一种肿瘤的药物组合物的质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种药物组合物的质量控制方法，特别涉及一种肿瘤的药物组合物 的质量控制方法。

背景技术

中药质量控制是现代化进程中亟待解决的关键问题之一。申请号为02153335.0的发 明专利公开了一种肿瘤的药物组合物及其制备方法，该药物组合物是由如下原料药 制成的：黄芪200-400重量份；人参60-130重量份；苦参素6-13重量份。本发明药物 组合物具有益气扶正，增强肌体免疫功能，适用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋 巴瘤、妇科恶性肿瘤；各种原因引起的白细胞低下及减少症，慢性乙型肝炎的。申 请号为200510090766.4的发明专利公开了其质量控制方法中的成品和中间体的指纹图 谱研究，但其中并没有涉及其原料药材人参、黄芪指纹图谱、人参鉴别、黄芪含量测定， 因此有必要进一步提高该药物组合物的质量控制方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种肿瘤的药物组合物的质量控制方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现：

本发明药物组合物是由如下原料制成的：

黄芪200-400重量份、人参60-130重量份、苦参素6-13重量份；

优选黄芪250重量份、人参120重量份、苦参素8重量份；黄芪350重量份、人参 70重量份、苦参素12重量份；或黄芪300重量份、人参100重量份、苦参素10重量份。 本发明所述的药物组合物是按照常规方法加入常规辅料制成的片剂、胶囊剂、散剂、软 胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口 服液体制剂或注射制剂。

本发明药物组合物中间体的制备方法：

称取以上三味原料药，人参用70-80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3小时， 合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，备用；黄芪 加水煎煮2～3次，每次1～3小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20 的清膏，测定温度为65℃，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达60～80％，用氢氧化钠调 PH值至6～7，静置，去上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏， 测定温度为65℃；再加乙醇使含醇量达70～90％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置，滤 过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400体积份(按ml/g的比例)，用氢氧化钠 调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶 解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并， 混匀，即得中间体。

本发明药物组合物的制备方法为：

称取以上三味原料药，人参用70-80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3小时， 合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，备用；黄芪 加水煎煮2～3次，每次1～3小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20 地清膏，测定温度为65℃，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达60～80％，用氢氧化钠调 PH值至6～7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15 的清膏，测定温度为65℃；再加乙醇使含醇量达70～90％，用氢氧化钠调PH值至6～7， 静置12小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400体积份(按ml/g的比 例)，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤；用氢氧化钠调PH值 至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀 盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，加 注射用水至1000体积份(按ml/g的比例)，滤过，灌装，即得。

本发明药物组合物优选如下方法制备：

称取以上三味原料药，人参用75％的乙醇，回流提取3次，每次2小时，合并提取液， 减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，备用；黄芪加水煎煮2次， 每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为 65℃，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置12小 时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏，测定温度为65 ℃；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置，滤过，滤液回收乙醇 至无醇味，加注射用水到400体积份(按ml/g的比例)，用氢氧化钠调PH值至6～7，100 ℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤。用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸 15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30 分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，加注射用水至1000体积份(按ml/g的比 例)，滤过，灌装，即得。

本发明药物组合物的质量控制方法含有如下鉴别、含量测定和/或指纹图谱检测方法 中的一种或几种：

鉴别：取本发明药物组合物制剂10～30体积份，于水浴上蒸干，残渣加甲醇3～8体积 份使溶解，作为供试品溶液；另取人参对照药材0.5～1.5重量份，加30～50 体积份，加热回流1小时，弃去液，药渣挥干溶剂，加水0.3～0.8体积份搅拌 湿润，加水饱和正丁醇5～15体积份，超声处理20～40分钟，吸取上清液加1～5倍量 氨试液，摇匀，放置分层，取上清液蒸干，残渣加甲醇0.5～1.5体积份使溶解，作为对 照药材溶液；再取人参皂苷Re、Rg1对照品，分别加甲醇制成每1体积份含0.001～0.003 重量份的对照品溶液；照薄层谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上 述四种溶液各0.0015～0.0025体积份，分别点于厚500μm同一硅胶重量份薄层板上，以 -乙酸乙酯-甲醇-水＝10～20∶30～50∶17～27∶5～15在10℃以下放置的下层溶 液为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显清晰， 分别置日光下检视；供试品谱中，在与对照药材和对照品谱相应位置上，显相同颜的 斑点；

含量测定：

A：人参

照高效液相谱法(《中国药典2005年版一部》附录VID)测定；

谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水＝15～ 25∶75～85为流动相；检测波长为203nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于3000； 对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每 1体积份各含0.0002～0.0003重量份的混合溶液，摇匀，即得；供试品溶液的制备：量 取装量差异项下的本发明药物组合物制剂20～30体积份，置分液漏斗中，用提 取1～3次，每次10～30体积份，弃去液，水液用水饱和正丁醇提取4～6次， 每次10～30体积份，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液洗涤2～4次，每次20～40体积份， 弃去碱液，再用正丁醇饱和的水轻轻摇洗2～4次，每次20～40体积份，弃去水液，取 正丁醇液蒸干；残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取 续滤液，即得；测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各0.005～0.0015体积份，注 入液相谱仪，测定，即得；本发明药物组合物制剂按日用剂量计含人参皂苷Rg1(C42H72O14) 和人参皂苷Re(C48H82O18)的总量不得少于0.00004重量份；

B：苦参素

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定；谱条件与系统适用 性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；1％磷酸溶液-乙腈＝90～95∶5～10，其中磷 酸溶液用三乙胺调节PH值为2.5为流动相，检测波长为220nm；理论板数按氧化苦参碱 峰计算应不低于2000，氧化苦参碱峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求；对照品溶液的 制备：精密称取氧化苦参碱对照品适量，加流动相制成每1体积份中含0.0002～0.0003 重量份的溶液，即得；供试品溶液制备：量取本发明药物组合物制剂2.0～3.0体积份， 置100体积份量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得；测定法：量取对照品溶液及 供试品溶液各0.01～0.03体积份，分别注入液相谱仪，记录谱图，按外标法以峰面 积计算；本发明药物组合物制剂按日服用剂量计含苦参素以氧化苦参碱(C15H24N2O2) 计，应为0.009重量份～0.011重量份；

