一种药物组合物提取物在制备改善行为药物中的应用

一种药物组合物提取物在制备改善行为药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种药物组合物提取物在制备改善行为药物中的应 用，属于中药领域。

背景技术

随着人类寿命的提高，老年人占人口总数的比例逐年上升，同时 老年性疾病的发病率也日趋升高，严重影响老年人的生活质量。认知 能力障碍，记忆能力障碍和行动能力障碍都是与老年性疾病相关的症 状，现有技术公开的能够改善这些行为的药物(如美金刚，左旋多巴) 副作用大，价格较高，而且不能从根本上逆转疾病过程，多数只能缓 解症状，且易形成患者对药物的依赖性，所以迫切需要研究和开发更 好的改善认知、记忆和行动能力的药物。

中药是一个宝贵的药物资源库，能为开发新药物提供重要信息和 新药候选物。已有研究表明中药具有改善老年性疾病症状的活性，如 已经成药的用于改善记忆力衰退、痴呆和老年黄斑变性的银杏叶提取 物就是一种中药提取物。

秀丽隐杆线虫作为一种模式生物，广泛应用于筛选老年性疾 病的药物，并且事实证明，秀丽隐杆线虫体内实验中证明有延缓老年 性疾病发病的活物，在人类中也有较好的疗效，例如美金刚对神 经退行性疾病模型的秀丽隐杆线虫有延缓发病的作用，美金刚最终被 作为特效药物，用于人类中重度阿尔茨海默症。秀丽隐杆线虫能 用于筛选人类疾病药物的原因主要有：秀丽隐杆线虫与人类的药物靶 点具有保守性。秀丽隐杆线虫的趋化性已经用于表征认知能力和记忆 能力，秀丽隐杆线虫的麻痹表型用于表征行动能力。

本发明现提供一种药物组合物提取物，其能改善秀丽隐杆线虫行 为。本发明公开了这种药物组合物提取物在制备改善行为药物中的新 用途。

发明内容

本发明的目的是提供一种药物组合物提取物的新用途，具体涉及 该药物组合物提取物在制备改善行为药物中的应用。

其中，所述药物组合物提取物包括人参、麦冬、五味子，人参、 麦冬、五味子的质量比为9：9：6；药物组合物提取物制备方法如下： 使用乙醇浸泡人参，麦冬，五味子，加热回流，过滤，减压浓缩后得 浸膏，用蒸馏水完全溶解浸膏，上大孔树脂吸附，用不同浓度的乙醇 溶液梯度洗脱，洗脱液浓缩，干燥之后即得；其中，300mL乙醇浸泡 原料药材1h；加热回流两次，每次的时间为3h；大孔树脂的型号为 D101型。

上述乙醇溶液梯度洗脱大孔树脂上吸附的产物时，溶液中乙醇的 浓度依次为0％，30％，50％，70％，100％。

本发明所述洗脱液为100％的乙醇。

本发明所述的一种药物组合物提取物在制备改善行为药物中的 应用，这些行为包括认知能力障碍和记忆能力障碍。

本发明所述的一种药物组合物提取物在制备改善行为药物中的 应用，认知能力障碍和记忆能力障碍是由神经系统功能紊乱引起的。

本发明所述的一种药物组合物提取物在制备改善行为药物中的 应用，神经系统功能紊乱是β-淀粉样蛋白(Aβ)在神经系统中过度 表达引起的。

本发明所述的一种药物组合物提取物在制备改善行为药物中的 应用，这些行为包括行动能力障碍。

本发明所述的一种药物组合物提取物在制备改善行为药物中的 应用，行动能力障碍是肌肉功能缺失引起的。

本发明所述的一种药物组合物提取物在制备改善行为药物中的 应用，肌肉功能缺失是β-淀粉样蛋白(Aβ)在肌肉组织中过度表达 引起的。

本发明公开的改善行为药物组合物提取物与现有技术相比较，具 有价格较低，副作用小，制备简单等优势，而且本发明公开的改善行 为的药物能同时改善多个行为缺陷，具有广泛的适用性。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本 发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例一药物组合物水煎液的制备

