C-KIT基因多点突变单管快速检测方法及试剂盒

本发明涉及一种突变检测试剂盒，特别涉及一种C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒。

C-kit是一种原癌基因，位于染体4q11-12，大小约80kb，人类C-kit受体是由C-kit原癌基因编码的跨膜受体，全长976个氨基酸，相对分子质量为145，该受体具有胞外配体结合区、跨膜区、膜内近膜区和酪氨酸蛋白激酶区(包含TK1和TK2两部分)，属于Ⅲ型酪氨酸激酶受体家族。

胃肠道间质瘤(gastrointestinalstromaltumor，GIST)是消化道最常见的间叶性肿瘤，也是肿瘤生物靶向中的典范。胃肠道间质瘤起源于胃肠道卡哈尔间质细胞（interstitialcellofCajal，ICC）或向ICC分化的原始间充质细胞。

绝大多数GIST表达c-kit编码的KIT蛋白(CD117)，且在许多病例中存在c-kit基因突变，由此通过相互独立地获得传导性激活。即在无配体结合的情况下，KIT仍然能保持持续的自身酪氨酸蛋白激酶活性，从而激活下游的信号传导通路[1-3]。胃肠间质瘤的C-kit突变区主要集中在４个外显子：9、11、13、17，最常见的为11外显子突变，约占65％。

目前研究表明，原癌基因c-kit不仅参与了ICC分化发育及GIST的发生发展，而且c-kit基因突变还与GIST危险度、基因靶向药物耐药性及预后有关，伊马替尼(ImatinibmesylateSTI-571)或称为格列卫(Gleevec)作为一种KIT酪氨酸激酶抑制剂，已应用于转移性和手术难于切除病例的以及部分高度侵袭危险性病例的术后预防性化疗。

c-kit基因药物敏感的突变点，目前普遍认为需检测7个突变位点，市面上的荧光PCR检测试剂盒普遍使用单管一点进行检测，分析过程繁琐而且没有必要。

本专利使用多点突变并行检测技术，在单管中，可通过荧光基团的指示作用，在同一个PCR反应中，即可同时检测出多个突变位点。不需分开几个PCR管分别进行。实现简单，方便的C-KIT点突变检测。

本发明的目的在于提供一种高效的C-KIT多点突变单管快速检测方法及试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

多点突变单管快速检测方法，包括如下步骤：

1)设计针对不同点突变的ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针；其中，中介连接引物由通用序列部分和特异序列部分构成，通用序列部分与通用荧光探针部分序列互补，特异序列部分与点突变下游的部分序列互补；

2)将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针与热启动快速Taq酶系统混合，扩增；

3)检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。

作为上述方法的进一步改进，ARMS引物对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针应为简并的，即一条下游引物、中介连接引物、通用荧光探针可以对应于多条。

作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针上连接荧光基团的核苷酸和淬灭探针上连接淬灭基团的核苷酸在互补配对后的间距不超过4个核苷酸，进一步的，不超过3个、2个、1个或连接在相互配对的两个核苷酸上。

作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为15～30bp。

作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为15～45bp。

互补序列的存在，有利于保证引物间存在足够的亲和力，保证检测结果的可靠性。

作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针的一端连接有保护核酸序列。保护序列的作用在于防止探针的关键序列不被反应体系中无意引入的核酸外切酶过早切除。保护序列不与待测序列、引物等互补配对，可以是简单重复序列，如多个A、T、C、G等。

一种C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，包括DNA提取液，热启动快速Taq酶系统和C-KIT突变检测引物，其特征在于：所述C-KIT突变检测引物由多组ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针组成；其中：中介连接引物的一端序列与待C-KIT突变位点下游的部分序列互补，另一端序列与通用荧光探针部分核酸互补配对。

优选的，上述C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中与C-KIT突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为15～30bp。

优选的，上述C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于10bp，特别的，互补的核酸数量为15～45bp。