C：黄芪

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定；谱条件与系统适用 性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水＝30～35∶65～70为流动相；蒸 发光散射检测器；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；对照品溶液的制备：精密 称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1体积份含0.0001～0.0003重量份的溶液，即 得；供试品溶液的制备：取本发明药物组合物制剂80～120体积份，混匀，量取5～15 体积份，于水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5体积份量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀，即得；测定法：吸取对照品溶液0.005～0.015体积份、0.01～0.03体积份及供试 品溶液0.01～0.03体积份，注入液相谱仪，测定，即得；本发明药物组合物制剂按日 服用剂量计含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.00004重量份。

指纹图谱检测：

A：本发明药物组合物制剂成品指纹图谱检测方法包括如下步骤：

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VID)：

谱条件及系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A， 以80％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B.20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检测波长203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密 称取人参皂苷Rg1对照品0.002～0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解 并稀释至刻度，即得；供试品溶液的制备：取本发明药物组合物制剂作为供试品溶液；测 定法：取参照物溶液和供试品溶液各0.01～0.03体积份，注入高效液相谱仪，记录 65min谱；供试品指纹图谱中与参照物人参皂苷Rg1相应的峰为S峰，计算各共有峰相 对保留时间；供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图1)有良好的相似 性；

指纹图谱应有12个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.830、S峰为1.000、2号峰为 1.100、3号峰为1.221、4号峰为1.294、5号峰为1.630、6号峰为1.738、7号峰为1.811、 8号峰为1.848、9号峰为1.887、10号峰为2.015、11号峰为2.808；

各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.105、S峰为1.000、2号峰为0.296、3 号峰为2.244、4号峰为0.495、5号峰为0.131、6号峰为0.052、7号峰为0.031、8号 峰为0.050、9号峰为0.055、10号峰为0.044、11号峰为0.019；

非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

B：本发明药物组合物制剂中间体指纹图谱检测方法包括如下步骤：

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VD)，结合指纹图谱的 要求进行测定；谱条件及系统适用性试验：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A、80％乙腈溶液为流动相B进行 梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～ 49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检测波长203nm； 柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1对照品0.002～ 0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得；供试品溶 液的制备：取1～3体积份中间体，用水稀释至8～12体积份，作为供试品溶液；HPLC分 析前用0.45μm水系滤膜过滤；测定法：取参照物溶液和供试品溶液各0.01～0.03体积份， 注入高效液相谱仪，记录65min谱，以人参皂苷Rg1峰为参考峰(S)，计算各共有 峰的相对保留时间；供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图2)有良好 的相似性；

指纹图谱应有19个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.827、S峰为1.000、2 号峰为1.100、3号峰为1.222、4号峰为1.296、5号峰为1.636、6号峰为1.744、7号 峰为1.817、8号峰为1.855、9号峰为1.895、10号峰为2.024、11号峰为2.137、12 号峰为2.375、13号峰为2.694、14号峰为2.837、15号峰为2.987、16号峰为3.382、 17号峰为3.542、18号峰为3.643；

各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.129、S峰为1.000、2号峰为0.209、 3号峰为1.636、4号峰为0.542、5号峰为0.183、6号峰为0.158、7号峰为0.133、8 号峰为0.099、9号峰为0.102、10号峰为0.050、11号峰为0.171、12号峰为0.185、 13号峰为0.070、14号峰为0.059、15号峰为0.050、16号峰为0.060、17号峰为0.143、 18号峰为0.063；

非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

C：人参药材指纹图谱检测标准：

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VD)；谱条件及系统 适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以80％乙腈溶液为流 动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～ 35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检 测波长203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密称取人参皂苷 Rg1对照品0.002～0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度， 即得；供试品溶液的制备：药材经粉碎后过3号筛，取各批药材粉末4～6重量份，精密 称定，置于250ml圆底烧瓶中，加40～60体积份75％乙醇，加热回流30min，离心，取 提取液，如此3～5次，合并提取液，旋蒸至干，用40～60体积份40％甲醇溶液溶解， 离心，精密量取上清液1～3体积份，用40％甲醇溶液稀释至8～12体积份，作为供试品 溶液；HPLC分析前用0.45μm的有机系滤膜过滤；测定法：取参照物溶液和供试品溶液各 0.001～0.003体积份，注入高效液相谱仪，记录65min谱；供试品指纹图谱中与参 照物相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间；供试品指纹图谱应与质量标准所附 的对照指纹图谱(附图3)有良好的相似性；

指纹图谱应有15个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.731、2号峰为0.824、S 峰为1.000、3号峰为1.649、4号峰为1.699、5号峰为1.739、6号峰为1.828、7号峰 为1.870、8号峰为1.925、9号峰为1.951、10号峰为2.000、11号峰为2.151、12号 峰为3.031、13号峰为3.605、14号峰为3.875；

各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.048、2号峰为0.108、S峰为1.000、 3号峰为0.213、4号峰为0.078、5号峰为0.621、6号峰为0.409、7号峰为0.046、8 号峰为0.243、9号峰为0.039、10号峰为0.027、11号峰为0.157、12号峰为0.027、 13号峰为0.099、14号峰为0.257；

非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

D：黄芪药材指纹图谱检测标准

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VD)；谱条件及系统 适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以80％乙腈溶液为流 动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～ 35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检 测波长203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；内标物溶液的制备：精密称取人参皂苷 Rg1对照品0.002～0.004重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度， 即得；供试品溶液的制备：黄芪切片经粉碎后过3号筛，取黄芪粉末4～6重量份，加水 40～60体积份，回流提取2～4小时，离心，取提取液，如此1～3次，合并提取液，浓 缩至20～40体积份，加乙醇至含醇量为75％，4℃放置过夜，离心，上清液用75％乙醇定 容至200～300体积份，取4～6体积份，加入0.4～0.6体积份内标物溶液，作为供试品 溶液；HPLC分析前用0.45μm有机系滤膜过滤；测定法：取内标物溶液和供试品溶液各 0.01～0.03体积份，注入高效液相谱仪，记录65min谱，分别以内标物人参皂苷Rg1 峰(S1)和相对S1峰保留时间约为1.25的谱峰为参考峰(S)，计算各共有峰的相对 保留时间；供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图4)有良好的相似性； 指纹图谱应有12个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间(1)按分钟计分别为：S1号峰为1.000、1号峰为1.063、 S峰为1.226、2号峰为1.344、3号峰为1.777、4号峰为2.157、5号峰为2.247、6号 峰为2.292、7号峰为2.382、8号峰为3.085、9号峰为3.540、10号峰为3.603； 各序号特征峰的相对保留时间(2)按分钟计分别为：S1号峰为0.816、1号峰为0.867、 S峰为1.000、2号峰为1.096、3号峰为1.449、4号峰为1.760、5号峰为1.833、6号 峰为1.870、7号峰为1.943、8号峰为2.516、9号峰为2.888、10号峰为2.939； 各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.385、S峰为1.000、2号峰为1.975、3 号峰为0.090、4号峰为0.402、5号峰为0.049、6号峰为0.693、7号峰为1.064、8号 峰为0.155、9号峰为0.043、10号峰为0.054；