材料：人参、麦冬、五味子购买于兰州惠仁堂药业连锁有限责任 公司。

药物组合物水煎液的制备方法：

a、称取人参9g，麦冬9g，五味子6g；

b、量取100mL的蒸馏水浸泡人参、麦冬、五味子30min；

c、将药材与水的混合物加热到沸腾；

d、沸腾之后30min停止加热，待其冷却之后，用纱布和漏斗过 滤；

e、用蒸馏水把药液的体积定容到50mL；

f、离心药液以除去沉淀，离心的条件是12000r/min，4℃，离 心10min，离心之后倾倒出上清液，在同样的条件下再次离心，再倾 倒出上清液；

g、使用0.22μm的无菌滤头过滤药液，过滤之后的药液用灭过菌 的离心管保存，无菌药液置于4℃中保存。

实施例二药物组合物提取物的制备

材料：同实施例一。

药物组合物提取物的制备方法：

称取人参90g、麦冬90g、五味子60g，用300mL乙醇浸泡1h， 加热回流两次，每次回流3h，过滤，减压浓缩得到药物组合物浸膏。

用蒸馏水完全溶解药物组合物浸膏，上大孔树脂柱吸附，用乙 醇溶液梯度洗脱，溶液中乙醇的浓度依次为0％，30％，50％，70％， 100％，洗脱液浓缩，干燥。称取各个浓度乙醇洗脱下来产物的质量 总和为19.6g。

其中，所用大孔树脂柱的型号为D101型。本发明使用的产品是 用100％乙醇洗脱下来得到的产物。

实施例三药物组合物提取物水煎液改善神经系统功能紊乱导致的 认知能力障碍和记忆能力障碍的作用

1、生物材料

(1)秀丽隐杆线虫CL2122和CL2355均购自Caenorhabditis GeneticsCenter(CGC)；它们都是转基因品系，秀丽隐杆线虫CL2122 的基因型dvIs15[pPD30.38(unc-54vector)+mtl-2::GFP(pCL26)]，它 的神经系统不表达β-淀粉样蛋白(Aβ)，神经系统功能正常。

秀丽隐杆线虫CL2355的基因型smg-1(cc546)dvIs50[pCL45 (snb-1::Abeta1-42::3'UTR(long)+mtl-2::GFP]I，温度升高到23℃以 后，秀丽隐杆线虫CL2355神经系统内表达β-淀粉样蛋白(Aβ)，当 Aβ在神经系统累积过多，就导致其功能紊乱，从而出现对化学气味 剂趋化的缺陷。本实施例使用秀丽隐杆线虫CL2355对化学气味剂趋 化性的缺陷表征人类神经系统功能紊乱引起的认知能力障碍和记忆 能力障碍。

(2)大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自Caenorhabditis GeneticsCenter，作为秀丽隐杆线虫的食物。

2、试剂

(1)苯甲醛，结构式：H₅C₆-CHO，购自天津市凯信化学工业有 限公司，CAS：100-52-7。在本实施例中苯甲醛为化学气味剂。

(2)银杏叶提取物(EGb761)，购自台湾济生化学制药厂股份 有限公司。EGb761在本实施例中为阳性对照药物，已公开的文献报 道其最佳浓度为0.1g/L。

(3)固体NGM(NematodeGrowthMedium)培养基成分与制作 (以1升为例)：

成分 含量

NaCl 3.00g

K ₂HPO ₄ 2.34g

KH ₂PO ₄ 17.23g

蛋白胨 2.50g

琼脂 17.00g

补充H ₂O至 1000mL

固体NGM培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在 无菌操作台下加入5g/L胆固醇1mL，1MMgSO₄1mL,1MCaCl₂1mL,摇匀，趁热倒入已灭菌培养皿。静置等待培养基凝固，备用。

(4)M液配方

Na ₂HPO ₄ 6.00g

KH ₂PO ₄ 3.00g

NaCl 5.00g

1M MgSO ₄ 1.00mL

补充H ₂O至 1000mL

配制好M液之后，121℃下高压恒温灭菌20min，待其冷却， 置于室温下，备用。

(5)配制含有银杏叶提取物(EGb761)的NGM培养基

吸取855μL的17.5mg/5mL的银杏叶提取物溶于2.145mL的M 液，即为1g/L的银杏叶提取物母液，再把3mL母液溶于27mL的NGM 中，银杏叶提取物的浓度就为0.1g/L，把此NGM培养基平均倒入3 个60mm的培养基中即可。

