述生化鉴定试纸粘附于保湿层冷水可溶性凝胶表面，可通过聚丙烯酸压敏胶粘 合；同一细菌不同生化鉴定试纸可粘附于同一保湿层，制成该细菌的生化鉴定测试片。

所述覆膜与所述保湿层冷水可溶性凝胶表面于一侧边粘合，可由聚丙烯酸压敏胶 粘合。

上述生化鉴定测试片中，所述生化鉴定试剂为1×-3×常规生化鉴定试剂，具体为 缓冲蛋白胨水（MR、VP试验）、氨酸肉汤（吲哚试验）、枸橼酸盐培养基（枸橼酸盐利用试 验）、1%盐酸四甲基对苯二胺试剂（氧化酶试验）、乙酰胺肉汤（乙酰胺试验）、七叶苷培养基 （七叶苷水解试验）、酚红葡萄糖肉汤（葡萄糖利用试验）、硝酸盐肉汤（硝酸盐还原试验）、克 氏双糖铁培养基（硫化氢试验）、氨基酸脱羧酶培养基（氨基酸脱羧酶试验）、Rustigian氏尿 素酶培养基（尿素酶试验）、苯丙氨酸培养基（苯丙氨酸脱氨酶试验），淀粉培养基（淀粉水解 试验）、甘油复红肉汤（甘油复红试验），丙二酸盐培养基（丙二酸盐利用试验）或醋酸盐试验 培养基（醋酸盐试验）。

在本发明的实施例中，采用的生化鉴定试剂为1×大肠埃希氏菌生化鉴定试剂,具 体为：缓冲蛋白胨水（MR、VP试验）、氨酸肉汤（吲哚试验）、枸橼酸盐培养基（枸橼酸盐利用 试验）。

上述生化鉴定测试片中，所述生化鉴定试纸裁切成1cm-2cm的正方形。

所述同一生化鉴定测试片上的不同生化鉴定试纸之间的粘合间距为0.5cm- 1.0cm。

所述保湿层大小及长短比例与所要粘贴的生化鉴定试纸大小及数量相适应。

所述覆膜宽度与所述保湿层宽度相同，长度长于保湿层0.3cm-0.5cm。

上述生化鉴定测试片中，所述冷水可溶性凝胶为海藻酸钠、黄原胶、瓜尔豆胶或羟 甲基纤维素钠。

上述生化鉴定测试片中，所述滤纸为新华3号滤纸。

上述生化鉴定测试片中，所述胶带为PET聚丙烯酸压敏胶胶带；

所述PET聚丙烯酸压敏胶胶带厚度为0.10mm-0.30mm。

上述生化鉴定测试片中，所述覆膜为PVC薄膜；

所述PVC薄膜厚度为0.05mm-0.10mm。

上述的生化鉴定测试片在细菌生化鉴定中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种细菌生化鉴定的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）揭起上述的生化鉴定测试片的覆膜，再将待检细菌菌液滴加在所述测试片的生化鉴 定试纸上，盖上所述覆膜，得到待检测测试片；

2) 按各生化鉴定项目要求或直接观察，或培养后观察，或培养后揭起覆膜，在生化鉴 定试纸上滴加相应试剂后进行观察，判断结果。

本发明的实验证明，本发明的生化鉴定测试片节省了操作人员配制试剂、配制培 养基、处置废弃物等工作，操作简便、随用随取，产品重复性好，准确性高。本发明克服了同 类产品的缺点，将生化鉴定试剂吸附于滤纸上，制成干式纸片，保质期长；将同一细菌的不 同生化鉴定试纸粘贴于同一生化鉴定测试片，一次可进行多项生化指标检测，便于操作，便 于观察；本发明的生化鉴定测试片，上层采用覆膜覆盖，有效减少水分散失；本发明首次将 冷水可溶性凝胶作为保湿剂引入生化鉴定，模仿固体培养基提供细菌生长的环境，制作工 艺简单，同时也首次将生化鉴定试纸做成测试片形式，成本低，结果准确。

