一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备与应用

一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备与应用

（一）技术领域

本发明涉及一种丝素蛋白膜及其制备方法，特别涉及一种难溶于水的 丝素蛋白膜及其制备和应用。

（二）背景技术

蚕丝是强度最好的天然纤维之一，由70～80%的丝素蛋白和20～30% 的丝胶蛋白组成。丝素蛋白的氨基酸序列主要由“甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸 -丙氨酸--甘氨酸-丝氨酸”(GAGAGS)的重复单元构成，其中甘氨酸、丙 氨酸和丝氨酸占总氨基酸含量的85%以上。该重复序列绝大多数位于丝 素蛋白的结晶区，并自组装成反向平行折叠链构象（anti-parallelβ-sheet） 结构。这些结构赋予丝素蛋白具有良好力学和缓慢降解速率的特性。

丝胶蛋白在体内会引起炎症反应，在使用前需要进行脱胶处理 （degummed）。丝素蛋白由分子量为325KD和25KD两种蛋白组成，其 降解产物为氨基酸。大量的研究表明丝素蛋白具有良好的生物相容性，其 体内炎症反应（inflammatory responses）要远低于胶原和聚乳酸等常用生 物材料。丝素蛋白纤维作为外科缝线已有悠久的历史，经编织后作为人工 韧带和组织补片已在研究领域应用。但在目前的生物材料研究领域应用更 多的是再生型丝素蛋白，即丝素蛋白经过脱胶、溶解、提纯后，再通过物 理、化学的方法，形成海绵状、膜状、凝胶状、微球状等形态。

在丝素蛋白膜的制备方面，中国发明专利“一种可溶—高弹性丝素蛋 白膜的制备方法”（CN101234212A）中，将提纯后的丝素蛋白溶液在聚 苯乙烯培养皿在恒温恒湿箱内（温度40～70℃，相对湿度60～80%）直接 干燥形成厚度为30～50um可溶性膜。中国发明专利“再生丝素蛋白膜及 其制备方法”（公开号CN101760027A）中，将提纯后的丝素蛋白溶液在 PS皿内直接干燥成膜（未对干燥条件提出要求），再用极性溶剂（C1-C5 醇和水混合物、水或水蒸汽）结合力学拉伸，进行溶胀变性处理，以改善 丝素蛋白膜的脆性，即增加拉伸伸长率。中国发明专利“一种难溶于水的 透明丝素蛋白膜及其制备方法”（CN101967282A）中，在提纯后的丝素 蛋白溶液中加入多元醇作为交联剂，将两者混合物在模具中经鼓风干燥成 膜，再在相对湿度为30～98%的环境中处理1～48小时（未对处理温度提 出要求），获得所需要的膜。中国发明专利“柔韧丝素蛋白膜及其制备方 法”（CN1316465）中，通过加入环氧树脂来交联丝素蛋白制备不溶于水 的丝素蛋白膜。

现有丝素蛋白膜的制备方法，均是丝素蛋白溶液或其混合物灌注在模 具内，通过溶剂挥发干燥，溶质沉积于模具底部，进而形成厚度约 10～500um的可溶或难溶于水的膜。在该步骤的成膜过程中，模具底部上 表面的平整性和水平性，模具是否处于振动环境，吹在溶液表面的风速， 都将影响膜厚度的均一性和膜表面的微观结构；该步骤成膜过程中，干燥 的温湿度条件，也将影响膜的透明性和膜均一性（如温度过高，会在膜内 形成微气泡）；该步骤中膜的干燥程度，也影响膜的性能；该步骤膜的干 燥时间约几小时到几天，模具所处环境的洁净程度，将影响膜的微生物和 内毒素含量；该步骤形成的膜，再通过后续步骤的极性溶液或湿热条件等 处理，处理温湿度也会对膜的结晶程度造成影响。