非共有峰面积不得过总峰面积的10％。

本发明药物组合物的质量控制方法优选如下鉴别、含量测定和/或指纹图谱检测方法 中的一种或几种：

鉴别：

取本发明药物组合物制剂20体积份，于水浴上蒸干，残渣加甲醇5体积份使溶解， 作为供试品溶液；另取人参对照药材1重量份，加40体积份，加热回流1小时， 弃去液，药渣挥干溶剂，加水0.5体积份搅拌湿润，加水饱和正丁醇10体积份， 超声处理30分钟，吸取上清液加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上清液蒸干，残渣 加甲醇1体积份使溶解，作为对照药材溶液；再取人参皂苷Re、Rg1对照品，分别加甲醇 制成每1体积份含0.002重量份的对照品溶液；照薄层谱法(中国药典2005年版一部 附录VIB)试验，吸取上述四种溶液各0.0018体积份，分别点于厚500μm同一硅胶G 薄层板上，以-乙酸乙酯-甲醇-水＝15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下层溶液为 展开剂，展开，取出，凉干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显清晰，分别 置日光下检视；供试品谱中，在与对照药材和对照品谱相应位置上，显相同颜的斑点；

含量测定：

A：人参照高效液相谱法(《中国药典2005年版一部》附录VID)测定；谱条件 与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水＝19∶81为流动相； 检测波长为203nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备： 精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1体积份各含0.00025 重量份的混合溶液，摇匀，即得；供试品溶液的制备：量取装量差异项下的本发明药物组 合物制剂25体积份，置分液漏斗中，用提取2次，每次20体积份，弃去三氯甲 烷液，水液用水饱和正丁醇提取5次，每次20体积份，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液 洗涤3次，每次30体积份，弃去碱液，再用正丁醇饱和的水轻轻摇洗3次，每次30体 积份，弃去水液，取正丁醇液蒸干；残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻 度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各0.01 体积份，注入液相谱仪，测定，即得；本发明药物组合物制剂按日服用剂量计含人参 皂苷Rg1(C42H72O14)和人参皂苷Re(C48H82O18)的总量不得少于0.00004重量份；

B：苦参素照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定；谱条件 与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；1％磷酸溶液-乙腈＝93∶7为流动 相，其中磷酸溶液用三乙胺调节PH值为2.5，检测波长为220nm；理论板数按氧化苦参 碱峰计算应不低于2000，氧化苦参碱峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求；

对照品溶液的制备：称取氧化苦参碱对照品适量，加流动相制成每1体积份中含 0.00025重量份的溶液，即得；供试品溶液制备：量取本发明药物组合物制剂按日服用剂 量计2.5体积份，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得；测定法：量取对 照品溶液及供试品溶液各0.020体积份，分别注入液相谱仪，记录谱图，按外标法 以峰面积计算；本发明药物组合物制剂按日服用剂量计含苦参素以氧化苦参碱(C15H24N2O2) 计，应为0.009重量份～0.011重量份；

C：黄芪照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定；谱条件与 系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水＝32∶68为流动相；蒸发 光散射检测器；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；对照品溶液的制备：称取黄芪 甲苷对照品适量，加甲醇制成每1体积份含0.0002重量份的溶液，即得；供试品溶液的 制备：取本发明药物组合物制剂100体积份，混匀，精密量取10体积份，于水浴上蒸干， 残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法吸取对照 品溶液0.01体积份、0.02体积份及供试品溶液0.02体积份，注入液相谱仪，测定， 即得；本发明药物组合物制剂按日服用剂量计黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于 0.00004重量份。

指纹图谱检测：

A：本发明药物组合物制剂成品指纹图谱检测方法包括如下步骤：

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VID)：

谱条件及系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A， 以80％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检测波长203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密 称取人参皂苷Rg1对照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释 至刻度，即得；供试品溶液的制备：取本发明药物组合物制剂作为供试品溶液；测定法： 取参照物溶液和供试品溶液各0.02体积份，注入高效液相谱仪，记录65min谱；供 试品指纹图谱中与参照物人参皂苷Rg1相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间； 供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图1)有良好的相似性；

指纹图谱应有12个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.830、S峰为1.000、2 号峰为1.100、3号峰为1.221、4号峰为1.294、5号峰为1.630、6号峰为1.738、7号 峰为1.811、8号峰为1.848、9号峰为1.887、10号峰为2.015、11号峰为2.808； 各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.105、S峰为1.000、2号峰为0.296、3 号峰为2.244、4号峰为0.495、5号峰为0.131、6号峰为0.052、7号峰为0.031、8号 峰为0.050、9号峰为0.055、10号峰为0.044、11号峰为0.019；

非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

B：本发明药物组合物制剂中间体指纹图谱检测方法包括如下步骤：

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VD)，结合指纹图谱的 要求进行测定；谱条件及系统适用性试验：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A、80％乙腈溶液为流动相B进行 梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～ 49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检测波长203nm； 柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1对照品0.003 重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得；供试品溶液的制 备：取2体积份中间体，用水稀释至10体积份，作为供试品溶液；HPLC分析前用0.45μm 水系滤膜过滤；测定法：取参照物溶液和供试品溶液各0.02体积份，注入高效液相谱 仪，记录65min谱，以人参皂苷Rg1峰为参考峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间； 供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图2)有良好的相似性；

指纹图谱应有19个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.827、S峰为1.000、2 号峰为1.100、3号峰为1.222、4号峰为1.296、5号峰为1.636、6号峰为1.744、7号 峰为1.817、8号峰为1.855、9号峰为1.895、10号峰为2.024、11号峰为2.137、12 号峰为2.375、13号峰为2.694、14号峰为2.837、15号峰为2.987、16号峰为3.382、 17号峰为3.542、18号峰为3.643；