图1为生化鉴定测试片的产品图。

图2为生化鉴定测试片的侧面效果图。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、生化鉴定测试片

本发明的生化鉴定测试片的结构示意图如图1和图2所示。

本发明提供的生化鉴定测试片，包括覆膜1、粘附有冷水可溶性凝胶的保湿层3和 位于二者之间的生化鉴定试纸2。

粘附有冷水可溶性凝胶的保湿层为将冷水可溶性凝胶粘附于胶带的胶面，形成粘 附有冷水可溶性凝胶的保湿层。

生化鉴定试纸为将滤纸浸泡于生化鉴定试剂中，达到饱和后取出，烘干，裁切成大 小合适的正方形，形成生化鉴定试纸。

生化鉴定试纸粘附于保湿层冷水可溶性凝胶表面，可通过聚丙烯酸压敏胶粘合； 同一细菌不同生化鉴定试纸可粘附于同一保湿层，制成该细菌的生化鉴定测试片。

覆膜与所述保湿层冷水可溶性凝胶表面于一侧边粘合，可由聚丙烯酸压敏胶粘 合。

保湿层大小及长短比例与所要粘贴的生化鉴定试纸大小及数量相适应；覆膜宽度 与所述保湿层宽度相同，长度长于保湿层。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、设置位置及其连接方式等 都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排 除在本发明的保护范围之外。

实施例2、大肠埃希氏菌生化鉴定测试片制备及应用

一、大肠埃希氏菌生化鉴定测试片的制作

1、粘附有冷水可溶性凝胶的保湿层的制备

将海藻酸钠（河南德旺化工实业有限公司；货号：9005-38-3）粘附于PET聚丙烯酸压敏 胶胶带（深圳合昌兴科技有限公司；货号：401，厚度0.11mm））上，得到粘附有冷水可溶性凝 胶的保湿层。

2、大肠埃希氏菌生化鉴定试纸的制备

将滤纸（新华3号滤纸）分别浸泡于缓冲蛋白胨水（MR、VP试验）、氨酸肉汤（吲哚试 验）、枸橼酸盐培养基（枸橼酸盐利用试验）中，吸附饱和后取出，50℃烘干，得到大肠埃希氏 菌生化鉴定试纸。

3、测试片的组装

将上述1制备的粘附有冷水可溶性凝胶的保湿层裁切成6cm×7cm的长方形；

将上述2制备的大肠埃希氏菌生化鉴定试纸裁切成1.5cm×1.5cm的正方形；

将PVC薄膜（青岛索信进出口有限公司；厚度0.05mm）裁切成6cm×7.5cm的长方形，形成 覆膜；

将上述制备的大肠埃希氏菌生化鉴定试纸分别以聚丙烯酸压敏胶粘附于保湿层冷水 可溶性凝胶表面，缓冲蛋白胨水试纸粘贴2片，分别作为MR和VP试验试纸；氨酸肉汤试纸 和枸橼酸盐试纸各粘贴1片。排列方式两排两列，生化鉴定试纸之间间距均为1cm。试纸距保 湿层各边的距离为1cm、1cm、1cm和2cm。

将上述覆膜与粘附有冷水可溶性凝胶的保湿层在保湿层和生化鉴定试纸边距为 2cm一侧以聚丙烯酸压敏胶粘合，粘合宽度1.0cm。

铝箔袋包装后，环氧乙烷灭菌备用，得到大肠埃希氏菌生化鉴定测试片。

二、大肠埃希氏菌生化鉴定测试片的应用

接种：从EMB琼脂平板上挑取可疑菌落于10mL无菌生理盐水中，吹吸均匀，制成待检菌 液。将大肠埃希氏菌生化鉴定测试片置于水平平台，揭开上层覆膜，将待检菌液滴加于生化 鉴定试纸上，每种试纸滴加0.2mL，缓慢盖上上层覆膜，凝固1min，36℃±1℃培养24h±2h。 同时以北京路桥大肠埃希氏菌生化鉴定试剂盒（DBI-01）作为对照，按产品说明书进行操 作，分别对10个可疑菌落进行鉴定。

结果判断：培养结束后取出鉴定测试片，枸橼酸盐试纸直接观察颜变化，黄为 枸橼酸盐试验阴性，蓝为枸橼酸盐试验阳性；其中的一个缓冲蛋白胨水试纸滴加2滴0.1% 甲基红指示剂后，立即观察结果，红为MR试验阳性，黄为MR试验阴性；另一个缓冲蛋白 胨水试纸滴加2滴40% KOH溶液，再滴加2滴5%α-萘酚溶液，30min内观察颜变化，红为VP 试验阳性，黄为VP试验阴性；氨酸肉汤试纸滴加2滴Koser靛基质试剂，立即观察颜变 化，红为吲哚试验阳性，黄为吲哚试验阴性。路桥大肠埃希氏菌生化鉴定试剂盒按说明 书进行结果判断。IMViC试验（吲哚试验、MR试验、VP试验和枸橼酸盐利用试验）结果++--或- +--判断为大肠埃希氏菌阳性，其它为大肠埃希氏菌阴性。

结果测试片鉴定有7个菌落为大肠埃希氏菌阳性，3个为大肠埃希氏菌阴性，与陆 桥试剂盒检测结果完全一致。