针对上述问题，本发明期望通过最简单和最经济的方法，获得一种难 溶于水的丝素蛋白膜。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备方法和应用， 制备工艺中不接触有毒物质，未使用变性、促凝和交联等添加剂，制备工 艺简单，利于大量生产；模具底面采用表面极其平整的浮法玻璃，并将模 具存放于水平可精细调整的不锈钢平台；通过改变模具底部上表面的光滑 或粗糙程度，将获得两种不同表面结构的丝素蛋白膜：底部光滑模具制备 的双滑型膜，膜的两面均是光滑面，膜为半透明至近透明状，而底部毛糙 模具制备的贴滑型膜，一面光滑，另一面粗糙，粗糙面有利于膜在创面的 固定，利于止血、细胞粘附和增殖；通过控制该膜的厚度及其结晶程度， 产生不同理化性能（如力学、柔韧度）和生物学性能（体内降解速率）， 满足不同用途的需要；该膜在湿润条件会吸收30～40%水分，膜会变的柔 软（厚度10～100μm），大于150μm的柔韧性较差；膜降解产物为氨基酸， 膜及其降解产物具有良好的生物相容性；膜能阻止细胞、微生物及生物大 分子穿过，具有一定的水汽渗透性能；该膜在防粘连膜、护创膜或人工膜 （引导骨再生膜、牙周膜、胸膜、硬脑膜或硬脊膜、鼓膜、眼角膜）等领 域具有广阔的市场。

本发明采用的技术方案是：

一种难溶于水的丝素蛋白膜，所述丝素蛋白膜按如下方法制备：（1） 以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得截留液a，将截留液a或 截留液a的浓缩液过滤或离心，取滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液； （2）取步骤（1）得到的丝素蛋白溶液，将丝素蛋白溶液的质量浓度用去 离子水调整至0.3～30%（优选0.5～15%）（取部分丝素蛋白溶液在60℃烘 干至恒重，计算丝素蛋白溶液的含水量，从而计算用去离子水调整丝素蛋 白溶液所需的水量）倒入模具内，所述模具内丝素蛋白溶液加入量以丝素 蛋白质量计为1～50mg/cm²模具（优选2～30mg/cm²，更优选3～20mg/cm²）， 在温度5～60℃（优选35～55℃，更优选45℃），相对湿度（RH）10～70% （优选20～50%，最优选40%）条件下干燥至无肉眼可见的水分，模具重 量增加了所加入丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的1.2～1.8倍，在模具内形 成丝素蛋白膜；（3）将模具在温度50～100℃（优选55～80℃，更优选60～70 ℃），RH70～100%（优选85～95%，最优选90%）条件下放置20～200min （优选60～150min，最优选120min）进行湿热交联，然后置于体积浓度 50～90%（优选75%）的乙醇水溶液中浸洗10～60min（优选30min），去 除模具，丝素蛋白膜再用去离子水充分浸洗30～150min（优选60～120min） 至无醇，获得难溶于水的丝素蛋白膜，厚度为10～500μm（优选厚度 20～200μm）。

进一步，步骤（1）所述截留液a的浓缩液的制备方法是将透析后的 透析袋放入质量浓度20～60%的聚乙二醇水溶液中，静置1～10h进行浓缩， 取截留液b即为截留液a的浓缩液；所述聚乙二醇平均分子量 1000～10000。

进一步，步骤（1）所述截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心方 法为下列之一：a）将截留液a或截留液a的浓缩液于4℃、3000～6000g 条件下离心5～20min，弃去沉淀，取上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液； b）将截留液a或截留液a的浓缩液用孔径为2～20μm的滤器过滤，去除 不溶性颗粒，取滤液即为所述的丝素蛋白溶液。

进一步，步骤（2）所述模具为底部光滑平整且水平的模具，通常将 模具存放于水平可精细调整的不锈钢平台进行调整。

进一步，本发明步骤（2）优选采用浮法玻璃制成的底部光滑平整且 水平的模具（优选边长20cm的正方形模具），所述模具内质量浓度 0.3～30%（优选0.5～15%）的丝素蛋白溶液的加入量以丝素蛋白质量计为 1～50mg/cm²模具（优选2～30mg/cm²，更优选3～20mg/cm²），将模具在温 度5～60℃，相对湿度（RH）10～70%条件下干燥至无肉眼可见的水分， 在模具内形成两面光滑的丝素蛋白膜；将模具在温度50～100℃，RH为 70～100%条件下放置20～200min进行湿热交联，然后置于体积浓度 50～90%的乙醇水溶液中浸洗10～60min，去除模具，丝素蛋白膜再用去离 子水充分浸洗30～150min，获得难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。