各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.129、S峰为1.000、2号峰为0.209、3 号峰为1.636、4号峰为0.542、5号峰为0.183、6号峰为0.158、7号峰为0.133、8号 峰为0.099、9号峰为0.102、10号峰为0.050、11号峰为0.171、12号峰为0.185、13 号峰为0.070、14号峰为0.059、15号峰为0.050、16号峰为0.060、17号峰为0.143、 18号峰为0.063；

非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

C：人参药材指纹图谱检测标准：

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VD)；谱条件及系统 适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以80％乙腈溶液为流 动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～ 35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检 测波长203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密称取人参皂苷 Rg1对照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得； 供试品溶液的制备：药材经粉碎后过3号筛，取各批药材粉末5重量份，精密称定，置于 250ml圆底烧瓶中，加50体积份75％乙醇，加热回流30min，离心，取提取液，如此4 次，合并提取液，旋蒸至干，用50体积份40％甲醇溶液溶解，离心，精密量取上清液2 体积份，用40％甲醇溶液稀释至10体积份，作为供试品溶液；HPLC分析前用0.45μm的 有机系滤膜过滤；测定法：取参照物溶液和供试品溶液各0.002体积份，注入高效液相 谱仪，记录65min谱；供试品指纹图谱中与参照物相应的峰为S峰，计算各共有峰 相对保留时间；供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图3)有良好的相 似性；

指纹图谱应有15个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.731、2号峰为0.824、S 峰为1.000、3号峰为1.649、4号峰为1.699、5号峰为1.739、6号峰为1.828、7号峰 为1.870、8号峰为1.925、9号峰为1.951、10号峰为2.000、11号峰为2.151、12号 峰为3.031、13号峰为3.605、14号峰为3.875；

各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.048、2号峰为0.108、S峰为1.000、 3号峰为0.213、4号峰为0.078、5号峰为0.621、6号峰为0.409、7号峰为0.046、8 号峰为0.243、9号峰为0.039、10号峰为0.027、11号峰为0.157、12号峰为0.027、 13号峰为0.099、14号峰为0.257；

非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

D：黄芪药材指纹图谱检测标准：

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VD)；谱条件及系统 适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以80％乙腈溶液为流 动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～ 35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检 测波长203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；内标物溶液的制备：精密称取人参皂苷 Rg1对照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得； 供试品溶液的制备：黄芪切片经粉碎后过3号筛，取黄芪粉末5重量份，加水50体积份， 回流提取3小时，离心，取提取液，如此2次，合并提取液，浓缩至30体积份，加乙醇 至含醇量为75％，4℃放置过夜，离心，上清液用75％乙醇定容至250体积份，取5体积 份，加入0.5体积份内标物溶液，作为供试品溶液；HPLC分析前用0.45μm有机系滤膜 过滤；测定法：取内标物溶液和供试品溶液各0.02体积份，注入高效液相谱仪，记录 65min谱，分别以内标物人参皂苷Rg1峰(S1)和相对S1峰保留时间约为1.25的谱 峰为参考峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间；供试品指纹图谱应与质量标准所附的 对照指纹图谱(附图4)有良好的相似性；

指纹图谱应有12个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间(1)按分钟计分别为：S1号峰为1.000、1号峰为1.063、 S峰为1.226、2号峰为1.344、3号峰为1.777、4号峰为2.157、5号峰为2.247、6号 峰为2.292、7号峰为2.382、8号峰为3.085、9号峰为3.540、10号峰为3.603； 各序号特征峰的相对保留时间(2)按分钟计分别为：S1号峰为0.816、1号峰为0.867、 S峰为1.000、2号峰为1.096、3号峰为1.449、4号峰为1.760、5号峰为1.833、6号 峰为1.870、7号峰为1.943、8号峰为2.516、9号峰为2.888、10号峰为2.939； 各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.385、S峰为1.000、2号峰为1.975、3 号峰为0.090、4号峰为0.402、5号峰为0.049、6号峰为0.693、7号峰为1.064、8号 峰为0.155、9号峰为0.043、10号峰为0.054；

非共有峰面积不得过总峰面积的10％。

本发明所述的重量份与体积份的比例为克/毫升。本发明药物组合物质量控制方法可 以应用于组合物的各种剂型，如片剂、胶囊、口服液、滴丸、喷雾剂、颗粒剂等临床可 接受的剂型，由于不同剂型的制剂其中所含的相当生药量是相同的，因此各个剂型在进 行质量控制时，所选用样品量可统一折算为相当生药量。

本发明药物组合物制剂的质量控制方法，包括人参鉴别，人参、苦参素的含量测定以及 本发明药物组合物制剂成品和中间体的指纹图谱等方法，共同构成了本发明药物组合物 的质量控制体系，在过程中采用特定的方法处理供试液，或者采用特定的填充剂、流动 相等，使最终得到的结果数据更确切，有效地控制了本发明药物组合物制剂的质量。

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1人参含量测定实验

1.仪器与试药：仪器：高效液相谱仪2010A(日本岛津)、数据处理机CLASS-VP (日本岛津)、紫外-可见分光光度计UV-2550(日本岛津)、电子天平：Mettler AL 204-IC (瑞士)。

试药：人参皂苷Rg1对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：110703-200322， 供含量测定用；人参皂苷Re对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号： 110754-200320，供含量测定用；乙腈，甲醇为谱纯，水为超纯水。

2.谱条件：谱柱：Zorbax Extend C18十八烷基硅烷键合硅胶；5μm 4.6mm ×250mm；柱温：40℃；流动相：乙腈-水(19∶81)；流速：0.8ml/min；检测波长： 203nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re适量，加甲醇制成每1ml 含人参皂苷Rg10.2524mg、人参皂苷Re 0.3052mg的混合溶液，即得。(以下实验所用对 照品浓度同此)供试品溶液的制备：精密量取装量差异项下的本品25ml，置分液漏斗中， 用提取2次，每次20ml，弃去液，水液用水饱和正丁醇提取5次，每次 20ml，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液洗涤3次，每次30ml，弃去碱液，再用正丁醇饱和 的水轻轻摇洗3次，每次30ml，弃去水液，取正丁醇液蒸干。残渣用甲醇溶解并转移至 5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.精密度试验同一供试品溶液，照质量标准方法，连续进样6次，测定峰面积， 测得峰面积积分值，结果见表1。