特别的，上述C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒中使用的ARMS引物的序列如下：

ARMS引物1：AAGACTTCTGCCTATGCCTAT

ARMS引物2：ATGTATGAAGTACAGGTTGT

ARMS引物3：GGTAATCACATGAATATTGC

ARMS引物4：GATTTTGGTCTAGCCAGAGT

ARMS引物5：TAGCCAGAGACATCAAGAATT

ARMS引物6：ACATCAAGAATGATTCTAAG

ARMS引物7：CATCAAGAATGATTCTAATG

ARMS引物1对应的下游引物为Y1：GAGCCTAAACATCCCCTTAAAT

ARMS引物2对应的下游引物为Y2：TACTGACCAAAACTCAGCCTGT

ARMS引物3对应的下游引物为Y3：AAATCATATTAAAATGTCATGT

ARMS引物4-7对应的下游为引物Y4：AGTTGAAACTAAAAATCCTTT

ARMS引物1对应的中介引物为Z1：

ACCTCGCTCTGAGCTCTACGTAACAACAAAGGTATATTTC

ARMS引物2对应的中介引物为Z2：

ACCTCGCTCTGAGCTCTACACATAGACCCAACACAACT

ARMS引物3对应的中介引物为Z3：

ACCTCGCTCTGAGCTCTACGTAAAGCCGTGTCCAAGCTGC

ARMS引物4-7对应的中介引物为Z4：

ACCTCGCTCTGAGCTCTACACGTGAGTACCCATTCTCT。

特别的，上述c-kit多点突变单管快速检测试剂盒中使用的通用荧光探针的序列为：

5’GA(dT-FAM)GCTCTGTAGGTGTAGAGCTCAGAGCGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，对应的淬灭序列为：5’BHQ-GAGCATC-3’。

热启动快速Taq酶系统的组成为dNTPS（U）、UNG酶、热启动快速Taq酶。

本发明的有益效果是：

1)本发明操作简单，可以定性检测出多点突变的存在。本发明的检测方法中使用的引物设计难度低，大幅降低了引物合成的成本；

2)本发明检测方法克服了现有ARMS技术的局限性，大大提高了其检测通量；

3)本发明的检测方法实现了多管检测反应的简易性，1管反应取代了之前的多管检测，节省人力物力；

4)本发明的检测方法中使用快速Taq酶，比普通Taq酶更好。

图1到图6是本发明检测方法的原理图；

图7是等浓度模板在不同Taq酶反应条件下的PCR扩增曲线，说明本试剂盒中使用的快速Taq酶比普通Taq酶的扩增效果好。

下面结合附图，进一步说明本发明的检测原理。

以c-kit突变点D816V为例，该点的野生型为A，突变型为T，在PCR过程中，首先使用1对引物，含1条针对突变点的ARMS引物（引物最后一个碱基为T）和下游引物。该引物在快速酶的作用下特异性的扩增出突变位点T。野生型位点A不被扩增，如图1所示；

当特异性扩增发生后，在ARMS引物的引导下，快速Taq酶沿着DNA模板，向5’-3’方向移动并水解中介连接引物的序列介导区域，而中介连接引物的探针互补区域则被释放，如图2、图3所示；

释放出来的探针互补区域，基于碱基互补配对原则，与通用荧光探针发生互补，在淬灭基团的存在下，荧光基团的荧光被淬灭，如图4所示；

快速Taq酶通过中介连接引物的探针互补区域，向5’-3’方向移动，水解淬灭基团，从而淬灭基团远离荧光基团，从而PCR反应产生了荧光，如图5、图6所示。

因此，只要多个突变位点的ARMS引物、下游引物和中介连接引物，1组通用荧光探针与通用淬灭互补探针，可以置于一个PCR反应管中，即可以检测出样本中是否存在点突变，显著提高了ARMS法的检测通量。

实施例1

1.C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，主成分如下：

1)DNA提取液：

50mMNaOH、10mMTris-HCl（PH8.0）、1%NP-40、6%Chelex、0.1mMEDTA（PH8.0）组成。

2)快速Taq酶系统：

3U的快速Taq，0.5ul的dNTPs（25mM）。

3)引物：

C-KITARMS引物及对应的下游引物：

中介连接引物：

4)通用荧光探针对如下：

通用荧光探针：

5’GA(dT-FAM)GCTCTGTAGGTGTAGAGCTCAGAGCGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，

通用淬灭互补探针：5’BHQ-GAGCATC-3’。

2.使用C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，操作步骤如下：

1)DNA提取：

取2片10μm的FFPE组织切片，刮取下来后放入到1.5ml离心管中，再加入120μl的DNA提取液，100℃煮沸10分钟后，将离心管12000rpm离心5分钟，取10μl的上清加入到PCR反应管中。

2)快速PCR：

50μl荧光PCR体系中，3U的快速Taq酶，10mMTris-HCL，50mMKCL，0.5U的UNG酶，0.2mMdNTPS（U），3mMMgCl2。通用荧光探针与通用淬灭互补探针各1μm，28个突变位点的ARMS引物、下游引物和中介连接引物各1μm。95度5min后，95℃5秒，58℃31秒，循环数为40循环。

3)监测反应体系的荧光变化，如存在点突变，则荧光信号会增长。

SEQUENCELISTING

<110>广州和实生物技术有限公司

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