更进一步，步骤（2）所述模具为底部表面毛糙且水平的模具。

更进一步，本发明优选采用底部为浮法玻璃经磨砂获得粗糙面的模具 （优选边长20cm的正方形模具），所述模具内质量浓度0.3～30%（优选 0.5～15%）的丝素蛋白溶液的加入量以丝素蛋白质量计为1～50mg/cm²模 具（优选2～30mg/cm²，更优选3～20mg/cm²），将模具在温度5～60℃，RH 为10～70%条件下干燥至无肉眼可见的水分，在模具内形成一面光滑、另 一面粗糙的丝素蛋白膜（厚度为10～500μm）；将模具在温度50～100℃， RH为70～100%条件下放置20～200min进行湿热交联，然后置于体积浓 度50～90%的乙醇水溶液中浸洗10～60min，去除模具，丝素蛋白膜再用去 离子水充分浸洗30～150min，获得难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。

进一步，步骤（1）所述截留液a的浓缩液是指当所需丝素蛋白溶液 质量浓度小于5%时不需要浓缩，直接将截留液a过滤或离心，获得丝素 蛋白溶液；当所需丝素蛋白溶液质量浓度大于5%时，将所述截留液a进 行浓缩，所述浓缩方法为：将透析后的透析袋放入质量浓度20～60%的聚 乙二醇水溶液中，静置浓缩1～10h，取截留液b即为截留液a的浓缩液， 将截留液a的浓缩液过滤或离心后制成丝素蛋白溶液，再用去离子水将丝 素蛋白溶液调整为5～30%；所述聚乙二醇平均分子量1000～10000。

进一步，步骤（1）所述脱胶、溶解、透析方法为：a）脱胶：将100g 桑蚕蚕丝放入4～8L的2M碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60min， 纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白 在20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解：将上述干燥 后的丝素蛋白溶于9～11M的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300min 至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；所述干燥后的丝素蛋白 质量用量以溴化锂水溶液的体积计为0.1～0.2g/ml；c）透析：将含丝素蛋 白的混合液用截留分子量1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，用10 倍混合液体积的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶 液中的溴化锂成分，获得截留液a。

本发明还提供所述的难溶于水的丝素蛋白膜在制备防粘连膜、护创膜 或人工膜中的应用。

进一步，所述的人工膜为牙周膜、骨引导再生膜、胸膜、硬脑膜、硬 脊膜、鼓膜或眼角膜。

本发明所模具可以使各种材质制作的平皿或盒体，优选浮法玻璃制作 的方形皿。

本发明所述难溶于水的丝素蛋白膜制备中，在固定面积模具内加入丝 素蛋白质量决定了最终丝素蛋白膜的厚度，即所述膜厚度与单位模具面积 的丝素蛋白加入量和浓度相关。当模具面积一定时，调整丝素蛋白溶液质 量浓度或加入体积来获得不同厚度的难溶于水的丝素蛋白膜。如果模具底 部表面光滑则获得双面光滑的难溶于水的双滑型丝素蛋白膜，如果模具底 部表面毛糙则获得一面光滑、另一面粗糙的难溶于水的贴滑型丝素蛋白 膜。本发明所制备的难溶于水的丝素蛋白膜厚度为10～500μm，在37℃生 理盐水中，24h丝素蛋白溶失率小于1%。