(6)配制含有药物组合物提取物的NGM培养基

吸取400μL的生药浓度24g/50mL的药物组合物提取物溶于 3.6mL的M液，此时液体中的生药浓度48g/L，取3mL液体溶于27mL 的NGM培养基，则药物组合物提取物在NGM中的生药浓度分别为 4.8g/L，把NGM培养基分别倒入三个60mm的培养皿中。

前期实验使用0.96g/L，4.8g/L和24g/L的药物组合物提取物(EE) 处理秀丽隐杆线虫，结果表明：4.8g/L药物组合物提取物改善秀丽隐 杆线虫趋化性和麻痹的效果最好，而且没有表现出抑制生长的毒性， 所以本发明使用的EE的生药浓度为4.8g/L。

(7)配制不含药物的NGM培养基

吸取3mL的M液，溶于27mL的NGM培养基中，再把培养基 分别倒入三个60mm的培养皿中。

(8)秀丽隐杆线虫裂解液的配制

取0.32mL的NaClO液体溶于4.68mL的M液，再加入5mL1M 的NaOH溶液，即为秀丽隐杆线虫裂解液。

(9)检测秀丽隐杆线虫趋化性指数培养基的配方(以1L为例)

成分 含量

KH ₂PO ₄ 3.20g

K ₂HPO ₄ 0.25g

琼脂 19.00g

补充H ₂O至 1000mL

培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台 下加入1MMgSO₄1mL,1MCaCl₂1mL,摇匀，趁热倒入已灭菌90mm 的培养皿。静置等待培养基凝固，备用。

(10)0.1％苯甲醛的乙醇溶液配制

吸取5μL苯甲醛液体溶于5mL100％乙醇，将其置于4℃中备用。

(11)0.1MNaN₃溶液的配制

称取0.065gNaN₃固体溶于10mL蒸馏水，NaN₃的浓度即为0.1M。 待其完全溶解之后，将其置于4℃中备用。

3、仪器

4、实施步骤

(1)秀丽隐杆线虫的培养：

将秀丽隐杆线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然 后置于16℃的恒温箱中培养，秀丽隐杆线虫长到成虫阶段时，进行 同步化处理

(2)秀丽隐杆线虫同步化

挑选含有大量成虫并且有部分虫卵已经孵出的NGM培养基， 用M液将秀丽隐杆线虫从培养基上冲下，转移到离心管中,静置使秀 丽隐杆线虫自由沉降至管底，弃上清。视秀丽隐杆线虫量多少向离心 管中加入秀丽隐杆线虫裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待秀丽 隐杆线虫全部断裂时停止涡旋,并分装于1.5mL离心管中，用M液洗 虫卵三次，然后把秀丽隐杆线虫的卵直接加到涂有OP50的含有药物 的NGM培养基上。

(3)药物组合物提取物水煎液改善神经系统功能紊乱导致的认 知能力障碍和记忆能力障碍的作用：

同步化秀丽隐杆线虫CL2122或CL2355之后，将其卵分别接到 含有药物的NGM培养基上，将培养皿置于16℃下36h，然后把培养 皿转移到23℃下，放置36h，然后用M液把秀丽隐杆线虫冲洗下来， 把含有秀丽隐杆线虫的液体加入到10mL的离心管中，并往里面加入 M液，直到液体充满10mL离心管，待秀丽隐杆线虫自然沉降到离心 管底部之后，把上清液吸出，并再次使离心管中加满M液，等到秀 丽隐杆线虫自然沉降到离心管底部，再把上清液吸出。

在检测用培养基(不涂OP50)的两端分别滴1μL0.1％苯甲醛的 100％乙醇溶液(气味吸引剂)和1μL100％乙醇(对照)，并在两个 同样的地方都滴1μL0.1mM的NaN₃溶液，培养基的中心位置加入秀丽 隐杆线虫，其数量在50--70条的范围内。把培养皿置于23℃恒温箱 中，1h之后，计数培养基两边的秀丽隐杆线虫数。