表1精密度试验结果

4.重现性试验取同一批样品依法独立测定6次，计算含量。见表2。

表2重现性试验结果

结果表明，本法重现性良好，精密度较高。

5.样品测定结果

依法测定3批样品，结果见表3。

表3本发明注射液含量测定结果

实验例2黄芪含量测定实验

仪器：日本岛津2010C型高效液相谱仪，美国奥泰2000ES型蒸发光散射检测器； 浙江大学N-2000谱工作站。

谱条件：谱柱：Vp-ODS柱(4.60×250mm，5μm)，柱温35℃；流动相：乙腈- 水(32∶68)，流速：1.0ml/min，蒸发光散射检测器。在此谱条件下，供试品谱中，在 与对照品谱相同的保留时间处有谱峰(保留时间35分钟)，与其它组分能达到基线 分离，R＞1.5。

试药：本发明注射液(规格10ml/支)长白山制药股份有限公司提供。黄芪甲苷对照 品，供含量测定用，批号110781-200512，中国药品生物制品检定所提供。乙腈，谱纯， 美国Fisher；其它试剂均为分析纯。

1、线性关系的考察：精密称取黄芪甲苷对照品，依法测定，结果见表4。以黄芪甲 苷进样量的对数值为横坐标，谱峰峰面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。结果表 明，黄芪甲苷在0.97～4.85μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为 Y＝5.3465+1.7266X，相关系数r＝0.99989。

表4线性关系考察结果

2、精密度的测定：取本发明药物组合制剂，按含量测定项下方法制备供试品溶液， 精密吸取20μl，重复测定5次，测定黄芪甲苷的峰面积值，结果见表5。

表5精密度试验结果

3、样品含量测定及含量限度的确定按[含量测定]项下方法操作，制备供试品溶液。 照高效液相谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定四批本发明药物组合制剂 中黄芪甲苷的含量，结果见表6。

表6样品的含量测定结果

根据上述测定结果，四批样品平均含量为0.676mg/支，考虑黄芪产地、加工及生产 等因素的影响，为有效保证制剂质量，限定本品每1ml含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计， 不得少于0.04mg。

实验例3本发明药物组合物制剂成品指纹图谱研究

1、供试品的制备

本发明药物组合物制剂成品冰箱中4℃保存，批号分别为060709、060710、060711、 060712、060713、060714、060715、060716、060717、060718。 成品直接作为供试品。

2、参照物的选择和制备

成品主要考察其批间一致性，以及与中间体的相关性。参考中间体指纹图谱的建立， 选择人参皂苷Rg1为参考峰，结果证明此方法准确可行。

3、检测方法

3.1、仪器与试剂

仪器：Angilent高效液相谱仪(Angilent 1100系列，带VWD检测器和谱工作 站)；天津特纳谱柱谱柱：Kromasil C18 100A 5μm(4.6mm×250mm)；试药：甲醇 (谱纯，天津康科德科技有限公司)、乙腈(谱纯，美国Honeywell B&J公司)、人 参皂苷Rg1对照品(中国药品生物制品检定所，批号为：110703-200424)。

3.2谱条件及系统适用性试验

在确定人参谱条件时已经证明，其条件完全适用于康艾成品指纹图谱的建立。用 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用二元梯度洗脱，流动相A为水，B为80％乙腈溶液， 梯度洗脱程序如下：25％B(0～5min)，25％～39％B(5～20min)，39％～49％B(20～35min)， 49％～85％B(35～55min)，85％B(55～65min)，85％～25％B(65～72min)；检测波长203nm； 柱温35℃；流速1ml/min。

3.3专属性试验

按照处方量比例取苦参素制成水针，在上述谱条件下注入液相谱仪，结果苦参素的 吸收峰不干扰指纹图谱的测定。

3.4精密度试验

以批号为060716的成品为供试品，连续进样6次，记录各共有谱峰保留时间和积 分面积。结果表明：仪器等整个检测系统的精密度良好。数据见表7、8：

表7精密度试验结果(相对保留时间)

表8精密度试验结果(峰面积比值)

3.5稳定性试验

取批号为060716的成品为供试品，1d内于不同时间取样5次，依法测定。结果表明： 低温保存下的成品稳定性较好，常温下1d之内也能保持较好的稳定性。数据见表9、10。

表9稳定性试验结果(相对保留时间)

表10稳定性试验结果(峰面积比值)

从试验结果可知，非共有峰占总峰面积比＜5％，符合要求。

实验例4本发明药物组合物制剂中间体指纹图谱研究

1供试品的制备

本发明药物组合物制剂中间体冰箱中4℃保存，编号分别为1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10。样品用水稀释5倍后过0.45μm水系滤膜后注入高效液相谱仪中进行分析。

2参照物的制备

制备方法与人参药材的参照物溶液制备方法相同。

3检测方法

3.1仪器与试剂

仪器：Angilent高效液相谱仪(Agilent1100系列，带VWD检测器和谱工作站)； 天津特纳谱柱：Kromasil 100A C18 5μm(4.6mm×250mm)；试药：甲醇(谱纯，天 津康科德科技有限公司)、乙腈(谱纯，美国Honeywell B&J公司)、人参皂苷Rg1对照 品(中国药品生物制品检定所，批号为：110703-200424)。

3.2谱条件及系统适用性试验

采用测定人参药材指纹图谱的谱条件，其条件完全适用于本发明注射液中间体指 纹图谱的建立。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用二元梯度洗脱，流动相A为水， B为80％乙腈溶液，梯度洗脱程序如下：25％B(0～5min)，25％～39％B(5～20min)，39％～ 49％B(20～35min)，49％～85％B(35～55min)，85％B(55～65min)，85％～25％B(65～72min)； 检测波长203nm；柱温35℃；流速1ml/min。

3.3精密度试验

取编号为3的供试品溶液，连续进样6次，记录各共有峰保留时间和积分面积。以 人参皂苷Rg1的峰为参照峰，换算出各共有峰的相对保留时间和峰面积比值。数据见表11、 12。

表11精密度试验结果(相对保留时间)

表12精密度实验结果(峰面积比值)

结果表明：仪器等整个检测系统的精密度良好。

3.4稳定性试验

取编号为3的供试品溶液，1d内于不同时间取样5次，依法测定。数据见表13、14。

表13稳定性试验结果(相对保留时间)

表14稳定性试验结果(峰面积比值)

结果表明：低温保存下的本发明药物组合物制剂中间体的制备样品稳定性较好，常 温下1d之内也能保持较好的稳定性。

实验例5人参药材指纹图谱研究实验

1.来源

人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。药材共十批，产地均为 吉林省蛟河市，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