本发明所述聚乙二醇的平均分子量为1000～10000。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明所述的 难溶于水的丝素蛋白膜制备工艺过程中不接触有毒物质，制备工艺简单， 利于大量生产；（2）本发明难溶于水的丝素蛋白膜以丝素蛋白为原料，模 具采用表面极其平整的浮法玻璃，并将模具存放于水平可精细调整的不锈 钢平台，底部光滑模具制备的双滑型丝素蛋白膜的两面均是光滑面，底部 粗糙模具制备的贴滑型丝素蛋白膜一面光滑，一面粗糙，所述膜为半透明 至近透明状，现有研究已经证明丝素蛋白及其降解产物（氨基酸）拥有良 好的生物相容性；（3）本发明难溶于水的丝素蛋白膜易于控制不同的厚度 及其结晶程度，进而产生不同的物理（如力学、透光度、水汽渗透性）和 生物学性能（如降解时间），满足不同用途的需求；（4）本发明难溶于水 的双滑型丝素蛋白膜在湿润条件下柔软、光滑、致密，具有阻止细胞、微 生物和生物大分子穿过的功能，并拥有高透光率，尤其适用于防粘连膜、 眼角膜、护创膜领域；（5）本发明难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜一面光滑， 另一面粗糙，粗糙面有利于膜的固定，减少缝合针数或无需缝合固定，利 于创面止血、细胞粘附和增殖，进而具有诱导组织再生作用，尤其适用于， 在防粘连膜、人工膜（引导骨再生膜、牙周膜、胸膜、硬脑膜、硬脊膜、 眼角膜或鼓膜）等领域具有广阔的市场。

（四）附图说明

图1丝素蛋白膜的红外吸收光谱（FTIR-ATR）。

图2实施例3制备的丝素蛋白膜（100μm）光滑面的扫描电镜图。

图3实施例7制备的丝素蛋白膜（200μm）粗糙面的扫描电镜图。

图4为实施例10丝素蛋白膜促进动物全层皮肤缺损的修复的动物试验图 片，其中a为手术时创面图片，b为术后7天的创面图片，c为术后14 天的创面图片，d为术后7天的创面组织学HE染图片（放大40×），e 为术后14天的创面组织学HE染图片（放大40×），f为术后创面闭合 指数。

图5为实施例11丝素蛋白膜促进肌腱缺损的修复的动物试验图片，其中 a为术后图片，b为双滑型丝素蛋白膜术后8周的解剖图片，c为贴滑型 丝素蛋白膜术后8周的解剖图片，d为双滑型丝素蛋白膜术后8周的组织 学HE染图片（放大40×），e为贴滑型丝素蛋白膜术后8周的组织学 HE染图片（放大40×）。

图6为实施例12丝素蛋白膜促进牙周组织再生修复的动物试验图片，a 为术中缺损区图片，b为术后缺损区图片，c为术后8周缺损修复图片，d 为术后8周缺损修复的X射线影像图片。

图7为实施例12丝素蛋白膜促进牙周组织再生修复的术后8周的组织学 masson染图片。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1（500μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝 丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，96℃水浴 30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白， 将丝素蛋白在50℃烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解： 将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比0.2：1（即干燥后的丝素蛋白质量 用量以溴化锂水溶液的体积计为0.2g/ml）溶于9.3M的溴化锂（LiBr）水 溶液中，60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量 不溶性颗粒组成的混合液；c）透析：将混合液用再生纤维素透析袋（截 留分子量4000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d 透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）浓缩：将透析 后的透析袋放入4倍体积的质量浓度50%聚乙二醇（PEG，分子量7000） 水溶液，室温静置浓缩5h，取截留液b，即获得截留液a的浓缩液；e） 将截留液b在水平转子5000g，4℃，离心10min，除去底部的未溶解丝 素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒，取上清液，即获得提纯后的丝素 蛋白溶液300ml；f）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿 内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液质量浓度为20%。丝素蛋白溶液4 ℃保存备用。

（2）将模具（底部为浮法玻璃，边长20cm的正方形皿，其它实施 例模具材质相同）存放于水平可精细调整的不锈钢平台上调整水平，加入 质量浓度20%的丝素蛋白溶液100ml（20000mg丝素蛋白），在温度40℃， RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加30g，在模具 底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度70℃，RH92%的恒温恒湿箱内进行湿热交联 120min，然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去 离子水洗涤3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的 不均一边缘膜，获得厚度为500μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。红外 吸收光谱采用傅立叶变换红外光谱仪（型号Nicolet6700），检测方法： 全反射光谱，结果见图1所示。