趋化性指数(CI)＝(气味吸引剂一侧秀丽隐杆线虫数-对照一侧 秀丽隐杆线虫数)/培养基上秀丽隐杆线虫总数(Wuetal.,2006)， 趋化性指数越高，表示药物延缓麻痹的作用越强。

表1趋化性指数(CI)

组别 CL2122 CL2355

C 0.7030±0.0387 0.2440±0.0413

P ₁ 0.6521±0.0422 0.4776±0.0389

EE 0.7591±0.0854 0.7033±0.0876

(C指空白对照，即不含药物NGM处理的秀丽隐杆线虫；P1 为阳性对照，即0.1g/L的银杏叶提取物(EGb761)处理的秀丽隐杆 线虫；EE表示本发明的药物组合物提取物处理的秀丽隐杆线虫，其 生药浓度为4.8g/L。不同的字母代表两个处理组之间有显著性差异， 显著性差异都是与相应株系的空白对照比较。)

由表1可以看出，对于趋化性没有缺陷的秀丽隐杆线虫CL2122， P1和EE对它的趋化性没有显著性的作用；对于趋化性缺陷的秀丽隐 杆线虫CL2355，P1和EE都显著提高其趋化性(表1：C,CI＝0.2440 ±0.0413vs.P₁,CI＝0.4776±0.0389.p<0.01；4.8g/LEE,CI＝0.7033± 0.0876.p<0.001)，而且EE延缓麻痹的作用显著优于P1(表1：EE, CI＝0.7033±0.0876vs.P₁,CI＝0.4776±0.0389.p<0.01)。

秀丽隐杆线虫CL2355对化学气味剂趋化性的缺陷表征人类神经 系统功能紊乱引起的认知能力障碍和记忆能力障碍，药物组合物提取 物显著改善秀丽隐杆线虫CL2355趋化性缺陷的作用显著强于现有技 术的银杏叶提取物，表明它防治由Aβ导致的神经系统功能紊乱引起 的认知能力障碍和记忆能力障碍的作用显著强于现有技术。

实施例四药物组合物提取物水煎液改善肌肉功能缺失引起的行 动能力障碍

1、生物材料

(1)秀丽隐杆线虫CL802和CL4176均购自Caenorhabditis GeneticsCenter；它们都是转基因品系，秀丽隐杆线虫CL802的基因 型smg-1(cc546)I；rol-6(su1006)II，其肌肉内不表达β-淀粉样蛋白 (Aβ),肌肉功能正常，不出现肌肉麻痹现象；秀丽隐杆线虫CL4176 的基因型为smg-1(cc546)I；dvIs27[(pAF29)myo-3p::A-Beta (1-42)::let-？3'UTR)+(pRF4)rol-6(su1006)]X，温度升到25℃之后，秀 丽隐杆线虫CL4176在肌肉内表达β-淀粉样蛋白(Aβ)，Aβ在其肌 肉内累积，导致其肌肉功能的缺失，引起麻痹，本实施例应用秀丽隐 杆线虫麻痹模拟人类肌肉功能缺失引起的行动能力障碍。

(2)大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自Caenorhabditis GeneticsCenter，作为秀丽隐杆线虫的食物。

2、试剂

(1)固体NGM培养基、M液、配制含有药物组合物提取物水 煎液的NGM培养基、配制不含药物的NGM培养基、配制秀丽隐杆 线虫裂解液的方法同实施例二。

(2)盐酸美金刚(P₂)，化学名称：1-氨基-3，5-二甲基金刚烷 胺盐酸盐，分子式：C₁₂H₂₁N·HCl，分子量约为216，购自百灵威科技， CAS：41100-52-1；作为阳物(Xinetal.,2013)。

前期的预实验使用1μM，10μM，0.1mM和1mM的盐酸美金 刚分别处理线虫，结果表明：0.1mM的盐酸美金刚具有最好的延缓 秀丽隐杆线虫麻痹的作用，而且没表现出抑制秀丽隐杆线虫生长的毒 性，所以本实施例中使用的盐酸美金刚的终浓度为0.1mM。