2、供试品的制备

人参的主要活性成分为人参皂苷，易溶于水、甲醇、乙醇，参考文献，取人参粗粉， 加10倍量75％乙醇，回流提取4次，每次30min。HPLC分析结果证明，该提取方法简便 且重现性好，与中间体及成品指纹图谱间的相关性良好。

3.参照物的制备

人参药材经上述方法提取后，经HPLC分析出现多个谱峰，人参皂苷Rg1为主要成 分之一，其积分面积在指纹图谱中所占的比例较大且相对稳定，因此选定人参皂苷Rg1作 为参照物。其制备方法为将人参皂苷Rg1溶解于甲醇溶液进行分析，结果证明该制备方法 可行。

4.检测方法

4.1仪器与试剂

仪器：Angilent高效液相谱仪(Angilent 1100系列，带VWD检测器和谱工作 站)；天津特纳谱柱：Kromasil 100A C18 5μm(4.6mm×250mm)；试药：甲醇(谱 纯，天津康科德科技有限公司)、乙腈(谱纯，美国Honeywell B&J公司)、人参皂苷 Rg1对照品(中国药品生物制品检定所，批号为：110703-200424)。

4.2精密度试验

取编号为4的药材的制备样品为供试品，连续进样6次，记录各共有谱峰保留时 间和峰面积，见表15、16。

表15精密度试验结果(相对保留时间)

表16精密度试验结果(峰面积比值)

4.3稳定性试验

取编号为4的药材的制备样品为供试品，1d内于不同时间取样5次，依法测定，见 表17。

表17稳定性试验结果(相对保留时间)

实验结果表明，该质量控制方法的精密度和稳定性较好。

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

附图说明

图1：本发明药物组合物制剂成品指纹对照图谱；

图2：本发明药物组合物制剂中间体指纹对照图谱；

图3：人参药材指纹对照图谱；

图4：黄芪药材指纹对照图谱。

具体实施方式

实施例1：本发明注射液的制备

称取黄芪250g、人参120g、苦参素8g三味原料药，人参用75％的乙醇，回流提取3 次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为 65℃，备用；黄芪加水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为 1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧 化钠调PH值至6～7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～ 1.15的清膏，测定温度为65℃；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调PH值至6～7， 静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400ml，用氢氧化钠调PH值至6～ 7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤。用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀， 煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌 30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，加注射用水至1000ml，滤过，灌装，即得。

实施例2：本发明注射液中间体的制备

称取黄芪350重量份、人参70重量份、苦参素12重量份三味原料药，人参用75％ 的乙醇，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20 的清膏，测定温度为65℃，备用；黄芪加水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液， 减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，与人参清膏合并，加乙醇 使含醇量达75％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减 压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏，测定温度为65℃；再加乙醇使含醇量达85％， 用氢氧化钠调PH值至6～7，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400 体积份(按ml/g的比例)，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤。 用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另 取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的 药液合并，混匀，得中间体。

实施例3：本发明药物组合物制剂质量控制方法

鉴别：

取本发明药物组合物制剂20体积份，于水浴上蒸干，残渣加甲醇5体积份使溶解， 作为供试品溶液；另取人参对照药材1重量份，加40体积份，加热回流1小时， 弃去液，药渣挥干溶剂，加水0.5体积份搅拌湿润，加水饱和正丁醇10体积份， 超声处理30分钟，吸取上清液加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上清液蒸干，残渣 加甲醇1体积份使溶解，作为对照药材溶液；再取人参皂苷Re、Rg1对照品，分别加甲醇 制成每1体积份含0.002重量份的对照品溶液；照薄层谱法(中国药典2005年版一部 附录VIB)试验，吸取上述四种溶液各0.0018体积份，分别点于厚500μm同一硅胶G 薄层板上，以-乙酸乙酯-甲醇-水＝15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下层溶液为 展开剂，展开，取出，凉干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显清晰，分别 置日光下检视；供试品谱中，在与对照药材和对照品谱相应位置上，显相同颜的斑点；

含量测定：

A：人参照高效液相谱法(《中国药典2005年版一部》附录VID)测定；谱条件 与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水＝19∶81为流动相； 检测波长为203nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备： 精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1体积份各含0.00025 重量份的混合溶液，摇匀，即得；供试品溶液的制备：量取装量差异项下的本发明药物组 合物制剂25体积份，置分液漏斗中，用提取2次，每次20体积份，弃去三氯甲 烷液，水液用水饱和正丁醇提取5次，每次20体积份，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液 洗涤3次，每次30体积份，弃去碱液，再用正丁醇饱和的水轻轻摇洗3次，每次30体 积份，弃去水液，取正丁醇液蒸干；残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻 度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各0.01 体积份，注入液相谱仪，测定，即得；本发明药物组合物制剂按日服用剂量计含人参 皂苷Rg1(C42H72O14)和人参皂苷Re(C48H82O18)的总量不得少于0.00004重量份；

B：苦参素照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定；谱条件 与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；1％磷酸溶液-乙腈＝93∶7为流动 相，其中磷酸溶液用三乙胺调节PH值为2.5，检测波长为220nm；理论板数按氧化苦参 碱峰计算应不低于2000，氧化苦参碱峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求； 对照品溶液的制备：称取氧化苦参碱对照品适量，加流动相制成每1体积份中含0.00025 重量份的溶液，即得；供试品溶液制备：量取本发明药物组合物制剂按日服用剂量计2.5 体积份，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得；测定法：量取对照品溶液 及供试品溶液各0.020体积份，分别注入液相谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积 计算；本发明药物组合物制剂按日服用剂量计含苦参素以氧化苦参碱(C15H24N2O2)计，应 为0.009重量份～0.011重量份；

C：黄芪照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定；谱条件与 系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水＝32∶68为流动相；蒸发 光散射检测器；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；对照品溶液的制备：称取黄芪 甲苷对照品适量，加甲醇制成每1体积份含0.0002重量份的溶液，即得；供试品溶液的 制备：取本发明药物组合物制剂100体积份，混匀，精密量取10体积份，于水浴上蒸干， 残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法吸取对照 品溶液0.01体积份、0.02体积份及供试品溶液0.02体积份，注入液相谱仪，测定， 即得；本发明药物组合物制剂按日服用剂量计黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于 0.00004重量份。