实施例2（200μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝 丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，95℃水浴 30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白， 将丝素蛋白在50℃烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解： 将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比0.2：1溶于9.3M的溴化锂（LiBr） 水溶液中，60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少 量不溶性颗粒组成的混合液；c）透析：将上述混合液用再生纤维素透析 袋（截留分子量8000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水 在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）将截留液 a在水平转子5000g，4℃，离心10min，除去底部的未溶解丝素蛋白和溴 化锂中可能存在不溶性颗粒，取上清液即获得提纯后的丝素蛋白溶液 1000ml；e）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干， 质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为5%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具调整水平（同实施例1），加入上述制备的质量浓度5% 丝素蛋白液160ml（8000mg丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度 45℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加12g， 在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度68℃，RH90%的湿热交联箱内放置120min，然 后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水洗涤 3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘 膜，获得厚度为200μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。红外吸收光谱采 用傅立叶变换红外光谱仪（型号Nicolet6700），检测方法：全反射光谱， 结果见图1所示。

实施例3（100μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：同实施例2。获得质量浓度为5%的丝素 蛋白溶液。

（2）将模具调整水平（同实施例1），加入上述制备的质量浓度5% 丝素蛋白液80ml（4000mg丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度45 ℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加6g，在 模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度68℃，RH90%的湿热交联箱内放置110min，然 后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水洗涤 3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘 膜，获得厚度为100μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。红外吸收光谱采 用傅立叶变换红外光谱仪（型号Nicolet6700），检测方法：全反射光谱， 结果见图1所示。扫描电镜型号为Hitachi S-3000N，结果见图2所示， 表明丝素蛋白膜为致密光滑的膜结构。

实施例4（50μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝 丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98℃水浴 30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白， 将丝素蛋白在50℃烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解： 将丝素蛋白以质量体积比0.20：1溶于9.3M的溴化锂（LiBr）水溶液中， 60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗 粒组成的混合液；c）透析：将混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量 2000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d透析12次， 去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）将截留液a用孔径10μm的 滤器，除去底部的不溶性颗粒，取滤液即获得提纯后的丝素蛋白溶液 1200ml；e）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干， 质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为4%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）用去离子水将丝素蛋白溶液浓度调整为2%，将模具调整水平 （同实施例1），加入质量浓度2%丝素蛋白液100ml（2000mg丝素蛋白）， 去除内部产生的气泡。在温度50℃，RH50%环境静置晾干至肉眼无可见 液体，比空模具重量增加3g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度65℃，RH90%的湿热交联箱内放置100min， 然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水洗 涤3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边 缘膜，获得厚度为50μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。红外吸收光谱采 用傅立叶变换红外光谱仪（型号Nicolet6700），检测方法：全反射光谱， 结果见图1所示。

实施例5（20μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝 丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98℃水浴 30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白， 丝素蛋白50℃烘干，获得70g丝素蛋白，备用；b）溶解：将丝素蛋白以 质量体积比0.2：1溶于9.3M的溴化锂（LiBr）水溶液中，60℃水浴90min 至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液； c）透析：将混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量8000道尔顿）透析， 用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr 离子，获得截留液a；d）将截留液a用孔径10μm的滤器，除去底部的不 溶性颗粒，获得提纯后的丝素蛋白溶液1200ml；e）浓度测定：取提纯后 的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液浓度 的质量浓度为4%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将丝素蛋白溶液用无菌去离子水稀释成质量浓度1%，将模具 调整水平（同实施例1），加入质量浓度1%丝素蛋白溶液80ml（800mg 丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度55℃，RH50%环境静置晾干至 肉眼无可见液体，比空模具重量增加1.1g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度65℃，RH88%的湿热交联箱内放置100min， 然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水洗 涤3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边 缘膜，获得厚度为20μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。