(3)配制不含药物的NGM培养基

吸取3mLM液，溶于27mL灭菌之后的NGM培养基中，再把培 养基分别倒入三个60mm的培养皿中。

(4)配制含有盐酸美金刚的NGM培养基

称取0.022g盐酸美金刚溶于10mLM液中，盐酸美金刚的浓度即 为10mM，从中取出1mL的液体，溶于9mLM液，此时盐酸美金刚 的浓度为1mM。再把3mL的1mM盐酸美金刚溶于27mL的NGM中， 盐酸美金刚的浓度就为0.1mM，把此NGM培养基平均倒入3个60mm 的培养基中即可。

(5)配制含有药物组合物提取物水煎液的NGM培养基：同实 施例二。

3、仪器同实施例二。

4、实施步骤

(1)秀丽隐杆线虫的培养、秀丽隐杆线虫同步化同实施例二。

(2)药物组合物提取物水煎液改善肌肉功能缺失引起的行动能 力障碍：

同步化秀丽隐杆线虫CL802和CL4176之后，把秀丽隐杆线虫 CL802的卵接到不含药物的NGM培养基上，而秀丽隐杆线虫CL4176 的卵分别接到不含药物、含0.1mM盐酸美金刚、含药物组合物提取 物水煎液(EE)的NGM培养基上，把培养基置于16℃下3.5d，然 后把培养基转移到25℃下放置34h，开始计数秀丽隐杆线虫肌肉麻痹 表型，每隔2h数一次，一直到所有秀丽隐杆线虫都麻痹。麻痹是指 机械刺激秀丽隐杆线虫身体时，秀丽隐杆线虫不能运动或者只有头部 运动。

表2不同时间点没有麻痹的秀丽隐杆线虫占的百分比

组别 34h 36h 38h 40h 42h 44h 46h

CL802(％) 100 100 100 98 97 96 98

C(％) 85 72 54 38 22 11 2

P ₂(％) 95 87 74 43 28 12 4

EE|(％) 98 92 86 62 53 38 19

(C指空白对照，即不含药物NGM处理的秀丽隐杆线虫；P2 为阳性对照，即0.1mM盐酸美金刚处理的秀丽隐杆线虫；EE表示本 发明的药物组合物提取物处理的秀丽隐杆线虫，其生药浓度为 4.8g/L；秀丽隐杆线虫CL802没有用药物处理。不同的字母代表两个 处理组之间有显著性差异，显著性差异都是与相应株系的空白对照比 较。)

表2中，没有麻痹的秀丽隐杆线虫比例越大，即药物延缓麻痹的作用 越强，在每个时间点，药物组合物提取物(EE)处理秀丽隐杆线虫 没有麻痹的百分比比盐酸美金刚(P₂)处理的百分比大，说明其延缓 麻痹的效果显著优于现有技术公开的盐酸美金刚。

表3秀丽隐杆线虫CL4176的半数麻痹时间(PT50)

组别 CL4176

C 38.61±0.0982

P ₂ 39.48±0.1747

EE 51.44±0.3341

PT50延长，说明麻痹推迟，行动能力增强。

药物组合物提取物(EE)极显著延缓秀丽隐杆线虫麻痹(表3： C,PT₅₀＝38.61±0.0982vs.EE,PT₅₀＝51.44±0.3341.p<0.001)，而且 药物组合物提取物延缓秀丽隐杆线虫麻痹的作用显著优于现有技术 公开的0.1mM盐酸美金刚(表3：4.8g/LSM,PT₅₀＝51.44±0.3341.vs.P₂, PT₅₀＝39.48±0.1747.p<0.01)。说明药物组合物提取物能改善肌肉功 能缺失引起行动能力障碍。

两个实施例表明药物组合物提取物(EE)显著改善神经系统功 能紊乱引起的认知能力障碍、记忆能力障碍和肌肉功能缺失引起的行 动能力障碍，说明该药物组合物提取物有开发成改善行为药物的潜 力。