指纹图谱检测：

A：本发明药物组合物制剂成品指纹图谱检测方法包括如下步骤：

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VID)：

谱条件及系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A， 以80％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检测波长203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密 称取人参皂苷Rg1对照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释 至刻度，即得；供试品溶液的制备：取本发明药物组合物制剂作为供试品溶液；测定法： 取参照物溶液和供试品溶液各0.02体积份，注入高效液相谱仪，记录65min谱；供 试品指纹图谱中与参照物人参皂苷Rg1相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间； 供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图1)有良好的相似性； 指纹图谱应有12个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.830、S峰为1.000、2 号峰为1.100、3号峰为1.221、4号峰为1.294、5号峰为1.630、6号峰为1.738、7号 峰为1.811、8号峰为1.848、9号峰为1.887、10号峰为2.015、11号峰为2.808； 各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.105、S峰为1.000、2号峰为0.296、3 号峰为2.244、4号峰为0.495、5号峰为0.131、6号峰为0.052、7号峰为0.031、8号 峰为0.050、9号峰为0.055、10号峰为0.044、11号峰为0.019； 非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

B：本发明药物组合物制剂中间体指纹图谱检测方法包括如下步骤：

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VD)，结合指纹图谱的 要求进行测定；谱条件及系统适用性试验：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A、80％乙腈溶液为流动相B进行 梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～ 49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检测波长203nm； 柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1对照品0.003 重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得；供试品溶液的制 备：取2体积份中间体，用水稀释至10体积份，作为供试品溶液；HPLC分析前用0.45μm 水系滤膜过滤；测定法：取参照物溶液和供试品溶液各0.02体积份，注入高效液相谱 仪，记录65min谱，以人参皂苷Rg1峰为参考峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间； 供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图2)有良好的相似性；

指纹图谱应有19个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.827、S峰为1.000、2 号峰为1.100、3号峰为1.222、4号峰为1.296、5号峰为1.636、6号峰为1.744、7号 峰为1.817、8号峰为1.855、9号峰为1.895、10号峰为2.024、11号峰为2.137、12 号峰为2.375、13号峰为2.694、14号峰为2.837、15号峰为2.987、16号峰为3.382、 17号峰为3.542、18号峰为3.643；

各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.129、S峰为1.000、2号峰为0.209、 3号峰为1.636、4号峰为0.542、5号峰为0.183、6号峰为0.158、7号峰为0.133、8 号峰为0.099、9号峰为0.102、10号峰为0.050、11号峰为0.171、12号峰为0.185、 13号峰为0.070、14号峰为0.059、15号峰为0.050、16号峰为0.060、17号峰为0.143、 18号峰为0.063；

非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

C：人参药材指纹图谱检测标准：

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录V D)；谱条件及系统 适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以80％乙腈溶液为流 动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～ 35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检 测波长203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密称取人参皂苷 Rg1对照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得； 供试品溶液的制备：药材经粉碎后过3号筛，取各批药材粉末5重量份，精密称定，置于 250ml圆底烧瓶中，加50体积份75％乙醇，加热回流30min，离心，取提取液，如此4 次，合并提取液，旋蒸至干，用50体积份40％甲醇溶液溶解，离心，精密量取上清液2 体积份，用40％甲醇溶液稀释至10体积份，作为供试品溶液；HPLC分析前用0.45μm的 有机系滤膜过滤；测定法：取参照物溶液和供试品溶液各0.002体积份，注入高效液相 谱仪，记录65min谱；供试品指纹图谱中与参照物相应的峰为S峰，计算各共有峰 相对保留时间；供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图3)有良好的相 似性；

指纹图谱应有15个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.731、2号峰为0.824、S 峰为1.000、3号峰为1.649、4号峰为1.699、5号峰为1.739、6号峰为1.828、7号峰 为1.870、8号峰为1.925、9号峰为1.951、10号峰为2.000、11号峰为2.151、12号 峰为3.031、13号峰为3.605、14号峰为3.875；

各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.048、2号峰为0.108、S峰为1.000、 3号峰为0.213、4号峰为0.078、5号峰为0.621、6号峰为0.409、7号峰为0.046、8 号峰为0.243、9号峰为0.039、10号峰为0.027、11号峰为0.157、12号峰为0.027、 13号峰为0.099、14号峰为0.257；

非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

D：黄芪药材指纹图谱检测标准：

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VD)；谱条件及系统适用 性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以80％乙腈溶液为流动相 B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检测波长 203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；内标物溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1对照 品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得；供试品 溶液的制备：黄芪切片经粉碎后过3号筛，取黄芪粉末5重量份，加水50体积份，回流 提取3小时，离心，取提取液，如此2次，合并提取液，浓缩至30体积份，加乙醇至含 醇量为75％，4℃放置过夜，离心，上清液用75％乙醇定容至250体积份，取5体积份， 加入0.5体积份内标物溶液，作为供试品溶液；HPLC分析前用0.45μm有机系滤膜过滤； 测定法：取内标物溶液和供试品溶液各0.02体积份，注入高效液相谱仪，记录65min 谱，分别以内标物人参皂苷Rg1峰(S1)和相对S1峰保留时间约为1.25的谱峰为 参考峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间；供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照 指纹图谱(附图4)有良好的相似性；

指纹图谱应有12个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间(1)按分钟计分别为：S1号峰为1.000、1号峰为1.063、 S峰为1.226、2号峰为1.344、3号峰为1.777、4号峰为2.157、5号峰为2.247、6号 峰为2.292、7号峰为2.382、8号峰为3.085、9号峰为3.540、10号峰为3.603； 各序号特征峰的相对保留时间(2)按分钟计分别为：S1号峰为0.816、1号峰为0.867、 S峰为1.000、2号峰为1.096、3号峰为1.449、4号峰为1.760、5号峰为1.833、6号 峰为1.870、7号峰为1.943、8号峰为2.516、9号峰为2.888、10号峰为2.939； 各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.385、S峰为1.000、2号峰为1.975、3 号峰为0.090、4号峰为0.402、5号峰为0.049、6号峰为0.693、7号峰为1.064、8号 峰为0.155、9号峰为0.043、10号峰为0.054；

非共有峰面积不得过总峰面积的10％。

实施例4：本发明药物组合物制剂成品的指纹图谱检测标准

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VID)：

谱条件及系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以80％ 乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～ 39％B，20～35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～ 25％B；检测波长203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密称取人 参皂苷Rg1对照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度， 即得；供试品溶液的制备：取本发明药物组合物制剂作为供试品溶液；测定法：取参照物 溶液和供试品溶液各0.02体积份，注入高效液相谱仪，记录65min谱；供试品指纹 图谱中与参照物人参皂苷Rg1相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间；供试品指 纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图1)有良好的相似性；