实施例6（500μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶和b）溶解操作同实施例1，c） 透析：将混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量3000道尔顿）透析， 用10倍混合液体积的无菌纯水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子， 获得截留液a；d）浓缩：将透析后的透析袋放入5倍体积的质量浓度30% 聚乙二醇（PEG，分子量5000）水溶液，室温静置浓缩5h，取截留液b， 即获得截留液a的浓缩液；e）将截留液b在水平转子5100g，4℃，离心 10min，除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒，取 上清液，即获得提纯后的丝素蛋白溶液300ml；f）浓度测定：同实施例1， 质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为22%。

（2）将模具改为：边长20cm的正方形皿，底部为浮法玻璃一面经磨 砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜面。加入质量浓度22%的丝 素蛋白溶液91ml（20000mg丝素蛋白），其它操作同实施例1，获得厚度 为500μm难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。

实施例7（200μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：将步骤d）水平转子改为5100g，4℃， 离心10min，其它操作同实施例2，质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓 度为5%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具改为：边长20cm的正方形皿，底部为浮法玻璃一面经磨 砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜面。其它操作同实施例2，获 得厚度为200μm的难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。扫描电镜型号为 Hitachi S-3000N，结果见图3所示，表明贴滑型丝素蛋白膜的粗糙面为波 浪起伏状的粗糙结构。

实施例8（100μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：操作同实施例2，质量差法测得丝素蛋 白溶液浓度的质量浓度为5%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具改为：边长20cm的正方形皿，底部为浮法玻璃一面经磨 砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜面。加入上述制备的质量浓度 5%丝素蛋白液80ml（4000mg丝素蛋白），其它操作同实施例3，获得厚度 为100μm难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。

实施例9（50μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：将再生纤维素透析袋改为截留分子量 8000道尔顿进行透析，其它操作同实施例3，质量差法测得丝素蛋白溶液 的质量浓度为4%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具改为：边长20cm的正方形皿，底部为浮法玻璃一面经磨 砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜面。其它操作同实施例4，获 得厚度为50μm难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。

双滑型丝素蛋白膜的相关物理性能见表1。其中，厚度的检测工具为 螺旋测微器。拉伸强度、拉伸断裂伸长率和缝合力学的检测设备为万能材 料力学试验机，拉伸速度为100mm/min。溶失率的测试方法为，样品表 面积：去离子水的体积为1cm:6ml，37℃水浴24小时。在样品溶失率试 验前后分别将样品干燥至恒重，质量差法计算其溶失率。

表1双滑型丝素蛋白膜的主要性能参数

实施例10丝素蛋白膜促进动物全层皮肤缺损的修复）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝 丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，95℃水浴 30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白， 将丝素蛋白在50℃烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解： 将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比0.2：1溶于9.3M的溴化锂（LiBr） 水溶液中，60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少 量不溶性颗粒组成的混合液；c）透析：将上述混合液用再生纤维素透析 袋（截留分子量8000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水 在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）将截留液 a在水平转子5000g，4℃，离心10min，除去底部的未溶解丝素蛋白和溴 化锂中可能存在不溶性颗粒，取上清液即获得提纯后的丝素蛋白溶液 1000ml；e）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干， 质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为5%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具调整水平（同实施例1），加入上述制备的质量浓度5% 丝素蛋白液50ml（2500mg丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度45 ℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加3.6g， 在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度65℃，RH90%的湿热交联箱内放置120min， 然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水洗 涤3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边 缘膜，获得厚度为60μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。