指纹图谱应有12个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.830、S峰为1.000、2 号峰为1.100、3号峰为1.221、4号峰为1.294、5号峰为1.630、6号峰为1.738、7号 峰为1.811、8号峰为1.848、9号峰为1.887、10号峰为2.015、11号峰为2.808； 各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.105、S峰为1.000、2号峰为0.296、3 号峰为2.244、4号峰为0.495、5号峰为0.131、6号峰为0.052、7号峰为0.031、8号 峰为0.050、9号峰为0.055、10号峰为0.044、11号峰为0.019；

非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

实施例5：本发明药物组合物制剂中间体指纹图谱检测标准

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VD)，结合指纹图谱的 要求进行测定；谱条件及系统适用性试验：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A、80％乙腈溶液为流动相B进行 梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～35min 39％～ 49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检测波长203nm； 柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1对照品0.003 重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得；供试品溶液的制 备：取2体积份中间体，用水稀释至10体积份，作为供试品溶液；HPLC分析前用0.45μm 水系滤膜过滤；测定法：取参照物溶液和供试品溶液各0.02体积份，注入高效液相谱 仪，记录65min谱，以人参皂苷Rg1峰为参考峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间； 供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图2)有良好的相似性；

指纹图谱应有19个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.827、S峰为1.000、2 号峰为1.100、3号峰为1.222、4号峰为1.296、5号峰为1.636、6号峰为1.744、7号 峰为1.817、8号峰为1.855、9号峰为1.895、10号峰为2.024、11号峰为2.137、12 号峰为2.375、13号峰为2.694、14号峰为2.837、15号峰为2.987、16号峰为3.382、 17号峰为3.542、18号峰为3.643；

各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.129、S峰为1.000、2号峰为0.209、3 号峰为1.636、4号峰为0.542、5号峰为0.183、6号峰为0.158、7号峰为0.133、8号 峰为0.099、9号峰为0.102、10号峰为0.050、11号峰为0.171、12号峰为0.185、13 号峰为0.070、14号峰为0.059、15号峰为0.050、16号峰为0.060、17号峰为0.143、 18号峰为0.063；

非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

实施例6：人参药材指纹图谱检测标准

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VD)；谱条件及系统 适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以80％乙腈溶液为流 动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～ 35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检 测波长203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；参照物溶液的制备：精密称取人参皂苷 Rg1对照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得； 供试品溶液的制备：药材经粉碎后过3号筛，取各批药材粉末5重量份，精密称定，置于 250ml圆底烧瓶中，加50体积份75％乙醇，加热回流30min，离心，取提取液，如此4 次，合并提取液，旋蒸至干，用50体积份40％甲醇溶液溶解，离心，精密量取上清液2 体积份，用40％甲醇溶液稀释至10体积份，作为供试品溶液；HPLC分析前用0.45μm的 有机系滤膜过滤；测定法：取参照物溶液和供试品溶液各0.002体积份，注入高效液相 谱仪，记录65min谱；供试品指纹图谱中与参照物相应的峰为S峰，计算各共有峰 相对保留时间；供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(附图3)有良好的相 似性；

指纹图谱应有15个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.731、2号峰为0.824、S 峰为1.000、3号峰为1.649、4号峰为1.699、5号峰为1.739、6号峰为1.828、7号峰 为1.870、8号峰为1.925、9号峰为1.951、10号峰为2.000、11号峰为2.151、12号 峰为3.031、13号峰为3.605、14号峰为3.875；

各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.048、2号峰为0.108、S峰为1.000、3 号峰为0.213、4号峰为0.078、5号峰为0.621、6号峰为0.409、7号峰为0.046、8号 峰为0.243、9号峰为0.039、10号峰为0.027、11号峰为0.157、12号峰为0.027、13 号峰为0.099、14号峰为0.257；

非共有峰面积不得过总峰面积的5％。

实施例7：黄芪药材指纹图谱检测标准

指纹图谱：照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VD)；谱条件及系统 适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以80％乙腈溶液为流 动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min 25％B，5～20min 25％～39％B，20～ 35min 39％～49％B，35～55min 49％～85％B，55～65min 85％B，65～72min 85％～25％B；检 测波长203nm；柱温35℃；流速1体积份/min；内标物溶液的制备：精密称取人参皂苷 Rg1对照品0.003重量份，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得； 供试品溶液的制备：黄芪切片经粉碎后过3号筛，取黄芪粉末5重量份，加水50体积份， 回流提取3小时，离心，取提取液，如此2次，合并提取液，浓缩至30体积份，加乙醇 至含醇量为75％，4℃放置过夜，离心，上清液用75％乙醇定容至250体积份，取5体积 份，加入0.5体积份内标物溶液，作为供试品溶液；HPLC分析前用0.45μm有机系滤膜 过滤；测定法：取内标物溶液和供试品溶液各0.02体积份，注入高效液相谱仪，记录 65min谱，分别以内标物人参皂苷Rg1峰(S1)和相对S1峰保留时间约为1.25的谱 峰为参考峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间；供试品指纹图谱应与质量标准所附的 对照指纹图谱(附图4)有良好的相似性；

指纹图谱应有12个共有峰；

各序号特征峰的相对保留时间(1)按分钟计分别为：S1号峰为1.000、1号峰为1.063、 S峰为1.226、2号峰为1.344、3号峰为1.777、4号峰为2.157、5号峰为2.247、6号 峰为2.292、7号峰为2.382、8号峰为3.085、9号峰为3.540、10号峰为3.603； 各序号特征峰的相对保留时间(2)按分钟计分别为：S1号峰为0.816、1号峰为0.867、 S峰为1.000、2号峰为1.096、3号峰为1.449、4号峰为1.760、5号峰为1.833、6号 峰为1.870、7号峰为1.943、8号峰为2.516、9号峰为2.888、10号峰为2.939； 各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.385、S峰为1.000、2号峰为1.975、3 号峰为0.090、4号峰为0.402、5号峰为0.049、6号峰为0.693、7号峰为1.064、8号 峰为0.155、9号峰为0.043、10号峰为0.054；

非共有峰面积不得过总峰面积的10％。