（4）上述步骤（3）制备的膜剪切成4cm×4cm的方形，铝箔袋包装， 钴60辐照灭菌，用于体内动物试验评估。

（5）丝素蛋白膜促进动物全层皮肤缺损的修复：临床上，由于烧伤、 溃疡等原因引起的皮肤完整性破坏，往往需要皮肤移植来促进创面的修 复。皮肤供区成为手术引起的皮肤缺损，需要妥善处理，以降低感染，缓 解疼痛，减少疤痕形成和促进其愈合。皮肤最基本的功能是保护、透气舒 适和阻止外部微生物入侵。在实施例的动物模型中，丝素蛋白膜覆盖在动 物全层皮肤缺损区，起到暂时的皮肤替代功能，加速创面愈合。新西兰兔， 雄性，体重2.2-2.4kg，清洁级动物饲养环境，每只单独饲养。水合氯醛 腹腔注射麻醉，背部手术区域剃毛，医用碘伏消毒，按照无菌手术方式开 展。背部脊柱两侧分别建立两个方形的全层皮肤缺损，缺损大小为3cm ×3cm。上述方法制备的再生丝素蛋白膜，贴在创面缺损区。鉴于动物的 好动性，膜边缘给予6针缝合固定，膜外侧包裹两层纱布给予保护。于术 后7天和14天行创面拍照，测量未闭合的创面面积，计算创面闭合指数。 其中创面闭合指数(%)=((A₀-A_t)/A₀)×100%，其中A₀为手术时的原始 创面大小，A_t为术后第t天的创面大小。过量麻药注射安乐死后，创面修 复区连同周围正常的组织一同切除，用多聚甲醛固定，石蜡包埋切片， HE染拍照观察(IX71inverted biological microscope,Olympus)。结果见 图4所示，表明，在丝素蛋白膜的创面保护和诱导再生作用下，新西兰兔 背部全层皮肤缺损，在术后14天创面完全闭合，再生的表皮连续完整， 真皮层胶原形成丰富，缺损区的周围区域毛囊发育，部分新生毛发长出。

实施例11（丝素蛋白膜促进肌腱缺损的修复）

（1）丝素蛋白溶液的制备：操作同实施例9，质量差法测得丝素蛋 白溶液浓度的质量浓度为5%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）双滑型丝素蛋白膜：将模具调整水平（同实施例1），加入上述 制备的质量浓度5%丝素蛋白液40ml（2000mg丝素蛋白），去除内部产生 的气泡。在温度45℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模 具重量增加3g，在模具底部形成双滑型丝素蛋白膜。

（3）贴滑型丝素蛋白膜：将步骤（2）模具改为边长20cm的正方形 皿，底部为浮法玻璃一面经磨砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜 面。加入上述步骤（1）制备的质量浓度5%丝素蛋白液40ml（2000mg 丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度45℃，RH40%环境静置晾干至 肉眼无可见液体，比空模具重量增加3g，在模具底部形成贴滑型丝素蛋 白膜。

（4）将上述步骤（2）和步骤（3）的两种模具分别置于温度56℃， RH90%的湿热交联箱内放置60min，然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸 泡10min，去除模具，膜用去离子水洗涤3次，每次20min，切去丝素蛋 白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜，分别获得厚度为50μm难溶 于水的双滑型丝素蛋白膜和厚度为50μm的难溶于水的贴滑型丝素蛋白 膜。

（5）上述步骤（4）制备的两种膜剪切成1cm×1cm的方形，铝箔袋 包装，钴60辐照灭菌，用于体内动物试验评估。

（6）动物趾深屈肌腱横断术后修复：肌腱是以I型胶原为主的无血 管组织，损伤后的再生修复能力差。在损伤肌腱的修复过程中，肌腱周围 的纤维组织长入肌腱断端的缝合处或者肌腱组织缺损处，形成占位，最终 导致以疤痕修复为主。肌腱修复的另外一个并并发症是肌腱与周围组织的 粘连，导致肌腱的滑动功能障碍。本实施例所开展的试验，即采用贴滑型 或者双滑型丝素蛋白膜，包绕于新西兰兔的肌腱缺损区，以达到纤维组织 长入和减少肌腱粘连的预期作用，促进肌腱的再生修复。新西兰兔，雄性， 体重2.2-2.4kg，清洁级动物饲养环境，每只单独饲养。水合氯醛腹腔注 射麻醉，后脚足掌手术区域剃毛，医用碘伏消毒，按照无菌手术方式开展。 足掌第二趾深屈肌腱在足掌测的延伸处，分离、横断趾深屈肌腱，Bunnell 埋藏缝合法缝合肌腱断裂，分别在缝合处外周包裹步骤（4）制备的双滑 型丝素蛋白膜和贴滑型丝素蛋白膜，包绕1.5圈，在两端的重叠处分别缝 合1针辅助膜的包绕固定。再间断缝合皮肤。术后8周，过量麻药安乐处 死兔后，解剖手术区域，观察肌腱和周围组织的粘连情况，并取下修复区 的肌腱，进行固定、脱水，石蜡包埋、组织切片和HE染等，评估肌腱 的组织的修复质量。结果见图5所示，术后8w，横断后再缝合的肌腱， 在贴滑型丝素蛋白膜或者双滑型丝素蛋白膜的保护作用下，断端处修复连 续，与周围组织的粘连轻微。说明两种类型的丝素蛋白膜均具有阻止肌腱 断端周围组织长入缺损区域，促进肌腱再生修复，减少肌腱和周围组织粘 连发生的作用。

实施例12（丝素蛋白膜促进牙周组织再生修复）

（1）丝素蛋白溶液的制备：同实施例2，获得质量浓度为5%的丝素 蛋白溶液。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具改为：边长20cm的正方形皿，底部为浮法玻璃一面经磨 砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜面。将模具调整水平，加入上 述制备的质量浓度5%丝素蛋白液80ml（4000mg丝素蛋白），去除内部产 生的气泡。在温度45℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空 模具重量增加6g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度60℃，RH90%的湿热交联箱内放置100min， 然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水充 分洗涤，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜，获得厚 度为100μm难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。

（4）制备的贴滑型丝素蛋白膜，切割成8mm×10mm的方形，用铝 箔袋包装，钴60辐照灭菌。用于引导牙周组织再生的动物试验评估。

（5）引导牙周组织再生的动物试验：牙周病等病因引起的牙槽骨吸 收和牙周膜萎缩等，均会导致牙齿松动甚至脱落。牙周膜和牙槽骨的再生 修复，常因为牙龈组织的瘢痕占位和口腔微生物的入侵，失去了局部的适 宜环境，导致修复效果差。改善牙周组织再生的局部微环境，是促进牙周 的再生的有效方法。故在本试验中采用贴滑型丝素蛋白膜作为牙周组织再 生的引导膜，在犬第2-4三颗前磨牙的颊侧牙槽骨和牙周膜磨损后，牙周 组织的再生修复能力。

本试验采用雄性Beagle狗，牙体、牙列完整，无龋坏，无明显磨耗， 牙周情况良好，年龄为15个月左右，体重为10～12kg。毕格犬用肌肉注 射麻药，全麻后，医用碘伏消毒手术区域，在相对无菌的操作条 件下沿下颌龈沟切开并翻起前磨牙P2～P4区颊侧面粘骨膜瓣，去除该区 部分颊侧牙槽骨，至釉牙骨质界下3～4mm，刮净缺损区根面牙周韧带和 牙槽骨，生理盐水冲洗。将步骤（4）制备的贴滑型丝素蛋白膜覆盖于缺 损区域，膜的上端略低于龈缘，下端覆盖牙槽骨1～2mm，膜的粗糙面朝 向牙槽骨，光滑面朝向牙龈，复位和间断缝合龈粘骨膜瓣。在术后8W大 体拍照下颌骨颊侧面的牙周组织修复情况，过量麻药安乐处死犬后，分别 取下两侧下颌骨，保留颊侧面牙周组织，行X射线影像学评估。并将样 品进行组织固定、脱钙、石蜡包埋和组织学masson染，评估牙周膜和 牙槽骨的再生修复效果，结果如图6、图7所示。结果，术后8周，大体 照片显示牙周组织修复与正常组织无差异。X射线图片（图7）表现为， 牙槽骨的缺损区域边界已经模糊，难以辨认缺损区，说明牙槽骨已经大部 分再生。组织学显示在牙根和牙槽骨之间的牙周膜，已经向上爬行再生， 与之伴随着牙槽骨的再生修复。